使用荧光显微镜在剪切流下描述单分子构象变化
January 25th, 2020
我们提出了一种在微流体器件中固定单个大分子和量化其在剪切流下其一致性变化的协议。该协议可用于描述流动环境中蛋白质和DNA等生物分子的生物力学和功能特性。
量化剪切流下单个生物分子的构象变化有助于了解蛋白质和DNA等大分子的功能和生物物理。荧光显微镜允许对生理流动环境中的单分子进行实时原位可视化，具有高时空分辨率。这是其他技术（如 AFM）所无法比拟的。
通过描述蛋白质的DNA具有全球构象变化的剪切力，可以更好地设计模仿这些生物物理特性的药物。该协议可广泛应用于不同流动条件下的行为或其他聚合物，特别是生物聚合物，并研究复杂流体的流变学。步骤的时机对成功至关重要。
我们建议多次练习微流体装置表面处理和荧光显微镜步骤，以高效的方式执行它们。捕捉生物分子的构象变化是一种视觉和动态现象，最好在电影中观看。在看到视频中显示的实时蛋白质和DNA显微镜后，科学家们将更好地了解这种方法。
要准备微流体装置，在称重船上的一个零件固化剂中加入五部分硅胶弹性体基座。彻底搅拌内容物一分钟，以创建预固化的 PDMS 解决方案。将主硅晶圆放在塑料培养皿中，将 PDMS 溶液倒在晶圆上，形成五毫米层。
盖上盘子，在真空下放在干燥器中一小时，以清除气泡。然后在60摄氏度下孵育覆盖的培养皿，将PDMS固化成柔性固体，从而在PDMS晶圆接口上将微流体通道模入PDMS中。第二天，使用剃须刀在 PDMS 的每个微流体通道周围切割 20 到 10 毫米矩形，然后用钳子移除矩形块。
使用具有锐化边缘的 25 规格钝端针在通道的一端打一个直径为 0.5 毫米的孔，确保孔完全穿过 PDMS 块。使用细针将 PDMS 从孔中冲出，并在通道的另一端重复此过程。将 PDMS 块与通道侧向上，盖玻片放入等离子粘合机的腔室，然后开始处理。
治疗完成后，快速将 PDMS 块放在盖玻片上，使通道与滑点接触。向块的边缘施加压力，然后在 115 摄氏度的热板上放置盖玻片 PDMS 组件 15 分钟，以加固永久粘结。最后，插入一个10厘米长。
0.25 毫米内径管进入 PDMS 块顶部的出孔，使液体轻松流出通道。对于冯·威勒布兰德因子或 VWF 实验，将每毫升 10 微克的 10 微升 BSA-Biotin 注入无菌 1X PBS 中，注入微流体装置的入口。注射后在移液器尖端中保留一些 BSA-Biotin 微升，并允许尖端保持嵌入进气口中。
允许 BSA-Biotin 在设备中孵育两个小时，这将导致 BSA 不专门绑定到盖玻片表面。然后拆下移液器尖端，将多达 10 微升的卡明阻尼溶液注入通道。让表皮溶液孵育30分钟，这样它就可以阻断任何自由点，减少生物分子与表面的非特异性结合。
取下尖端，在无菌PBS中注入多达10微升的链球菌素，该通道将结合到BSA-Biotin的生物素组。接下来，注射多达10微升的洗涤剂溶液，洗去多余的链球菌素。取出尖端，注射VF在卡芬溶液或羔羊DNA。
孵育VF三分钟或羊皮DNA45分钟。然后注射五毫摩尔自由生物素，以阻止多余的链球菌素结合位点。将一毫升卡明阻断溶液装入注射器中，并固定在注射器泵中。
然后将管的一端连接到注射器针上，然后流动在溶液中去除气泡。大约三分钟后，自由生物素注射将管的另一端连接到微流体装置的入口。选择 TIRF 或共分荧光显微镜的最高放大率目标。
如果需要，在目标上添加一滴浸入油。将微流体装置放在显微镜舞台上，使盖玻片与目标齐平。启动亮场显微镜并调整焦点，以便可以看到碎屑和气泡等特征。
然后调整 X 和 Y 方向的阶段，直到微流体通道的边缘可见并分帧。切换到 FITC 通道并根据需要调整 Z 电平和 TIRF 角度，直到可以区分单个绿色球状分子。调整激光强度和曝光时间，以可视化荧光分子，而不会过快地光漂白它们。
然后调整对比度，以更好地可视化分子。自由生物素注射开始并停止从注射器泵流出整整五分钟后，使用每小时 5000 至 30，000 微升的流速观察分子构象的变化。使用 VWF 时，应用至少少量流量至关重要，例如在自由生物素注射后 5 分钟，每小时流量为 30 秒 10，000 微升。
在微流体装置的各个区域重复这一操作，并定位分子，这些分子可以在启动和停止流的多个循环中扩展和放松。注意分子达到最大延伸和完全放松需要多长时间，并记录分子在剪切流下连续行为的视频。分子改变确认的灵活性通常表现为由于流量增加而应用更高的剪切速率，其加长能力。
冯·威利布兰德因子分子的延伸率曲线与剪切率曲线对于蛋白质的生物力学特性的特征性非常有用。lambda DNA 的荧光显微镜图像同样显示，在 30 秒内较高的剪切率增加，在流停止后两分钟内逐渐放松。使用 VWF 时，请记住在开始流动前仅孵育三分钟和自由生物素五分钟。
这对于形成可逆分解所需的最佳数量或生物素链至关重要。该方法可以适应可视化多个生物分子之间的实时相互作用，并描述其功能。例如，通过可视化VF在高剪切下解开及其与血小板粘附分子GPIb-alpha的结合，可以更好地了解血小板塞的形成。
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概述
本协议详细说明了在微流体装置中固定单个大分子以量化剪切流下的构象变化。它特别适用于研究蛋白质和DNA的生物力学性质。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物物理学
- 生物化学
- 微流体学
背景
- 了解生物分子的构象变化对药物设计至关重要。
- 荧光显微镜提供单分子的高分辨率可视化。
- 剪切流条件可以显著影响生物分子的行为。
- 本协议可以应用于不同流动环境中的各种聚合物。
研究目的
- 表征蛋白质和DNA的生物力学性质。
- 研究剪切力对生物分子构象的影响。
- 增强模仿生物分子生物物理性质的药物设计。
使用的方法
- 在微流体装置中固定单个大分子。
- 实时荧光显微镜用于可视化。
- 在受控剪切流下量化构象变化。
- 分析复杂流体的流变学性质。
主要结果
- 成功固定和可视化单个生物分子。
- 剪切流下构象变化的定量数据。
- 蛋白质和DNA的生物物理行为的洞察。
- 在药物设计和聚合物研究中的潜在应用。
结论
- 本协议为研究生物分子动力学提供了可靠的方法。
- 它为药物开发和材料科学研究开辟了途径。
- 未来的研究可以扩展这种技术的应用到其他生物分子。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables real-time visualization of single-molecule conformational dynamics under controlled shear flow, providing direct insight into biomechanical properties of proteins and DNA. Such data supports target validation by linking molecular behavior to physiological function, particularly in hemostasis and thrombosis. The approach enhances predictive confidence in early discovery by de-risking mechanistic hypotheses through quantitative, reproducible readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by correlating shear-induced conformational changes with functional states of von Willebrand factor.
- Operational Value: Provides a standardized platform for assessing target engagement under physiologically relevant mechanical forces.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that modulate biomechanical properties of disease-relevant targets.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, real-time readouts of molecular extension and relaxation kinetics under defined shear rates.
- Operational Value: Enables assay standardization through immobilized single-molecule arrays in microfluidic channels with controlled flow profiles.
- Scalability: Supports parallelization across multiple channel regions for increased throughput in lead identification campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery observations with preclinical validation by modeling hemodynamic conditions relevant to vascular pathophysiology.
- Mechanistic De-risking: Clarifies structure-function relationships of biomolecules under force, reducing ambiguity in target validation.
- Disease-Relevant System: Uses von Willebrand factor as a model to study shear-dependent activation in thrombosis and platelet plug formation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, where biomechanical profiling informs compound selection and optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by visualizing how shear flow alters conformational ensembles of single biomolecules.
- Screening: Delivers assay-ready systems with reproducible immobilization and real-time fluorescence readouts under variable flow.
- Analytics: Outputs extension versus shear rate curves and relaxation kinetics that enable quantitative comparison across molecular variants or conditions.
- Translational Research: Connects single-molecule behavior to pathophysiological processes like platelet adhesion under high shear.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular microfluidic-florescence platform applicable to diverse biopolymers and complex fluid systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by directly observing conformational changes rather than inferring them from indirect measurements.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized surface passivation, biotin-streptavidin immobilization, and flow control protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing biophysical efficacy markers orthogonal to binding affinity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by identifying molecules that preserve or modulate native biomechanical function.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device fabrication, surface chemistry, and fluorescence microscopy alignment.
- Depends on access to TIRF or confocal microscopes with stable laser excitation and environmental control.
- Necessitates standardization of shear flow rates via syringe pump calibration and channel geometry verification.
- Involves optimization of incubation times and blocking steps to minimize nonspecific binding while preserving specific biotin-streptavidin linkages.
- Limited by photobleaching at high laser intensities, requiring careful adjustment of exposure and contrast settings for longitudinal imaging.
