利用荧光显微镜表征剪切流中单分子构象变化

在剪切流中量化单个生物大分子的构象变化，有助于理解蛋白质和DNA等大分子的功能与生物物理特性。荧光显微镜能够在生理流动环境中实时原位观察单个分子，具有高时间与空间分辨率，这是原子力显微镜（AFM）等其他技术无法比拟的。

通过表征作用于保护DNA的蛋白质并使其发生全局构象变化的剪切力，可以更有效地设计出模拟这些生物物理特性的药物。本方案可广泛应用于研究其他聚合物（尤其是生物聚合物）在不同流动条件下的行为，以及复杂流体的流变学特性。各步骤的时间控制对实验成功至关重要。

我们建议多次练习微流控装置表面处理和荧光显微镜操作步骤，以高效地完成这些操作。生物大分子构象变化是一种可视化的动态现象，通过影像观察效果最佳。科研人员在观看本视频中展示的蛋白质和DNA实时显微成像后，将能更好地理解该方法。

制备微流控装置时，将五份硅酮弹性体基础剂与一份固化剂加入称量皿中，充分搅拌一分钟，制成预固化PDMS溶液。将模具硅片放入塑料培养皿中，将PDMS溶液浇注在硅片上，形成厚度为五毫米的层。

将培养皿盖好，置于真空干燥器中静置一小时，以去除气泡。随后将盖好的培养皿在60摄氏度下孵育过夜，使PDMS固化为柔韧的固体，从而在PDMS与晶圆界面处形成微流控通道。次日，使用剃刀在PDMS中每个微流控通道周围切割出20乘以10毫米的矩形，并用镊子取下矩形块。

使用带有锋利边缘的25号钝头针，在通道的一端打一个直径为0.5毫米的孔，确保该孔完全穿透PDMS块。用细针将孔中的PDMS材料剔除，并在通道的另一端重复此操作。将带有通道的一面朝上放置PDMS块，并将盖玻片放入等离子体键合仪的腔室内，启动处理程序。

当处理完成后，迅速将PDMS块放置在盖玻片上，使通道与盖玻片接触。对PDMS块的边缘施加压力，然后将盖玻片-PDMS组装体置于115摄氏度的加热板上加热15分钟，以增强永久性粘合。最后，插入一根10厘米长的。

将内径为0.25毫米的管子插入PDMS块顶部的出口孔，以便液体顺利流出通道。进行血管性血友病因子（von Willebrand factor，VWF）实验时，向微流控装置的入口注入最多10微升浓度为10微克/毫升的BSA-生物素溶液（溶于无菌1×PBS中）。注射后，在移液器吸头中保留几微升BSA-生物素溶液，并使吸头保持嵌入入口中。

让BSA-生物素在装置中孵育两小时，使BSA非特异性地结合到盖玻片表面。然后移除移液枪头，并向通道中注入最多10 µL的酪蛋白封闭液。让酪蛋白溶液孵育30分钟，以封闭所有空余位点，减少生物分子对表面的非特异性结合。

移除吸头，并将最多10微升链霉亲和素溶于无菌PBS中注入通道，使其与BSA-生物素中的生物素基团结合。接着，注入最多10微升洗涤剂溶液以洗去未结合的链霉亲和素。移除吸头后，注入含VWF的酪蛋白溶液或λ DNA。

将VWF孵育3分钟，或将λ DNA孵育45分钟。随后注入5毫摩尔的游离生物素，以阻断多余的链霉亲和素结合位点。将1毫升酪蛋白封闭液装入注射器，并将其固定在注射泵上。

然后将管路的一端连接到注射器针头上，并注入溶液以去除气泡。在游离生物素注射后约三分钟，将管路的另一端连接至微流控装置的入口。选择全内反射（TIRF）或共聚焦荧光显微镜的最高放大倍数物镜。

如有需要，可在物镜上滴加一滴浸油。将微流控装置放置在显微镜载物台上，使盖玻片与物镜齐平。开始明场显微镜观察，并调节焦距，使杂质和气泡等特征清晰可见。

然后在X和Y方向上调节载物台，直至微流控通道的边缘可见并平分视野。切换至FITC通道，根据需要调节Z轴焦平面和TIRF角度，直至可分辨单个绿色球状分子。调节激光强度和曝光时间，以观察荧光分子的同时避免过快发生光漂白。

然后调整对比度以更清晰地观察分子。在游离生物素注射开始后恰好五分钟，启动并停止蠕动泵的流动，使用每小时5000至30,000微升的流速来观察分子构象的变化。对于VWF，关键是在游离生物素注射后恰好五分钟施加至少少量的流动，例如每小时10,000微升的流速持续30秒。

在微流控装置的不同区域重复此操作，并寻找那些在多次启动和停止流动循环中能够伸展和松弛的分子。记录分子达到最大伸展和完全松弛所需的时间，并拍摄分子在剪切流作用下的连续行为视频。分子构象改变的灵活性通常表现为：随着流动增加、剪切速率升高，分子能够发生伸长。

血管性血友病因子分子的伸展度与剪切速率曲线可用于表征该蛋白质的生物力学特性。λ DNA 的荧光显微镜图像同样显示，在30秒时随着剪切速率升高，其伸展程度增加；流动停止后，两分钟内逐渐松弛。处理 VWF 时，请记住在启动流动前，仅将其孵育三分钟，游离生物素孵育五分钟。

这对于形成最佳数量的生物素-链霉亲和素连接至关重要，而这种连接是实现可逆解旋所必需的。该方法可被改进用于实时观察多种生物分子之间的相互作用，并表征其功能。例如，通过该方法在高剪切力下观察血管性血友病因子（VWF）的解旋过程及其与血小板黏附分子GPIb-α的结合，可更深入地理解血小板栓的形成机制。