展示肾皮质提取物中血管内皮生长因子与黄体生成素之间的线性关系

本方案指出，使用牛和猪的肾脏提取物是研究肾脏生理学的优良且经济的资源，尤其适用于考察血管内皮生长因子与其他分析物之间的相关性。一直以来，将血管内皮生长因子（VEGF）——一种器官血管生成中的关键生长因子——与其他蛋白质进行关联分析都存在挑战。该技术使我们能够研究VEGF与激素等分析物之间的关联。

这将显著推进我们对这一重要生长因子的认知基础。该方法可能有助于关联肾皮质提取物中除本视频所述之外的其他分析物。通过可视化演示，将帮助他人获得可重复的结果，避免任何取样误差。

新鲜组织的使用对于该技术的成功至关重要。必须在动物屠宰后立即获取完整的新鲜肾脏。组织应始终在冰上转移至实验室。

使用无菌剪刀、镊子、刀片和培养皿解剖肾脏并切除所需的组织部分。沿矢状面将肾脏轻轻切成两半，并从肾脏中心的皮质区域切下一小块组织。用刀片将组织切成小块，转移至含有1毫升预冷的1× RIPA裂解提取缓冲液的微量离心管中。

用具体的样品信息标记试管，并将其置于冰上。使用带有无菌探头的手持匀浆器匀浆组织 1 至 2 分钟，直至肉眼不可见组织块，然后立即在 4°C 条件下以 9,600 ×g 离心 5 分钟。离心后，分别分装样品用于 ELISA 和总蛋白分析，以避免多次冻融循环。

开始检测前，将所有试剂和检测板恢复至室温，取出所需数量的微孔，将其余微孔密封后于4摄氏度保存以备后续使用。用双蒸水将20倍浓缩洗涤缓冲液稀释至300毫升，并设置空白孔，不加入任何溶液。向每个孔中加入50微升标准品或样本，再加入50微升辣根过氧化物酶标记的缀合物，随后立即向每个孔中加入50微升抗体溶液，并密封微孔板。

混匀后，将酶标板在37摄氏度下孵育1小时。孵育结束后，每孔加入200微升洗涤缓冲液进行洗涤。每孔加入50微升底物A和底物B，轻轻拍打酶标板侧壁以混匀，然后密封，并在37摄氏度避光孵育15分钟。

每孔加入 50 µL 终止液。轻轻震荡酶标板，用分光光度计在 450 nm 处读取吸光度。按照前述方法配制试剂和洗涤缓冲液，然后每孔加入 100 µL 标准品或样本，密封酶标板，充分混匀，并在 37 °C 下孵育 2 小时。

吸去每孔中的液体，每孔加入100微升检测试剂A。密封反应板，再孵育1小时。随后，每孔用400微升洗涤缓冲液洗涤，然后每孔加入90微升底物溶液，轻轻敲击反应板混匀，并在37摄氏度下继续孵育1小时。最后一次孵育结束后，每孔加入50微升终止液，轻轻敲击反应板混匀，然后使用分光光度计在450纳米处读取吸光度。

使用标准的BSA法估测牛和猪肾脏提取物的总蛋白含量，并利用该估测值对LH和VEGF-A ELISA结果进行归一化处理。计算两种动物及两种性别的LH和VEGF的平均值与中位数水平。在验证数据正态性后，采用线性回归模型分析LH与VEGF之间的关系。

LH被发现是牛和猪肾脏中VEGF的强效且显著的预测因子。在进行该操作时，重要的是要记住对每种组织取相同区域的样本。类似的操作可用于提取任何类型的组织。

请记得根据所用组织的总蛋白提取量对分析物进行归一化处理。