Name: 采取下一步:神经整形正交后肢移植模型，以最大限度地提高大鼠的功能恢复 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 18 s
Description: 学习大鼠神经整形正交后肢移植模型，通过显微外科技术重新连接骨骼、血管、神经和肌肉系统，以研究免疫反应并最大限度提高功能恢复效果。

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本工作由弗兰克尔基金会和西北纪念医院麦考密克资助（Operation RESTORE）资助。本出版物所报告的研究由美国国立卫生研究院下属国立普通医学科学研究所通过奖项支持。&#160;编号 T32GM008152。本研究得到西北大学显微外科核心实验室和行为表型核心实验室的支持。

所有实验均依照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》进行，并已获得西北大学动物护理与使用委员会的批准。具体操作依据方案编号 IS00001663 执行。
注意：使用了两种大鼠品系，分别为Lewis大鼠和August Copenhagen x Irish（ACI）大鼠。动物被分为三组处理组：未进行免疫抑制的同种异体移植组（ACI至Lewis）、采用常规免疫抑制的同种异体移植组（ACI至Lewis）以及同系移植组（Lewis至Lewis或ACI至ACI）。Lewis为近交品系，而ACI大鼠代表远交野生型，因此选择该组合以模拟最严重的排斥反应情况。常规免疫抑制治疗通过皮下给药，方案为：雷帕霉素1 mg/kg，从术后第-1天（POD -1）至术后第28天（POD 28）；或他克莫司（FK506）3 mg/kg，从术后第0天（POD 0）至术后第14天（POD 14），之后每周一次。雄性和雌性大鼠均可作为受体，年龄为8至16周，在手术时体重介于250至400克之间。
1. 供体右后肢的采集
<ol>
	<li>通过配备适当废气清除系统的蒸发器，使用5%异氟烷在纯氧中诱导全身麻醉。</li>
	<li>通过夹捏足趾确认麻醉深度充分，然后使用毛发剪刀修剪右侧后肢及右侧腹股沟手术区域的毛发。</li>
	<li>通过啮齿类动物鼻罩将异氟烷浓度下调至2–2.5%。</li>
	<li>将大鼠仰卧位固定于带有加热垫的手术板上，四肢外展并用胶带固定于两侧。用70%医用酒精对无毛皮肤进行消毒，并用无菌纱布保护手术区域。</li>
	<li>在配备合适的显微外科手术显微镜、显微外科器械，并可方便使用双极和单极电凝设备的条件下，开始解剖操作。</li>
	<li>使用剪刀在右侧后肢周围做环形皮肤/皮下组织切口。切口起始于腹股沟皱襞内侧，大致与腹股沟韧带水平一致，向背外侧延伸完成环形切口。</li>
	<li>暴露切口下方的肌层后，分离并电凝从肌层通向近端皮肤/皮下瓣的浅表腹壁上血管。</li>
	<li>将近端皮瓣向上内侧翻转至腹股沟韧带，远端皮肤/皮下瓣向下外侧翻转至膝关节。</li>
	<li>使用金属牵开器或卷起的纱布帮助暴露术区。</li>
	<li>注意大鼠腹股沟解剖结构与人类相似；由外侧至内侧依次为神经、动脉和静脉。</li>
	<li>游离股神经，并尽可能在腹股沟韧带处、分叉近端锐性切断。将切断的神经向下牵拉，安全地移出术区，并覆盖于湿润纱布下保护。</li>
	<li>转向股动脉和股静脉，使用4 cm长的7-0丝线以无创方式牵引血管，避免直接操作。</li>
	<li>使用7-0丝线结扎股动静脉发出的所有分支，并在结扎线之间切断分支。对于非常细小的分支，可使用双极电凝代替结扎。 
	注：需要切断的动脉和静脉分支包括浅表旋髂腹壁血管和肌支血管。其中浅表旋髂腹壁血管通常最粗大，走行深部，类似人类的股深动脉，但大鼠缺乏股深动脉15。股血管更远端的分支，如最高膝动脉和隐神经分支，通常无需切断。</li>
	<li>通过雄性供体大鼠的阴茎静脉系统注射500国际单位肝素。若供体为雌性大鼠，则使用浅表腹壁上静脉。</li>
	<li>注射肝素后等待2分钟使其在体内充分循环，再进行后续步骤。</li>
	<li>尽可能靠近腹股沟韧带处，使用7-0丝线结扎股动脉，并在结扎线之间切断。</li>
	<li>与动脉类似，结扎并切断股静脉。</li>
	<li>将动脉和静脉均向下牵拉，安全移出术区，与先前已覆盖的股神经一同置于湿润纱布下保护。解剖腹侧肌群，注意电凝所有可见的血管分支。此阶段充分止血可显著减少再灌注后受体的失血量。</li>
	<li>在腹侧肌群深面，辨认坐骨神经，并在其分支近端锐性切断。通常可见三个坐骨神经分支：胫神经、腓总神经和腓肠神经。供体肢体中应完整保留这三个分支。第四个皮支通常在此解剖过程中不可见15,16。</li>
	<li>在大腿中段水平，彻底切断剩余的腹侧和背侧肌群，注意精细止血。必要时可将肢体向内侧牵拉以完成肌肉的完全离断。</li>
	<li>使用手持式无线电动骨锯在股骨中段横断骨骼。</li>
	<li>将肢体移植物从供体取出后，剪除移植物侧股动脉和股静脉残端上的丝线结扎头，重新开放血管腔。</li>
	<li>将24号套管针插入移植物动脉残端，用含250国际单位肝素的5 mL冰盐水缓慢冲洗移植物，观察液体从开放的静脉端流出直至澄清。</li>
	<li>轻柔缓慢冲洗移植物约3分钟。过度强力冲洗可能损伤血管内皮。</li>
	<li>将移植物置于盛有冷盐水的容器中，再将容器置于冰桶内，直至进行移植手术。</li>
	<li>通过双侧开胸法处死供体大鼠。</li>
	<li>妥善清洁所有外科器械。</li>
</ol>
2. 受体动物原生右后肢截肢
<ol>
	<li>使用异氟烷（5%）诱导麻醉，确认麻醉深度，修剪毛发，固定动物，并按供体大鼠所述方法用酒精消毒皮肤。</li>
	<li>将异氟烷浓度下调至2–2.5%，皮下注射术前镇痛药物布托啡诺（1.2 mg/kg），以及术前预防性抗生素恩诺沙星（7.5 mg/kg）。</li>
	<li>与供体操作相同，在腹股沟皱襞处做环形切口，分离皮瓣并确保止血，游离股神经、股动脉和股静脉，并结扎与上述相同的分支血管。</li>
	<li>股神经的切断位置应比供体更偏远端，但尽可能在分叉点近端进行。</li>
	<li>充分游离股动脉和股静脉，使其在腹股沟韧带水平可分别单独夹闭；使用显微外科血管夹夹闭静脉和动脉；夹闭后，用剪刀锐性切断各血管。</li>
	<li>在大腿中段水平仔细止血后切断股前肌群和股后肌群，必要时将肢体向内侧牵开。</li>
	<li>识别坐骨神经，并在其分支点近端按上述方法予以切断。</li>
	<li>使用锯子在股骨中段横断股骨。</li>
	<li>移除受体原有的右侧后肢，并按规定妥善处理。</li>
	<li>通过鼻罩将异氟烷浓度进一步下调至1–1.5%。</li>
</ol>
3. 供体至受体肢体移植
<ol>
	<li>使用手持式电动锯，修整供体和受体股骨切割端的任何不平整处。</li>
	<li>使用锯子切下18号针头的 hub 端，该部分将作为股骨髓内钉。</li>
	<li>在操作骨骼前，于受体股骨切割端涂抹少量骨蜡，以减少扩髓过程中的骨髓出血。</li>
	<li>使用18号针头作为髓内钉，对接供体与受体股骨。需要施加一定力量，但扩髓时切勿过度，以免造成皮质骨折。</li>
	<li>根据需要，取出针头并修剪至适当长度，使两段骨骼能平滑套接于针头之上，且骨骼之间无针头外露。</li>
	<li>在供体肢体下方放置小支撑物（如纱布垫、小石块或油泥），以避免张力。</li>
	<li>使用8至10针5-0聚乳酸羟基乙酸（polyglactin）间断缝合，重新对合腹侧肌群，防止移植物围绕股骨针旋转。此举可为吻合提供肢体稳定性。</li>
	<li>定期使用冰冻生理盐水冲洗移植物及手术区域，以改善视野，并减少热缺血再灌注损伤。</li>
	<li>对齐供体与受体股动脉，采用10-0尼龙间断缝线行端对端吻合，避免张力和扭曲。动脉吻合通常需约6针。</li>
	<li>与动脉类似，采用10-0尼龙间断缝线行供体与受体股静脉端对端吻合。静脉吻合通常需6至8针。 
	注意：充分的冷盐水冲洗、无创血管操作技术，以及保留较长线尾作为牵引缝线以牵拉血管，是实现有效显微外科吻合的重要手段。</li>
	<li>在两处吻合口周围放置少量止血纤维素粉末，随后移除静脉和动脉近端的显微血管夹。</li>
	<li>检查两处吻合口是否通畅、血流良好。使用棉签轻轻探压静脉，确认两处吻合口均止血良好。对出血部位施加压力，必要时添加更多止血纤维素粉末。仅作为最后手段，可在出血孔处加缝一针，但需警惕“穿破血管后壁&#34;的风险。</li>
	<li>当确认两处吻合均满意后，将剩余的长牵引缝线剪短，使其与其他缝线长度一致。</li>
	<li>将大鼠重新置于左侧卧位，广泛使用电凝止血，彻底控制再灌注后肌肉出血。</li>
	<li>在确保肌肉止血完成后，开始处理神经吻合。修剪任何边缘不整齐的神经断端。</li>
	<li>在坐骨神经下方，使用5-0聚乳酸羟基乙酸间断缝合重新对合背侧肌群。</li>
	<li>重新对合坐骨神经。通常使用8至10针10-0尼龙神经间断缝合即可满足要求。</li>
	<li>重新对合剩余的背侧肌群，随后使用4-0聚乳酸羟基乙酸连续缝合关闭背侧皮肤。</li>
	<li>将大鼠恢复至仰卧位，重新对合股神经。通常使用2至3针10-0尼龙神经间断缝合即可满足要求。</li>
	<li>使用4-0聚乳酸羟基乙酸连续缝合关闭腹侧皮肤。避免过长的缝线尾端，以防大鼠苏醒后产生刺激不适。</li>
</ol>
4. 术后护理
<ol>
	<li>将动物放回笼中，在笼下放置加热垫，并提供充足的食物和水，术后第一周内每天监测早期并发症。</li>
	<li>术后给予皮下注射美洛昔康（1 mg/kg），每日一次，持续至术后第2天。术后使用稀释的恩诺沙星喷雾进行抗生素预防。术后7天内每日两次在移植物部位喷洒苦味安全喷雾（Bitter Safe Mist），以防止自残（自我 mutilation）行为。</li>
	<li>将移植手术后的大鼠与其他大鼠共同饲养于同一笼中，以促进其恢复日常活动，并帮助移植肢体的功能康复。</li>
</ol>
5. 术后感觉测试
<ol>
	<li>应用Hargreaves热觉测试方案，该方法在其他文献中也有描述17,18。</li>
	<li>将大鼠放入测试容器中，使其适应环境20分钟。确认装置的玻璃表面清洁，并用研究者的手指测试热源是否正常工作。</li>
	<li>测试前，确认大鼠处于清醒状态，且待测足爪位于红外运动探测器上方。</li>
	<li>以90强度发射热能，记录动物足爪离开热源的时间延迟。若20秒内未出现移动反应，则终止测试，以防止造成损伤。</li>
	<li>每只待测肢体进行五次试验，计算每只动物的平均缩足潜伏期时，需剔除最大值和最小值。</li>
</ol>
6. 术后运动功能测试
<ol>
	<li>使用步态分析跑台及集成的软件分析平台，在术后四周至六周时筛选适合进行跑台测试的候选动物。</li>
	<li>在测试前一至两天修剪所有大鼠的脚趾甲。</li>
	<li>测试前将动物在测试房间内适应环境一小时，并在测试前进行一分钟的抚摸，以缓解其焦虑情绪。</li>
	<li>将大鼠放入跑台中，以逐步递增的速度进行测试，速度依次为 10 cm/s、14 cm/s，直至目标速度 18 cm/s。若大鼠表现出抗拒且无法通过诱导使其行走，则终止当天的测试，以避免产生负面条件反射。对于表现良好的个体，可允许其行走至最高 24 cm/s。</li>
	<li>每只动物测试结束后，使用 70% 乙醇清洗跑台装置。</li>
	<li>步态参数由分析平台的专有软件输出。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

肢体移植属于血管化复合组织异体移植（VCA）的范畴，具有广泛的应用治疗前景，但目前尚未实现。主要障碍在于VCA特有的尚未解决的免疫学问题以及当前使用的神经运动功能恢复技术。新技术的开发将依赖于灵活、可靠且可重复的动物模型。
在VCA领域已建立了多种动物模型，每种模型均有其特定优势4。非人灵长类动物模型对人类患者具有良好的可转化性，但受限于高昂的成本以及所需免疫抑制剂量达到毒性水平等问题4。犬类模型因其肌肉结构与人类具有特定相似性，且免疫系统更为成熟，被认为具有优势19,20。猪模型作为大型动物模型，其免疫系统研究日益深入，具有显著优势21,22。小鼠模型系统为免疫学研究提供了最先进的技术手段，但尽管套管式血管显微外科吻合技术已取得重要进展<sup clas...

在血管化复合组织异体移植（VCA）或复合组织异体移植（CTA）这一更广泛的范畴内，肢体移植尚未实现其治疗潜力。自1998年和1999年法国里昂及美国肯塔基州路易维尔成功完成首例人类手部移植以来，全球已在经过严格筛选的患者中实施了100多例上肢移植手术1。然而，由于需要强效免疫抑制以及神经运动功能恢复有限，该技术的广泛应用受到阻碍。目前的免疫抑制策略导致急性排斥反应发生率为85%，同时机会性感染的发生率高达77%2。另一方面，手部移植后的功能确实有所恢复；患者上肢功能障碍评分（DASH）平均从71分改善至43分，但此功能水平仍可能被认定为残疾2。鉴于肢体移植并不涉及挽救生命，当前技术必须通过动物模型进一步优化，以推动VCA领域迈向下一阶段。
自1978年首个大鼠肢体移植模型建立以来3，为推动血管化复合组织异体移植（VCA）领域的发展，已开发出多种创新的动物模型4，其中包括采用带套管的血管吻合技术以缩短手术时间5,6，异位骨肌皮移植以减少对受体动物的生理干扰7,8,9,10,11，以及新型免疫学策略7,12,13,14。本文所介绍的大鼠同位右侧后肢股中段移植模型，强调采用精细且经过长期验证的显微外科技术，如手工缝合血管吻合和神经对接，作为构建稳定、可重复模型平台的前期投入，以同时研究当前VCA面临的两大关键限制因素：免疫抑制策略与神经运动功能恢复。

<table><tbody><tr><td>麻醉机</td><td>Vet Equip</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>0.5 cc 注射器</td><td>Exel</td><td>26018</td><td></td></tr><tr><td>18 号针头</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>1 cc 注射器</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>22 号针头</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>24 号套管针</td><td>Sur-Vet</td><td>SROX2419V</td><td></td></tr><tr><td>25 号针头</td><td>Exel</td><td>26403</td><td></td></tr><tr><td>3 cc 注射器</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>5 cc 注射器</td><td>Exel</td><td>26230</td><td></td></tr><tr><td>酒精</td><td>Fisher Scientific</td><td>HC-600-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>麻醉诱导舱</td><td>Vet Equip</td><td>941443</td><td></td></tr><tr><td>麻醉气体清除系统</td><td>Vet Equip</td><td>931401</td><td></td></tr><tr><td>双极电凝器</td><td>Aura</td><td>26-500</td><td></td></tr><tr><td>苦味喷雾剂</td><td>Henry Schein</td><td>5553</td><td></td></tr><tr><td>骨蜡</td><td>CP Medical</td><td>CPB31A</td><td></td></tr><tr><td>呼吸回路</td><td>Vet Equip</td><td>921413</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺</td><td>Reckitt Benckiser</td><td>12496075705</td><td></td></tr><tr><td>Castro-Viejos 持针器</td><td>Roboz</td><td>RS-6416</td><td></td></tr><tr><td>无线电动锯</td><td>Dremel</td><td>8050-N/18</td><td></td></tr><tr><td>棉签棒</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td>用于止血</td></tr><tr><td>DigiGait 装置及软件</td><td>Mouse Specifics</td><td>MSI-DIG, DIG-SOFT</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 镊子（#4）</td><td>Roboz</td><td>RS-4972</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 镊子（#5）</td><td>Roboz</td><td>RS-5035</td><td></td></tr><tr><td>恩诺沙星</td><td>Norbrook</td><td>ANADA 200-495</td><td></td></tr><tr><td>FK-506</td><td>Astellas</td><td>301601</td><td></td></tr><tr><td>纱布</td><td>Kendall</td><td>1903</td><td></td></tr><tr><td>纱布</td><td>Covidien</td><td>8044</td><td></td></tr><tr><td>手套</td><td>Microflex</td><td>DGP-350-M</td><td></td></tr><tr><td>电动毛发剪</td><td>Oster</td><td>078005-010-003</td><td></td></tr><tr><td>手持单极电凝器</td><td>Bovie</td><td>AA00</td><td></td></tr><tr><td>Hargreaves 装置</td><td>Ugo Basile S.R.L. Gemonio, Italy</td><td>37370</td><td></td></tr><tr><td>加热垫</td><td>Walgreens</td><td>126987</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Fresenius Kabi</td><td>42592K</td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>Corning</td><td>PC-351</td><td>用于加温复苏液体</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Henry Schein</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>乳酸林格氏液</td><td>Baxter</td><td>2B2074</td><td></td></tr><tr><td>大型培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>用于冷盐水中保存供体移植物</td></tr><tr><td>美洛昔康</td><td>Henry Schein</td><td>49755</td><td></td></tr><tr><td>微型 Collin Hartmann 拉钩</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>微型解剖剪</td><td>Roboz</td><td>RS-5841</td><td></td></tr><tr><td>微纤维胶原粉</td><td>BD</td><td>1010590</td><td>用于止血</td></tr><tr><td>微血管夹</td><td>Roboz</td><td>RS-5420</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水</td><td>Baxter</td><td>2F7124</td><td></td></tr><tr><td>眼科润滑剂</td><td>Dechra</td><td>IS4398</td><td></td></tr><tr><td>雷帕霉素</td><td>MedChem Express</td><td>HY-10219</td><td></td></tr><tr><td>小型培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td>用于加温复苏液体</td></tr><tr><td>无菌手术巾</td><td>ProAdvantage</td><td>N207100</td><td></td></tr><tr><td>手术服</td><td>Cardinal Health</td><td>9511</td><td></td></tr><tr><td>外科口罩</td><td>3M</td><td>1805</td><td></td></tr><tr><td>手术显微镜，光学型号 OPMIMD</td><td>Zeiss</td><td>169756</td><td></td></tr><tr><td>手术显微镜，Universal S3</td><td>Zeiss</td><td>243188</td><td></td></tr><tr><td>10-0 尼龙缝线</td><td>Covidien</td><td>N2512</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Vicryl 缝线</td><td>Ethicon</td><td>J213H</td><td></td></tr><tr><td>7-0 丝线结扎线</td><td>Teleflex</td><td>103-S</td><td></td></tr><tr><td>胶带</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>超声波仪器清洗器</td><td>Roboz</td><td>RS-9911</td><td></td></tr><tr><td>血管扩张镊</td><td>Roboz</td><td>RS-5047</td><td></td></tr></tbody></table>

迈向下一步：一种最大化大鼠功能恢复的神经吻合正位后肢移植模型

Taking the Next Step: a Neural Coaptation Orthotopic Hind Limb Transplant Model to Maximize Functional Recovery in Rat

尤其是肢体移植，以及广义上的血管化复合组织异体移植（VCA），具有广阔的治疗前景，但目前在免疫抑制和神经运动功能恢复方面的局限性限制了其发展。尽管已开发出多种动物模型用于研究VCA的独特特征，但本文介绍了一种稳定且可重复的大鼠原位后肢移植模型，旨在同时探讨当前VCA面临的两大挑战：免疫抑制策略与神经运动功能恢复。该模型的核心在于坚持采用经过长期验证的精细显微外科技术，包括手工缝合的血管吻合以及股神经和坐骨神经的手工缝合神经对接。该方法可实现持久的肢体重建，使动物术后存活时间更长，能够接受康复训练、恢复日常活动并进行功能评估。通过短期使用常规免疫抑制剂治疗，异基因移植动物术后存活可达70天，而同基因移植动物作为对照组，术后存活时间可超过200天。术后30天即可观察到神经功能恢复的证据。该模型不仅为深入探究VCA特有的免疫学问题及神经再生机制提供了有力平台，同时也支持针对VCA特异性设计的新治疗策略进行体内验证。

存活与恢复依赖于精细的手术技术。关注血管吻合、神经吻合以及上述的骨骼对接，对于最大限度提高该模型的成功率至关重要。手术设计及典型的吻合结果见图1。
总体死亡率取决于免疫抑制策略，大多数同系移植动物达到了术后100-200天的研究终点，如图2所示。一旦度过术后急性期，接受治疗的异系移植动物可存活长达术后58天。在研究期间，同基因移植大鼠长期存活，而接受异基因移植的大鼠则因使用雷帕霉素和FK506而出现不同程度的死亡率。在各治疗组中，FK506组存活时间最长（第57天），雷帕霉素组次之（第20天），未治疗对照组最短（第10天）。
感觉和运动功能的恢复情况如图3所示。使用Hargreaves装置检测发现，到第30天时，动物移植足部的感觉神经功能已恢复。术后四周，动物表现出显著的功能恢复（Aii）。通过步态分析跑台及集成软件分析平台，观察到移植肢体的运动功能...

本方案提供了一种稳健且可重复的带血管复合组织异体移植（VCA）模型，旨在同时研究免疫反应与功能恢复。通过在右侧大腿中段进行后肢原位移植，并手工缝合血管吻合口及神经对接，尽管技术操作耗时较长，但能够实现对功能恢复的深入研究。

肢体移植尤其是血管化复合异体移植（VCA）具有广阔的治疗前景，但其发展一直受到当前……的限制

本视频将详细介绍如何进行大鼠右侧后肢大腿中段原位移植手术。供体大鼠的右侧后肢在大腿中段水平截肢后，置于冰上保存。受体大鼠的右侧后肢也在大腿中段水平截肢。随后将供体大鼠的肢体连接到受体大鼠。我们将描述如何重新连接骨骼、动脉、静脉、神经、肌肉和皮肤系统。肢体移植，更确切地说是血管化复合组织异体移植（VCA），具有广阔的治疗前景。但目前该领域仍受限于技术、免疫抑制以及功能性的神经运动恢复效果不佳。我们的模型强调经过严格时间验证的精细显微外科技术，例如手工缝合的血管吻合和神经对接。在一年多的时间里，我们已成功完成了200多例此类手术。尽管初学者在刚开始进行显微外科手术时存在一定的学习曲线，但通过观看本视频学习我们的方法并坚持专注练习，任何显微外科医生都能够掌握该模型。所有实验均依照美国国立卫生研究院（NIH）《实验动物护理与使用指南》进行，并经西北大学动物护理与使用委员会批准。具体实验操作依据协议编号 IS 00001663 执行。选择一只8至16周龄、手术时体重在250至400克之间的大鼠。在修剪大鼠后肢毛发前，通过蒸发器使用5%异氟烷诱导全身麻醉。使用鼻罩将麻醉维持在2%至2.5%，并将大鼠置于带有下方加热装置的手术台上。用70%的异丙醇对无毛皮肤进行消毒，并用无菌纱布保护手术区域。使用合适的显微外科显微镜以及此处所示的显微外科器械，配合易于操作的双极和单极电凝设备，即可准备开始解剖。使用剪刀在右侧后肢周围做一个环形皮肤切口。从腹股沟皱襞起始处开始，大致与腹股沟韧带处于同一水平，向背外侧延伸，完成环周切口。随后暴露切口正下方的肌层，分离并电凝从肌层走向近端皮瓣的浅表腹壁上血管。将近端皮瓣向上内侧翻起至腹股沟韧带，远端皮瓣向下外侧翻起至膝部。使用金属牵开器或卷曲的纱布帮助暴露术区。观察到大鼠的腹股沟解剖结构与人类相似，由外侧至内侧依次为神经、动脉和静脉。游离股神经，并在腹股沟韧带处、分叉近端尽可能锐性切断股神经。将分离的神经向下牵开，安全地将其置于操作区域之外，并用湿润的纱布覆盖。将注意力转向股动脉和股静脉，使用4厘米长的7-0丝线结扎线，以无创方式牵拉血管，避免直接操作。此时仔细操作将有助于提高最终吻合的效果。用7-0丝线结扎股血管的所有分支，并在结扎线之间切断这些分支。需要切断的动脉和静脉分支包括浅髂环旋动脉和肌支血管。浅表旋髂血管通常最为粗大，其走行看似类似于人类的股深动脉向深层深入，但在大鼠中并无股深动脉。股血管更远端的分支，如最高膝状动脉和隐支，通常无需切断。现在用7-0丝线尽可能靠近腹股沟韧带近端结扎股动脉，并在结扎线之间将其切断。与动脉类似，结扎并切断股静脉。将动脉和静脉一起向下牵拉，安全地移开，并用湿纱布覆盖，此前已覆盖的股神经也一并置于纱布下。解剖腹侧肌群，注意电凝任何可见的血管分支。此时注意止血，可最大限度减少后续再灌注期间受体的失血。在腹侧肌群深部，辨认坐骨神经并在其分支近端锐性切断。通常可见三条坐骨神经分支：胫神经、腓神经和腓肠神经。这三条血管均应在供体肢体中予以保留。通常在此解剖过程中不会观察到第四支皮支。在大腿中段水平仔细止血后，离断剩余的腹侧和背侧肌群。可能需要将肢体向内侧牵拉，以完成肌肉的分离。使用手持无线旋转锯在股骨中段横断骨质。此时肢体已完全从供体分离。将肢体移植物从供体取下后，剪除移植物侧股动脉和股静脉残端上绑扎的丝线，从而重新打开血管。将24号套管针插入移植物动脉残端，用250国际单位肝素溶于5毫升冰冻生理盐水中冲洗移植物，注意观察液体从开放的静脉端流出。缓慢、轻柔地冲洗移植物约三分钟。过度用力冲洗可能会损伤内皮细胞。将移植物置于盛有冷生理盐水的培养皿中，并将该培养皿放入盛有冰块的容器内，直至进行移植。通过双侧开胸法处死供体大鼠。受体手术的起始步骤与供体手术相似，包括对大鼠进行麻醉、修剪毛发、在腹股沟皱襞处做环形切口、翻转皮瓣、游离出股神经、股动脉和股静脉，并结扎与之前所述相同的分支血管。然而，在此手术过程中，股神经的切断位置应比供体手术更偏远端，但尽可能位于分叉点近端。分离股动脉和股静脉，并在腹股沟韧带水平分别用显微外科血管夹近端夹闭。继续按前述方法进行手术，在大腿中段水平仔细止血后切开大腿腹侧的支撑肌肉，必要时向内侧牵拉肢体。识别坐骨神经并在其分支点近端将其切断，使用旋转锯在股骨中段横断股骨。根据当地动物护理与使用委员会的指南，移除受体大鼠的原生右侧后肢并妥善处理。在此阶段，通过鼻罩将异氟烷浓度下调至1%至1.5%至关重要。在手术这一疼痛较轻的阶段，若麻醉过深，将导致大鼠死亡。现在是将骨骼进行对接的时候了。使用手持式旋转锯，修整供体和受体股骨切割端的任何不规则部分。剪下一根18号针头的接头端，该部分将作为股骨髓内针使用。在操作骨骼之前，于股骨受体端的切割面涂抹少量骨蜡，以减少扩髓过程中的骨髓出血。使用18号针头作为髓内钉，将供体与受体股骨进行对接。需要施加一定力量，但扩髓时不得过深，以免造成皮质骨骨折。根据需要，取下针并将其修剪至适当长度，确保两块骨骼能顺利套在针上，且骨块之间无针体外露。在供体肢体下方放置小支撑物（如纱布垫、小石块或油灰泥），以避免肢体受到张力。使用8至10针间断的5-0聚乳酸羟基乙酸缝线将腹侧肌群重新对合，防止移植物围绕股骨针发生旋转。这可为吻合术提供肢体稳定性。现在开始进行吻合。定期用冰冻生理盐水冲洗移植物和手术区域，以获得更清晰的视野，并减少缺血再灌注损伤。将供体与受体股动脉对齐，使用间断的10-0尼龙单线以端对端方式吻合，避免张力和成环。动脉吻合通常需要平均六针。与动脉类似，将供体与受体股静脉以端对端方式吻合。静脉需要缝合6到8针。充分的冷盐水灌洗、无创的血管操作技术，以及留长线头作为牵拉缝线以辅助血管回缩，是实现有效显微吻合的重要手段。在两处吻合口放置适量止血纤维素粉末，随后移除静脉和动脉近端的显微血管夹。检查两个吻合口是否通畅且血流良好。使用棉签轻轻探触静脉，观察两个吻合口是否止血良好。当确认两个吻合口均满意后，将剩余的较长缝线线头修剪至与其他线头长度一致。将大鼠重新置于左侧卧位，广泛使用电凝法仔细止血，确保任何再灌注肌肉出血均得到彻底止血。在确认肌肉止血完成后，开始关注神经吻合。使用间断的5-0聚乳酸羟基乙酸缝线，将位于坐骨神经正下方的背侧肌群重新对合。修剪掉任何参差不齐的神经断端。使用10-0尼龙缝线对坐骨神经进行端端吻合，尽量缝合至神经外膜。通常采用8到10个单纯间断缝合即可。用5-0聚乳酸羟基乙酸缝线缝合剩余的背侧肌群，然后用4-0聚乳酸羟基乙酸缝线连续锁边缝合背侧皮肤。将大鼠重新置于仰卧位，用10-0尼龙缝线对股神经进行原位缝合，缝合时仍应尽量采用神经外膜缝合技术。通常使用两到三根简单的间断缝线即可。以与背侧皮肤相同的方式缝合剩余的腹侧皮肤。避免过长的缝线尾端，以免大鼠苏醒后感到不适。动物度过术后即刻阶段后，即可对其进行神经运动功能恢复的检测。采用 Hargreaves 试验检测热觉功能。将大鼠放入测试容器中，并使其适应环境 20 分钟。确认玻璃装置洁净，并用研究者的手指确认热源工作正常。测试前，确认大鼠处于清醒状态，且待测足爪已放置在红外运动探测器上方。以90级强度发射热能。记录动物将爪子移离热源的时间延迟。如果在20秒内未发生动作，则中止测试以防止损伤。对每条被测肢体进行五次试验，在计算每只动物的平均缩足潜伏期时，需排除最高值和最低值。此处以卡通形式展示了手术设计示意图。供体和受体大鼠的右侧后肢均在大腿中段水平进行截肢，截断坐骨神经横截面。在受体手术中，必须重新连接股动脉、股静脉、神经以及坐骨神经和股骨。该模型可用于展示免疫抑制和移植策略对存活率的不同影响。采用此技术可实现长期存活。该模型还可用于研究感觉神经的恢复情况，术后四周左右可能已可见恢复迹象。也可使用步态分析平台来评估运动功能。在此，我们展示了一种具有较好存活特性的大鼠模型平台，用于探究后续图示中所示的感觉和运动功能恢复情况。在血管化复合组织异体移植（VCA）这一更广泛的范畴下，带血管成分的异体移植具有广泛的应用治疗前景，但目前尚未完全实现。目前免疫抑制和神经运动功能恢复技术面临的主要障碍在于此。新技术的开发将依赖于灵活、可靠且可重复的动物模型。通过使用这一平台，我们希望研究人员能够推动肢体移植多个方面的进展。感谢观看，祝您下一步顺利。

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