Name: 基于内显微镜的方法，用于评估肠道渗透性和上皮细胞脱落性能 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-12-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 学习活体显微镜技术用于实时观察肠道上皮细胞脱落与屏障通透性变化。该方法结合荧光示踪剂实现单细胞分辨率成像，为研究肠道动态细胞过程提供重要工具。

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获得这些结果的研究得到了欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013）下人才计划（玛丽·居里行动）欧洲研究执行机构（REA）第302170号资助协议的资助；埃尔朗根-纽伦堡大学临床研究跨学科中心（IZKF）；德国研究基金会（DFG）合作研究中心TRR241和临床研究组KFO257；以及德国研究基金会（DFG）的资助。

以下方案已获得德国埃尔兰根当地相关主管部门（下弗兰肯行政区，维尔茨堡）的批准。小鼠饲养于特定无病原体条件下。
注意：在 Pggt1biΔIEC 小鼠中，IEC 内 GGTase 介导的异戊二烯化作用受到抑制会导致肠道通透性发生严重改变24。因此，本研究采用该小鼠模型来展示该实验方案如何用于研究肠道屏障缺陷。然而，该方案也可用于其他任何小鼠品系的研究。
1. 手术准备及小鼠肠道黏膜染色
注意：手术准备基于先前描述的方案25。在手术过程中，将麻醉后的小鼠置于红色灯下，以防止其体温下降。
<ol>
	<li>通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪（氯胺酮 96 mg/kg；赛拉嗪 12.8 mg/kg）对小鼠进行麻醉。通过检查角膜反射是否消失来确认麻醉效果。</li>
	<li>使用棉签涂抹眼部保护膏。</li>
	<li>使用标准镊子和直头精细剪刀在小鼠左侧腹区做一切口（1 cm）。</li>
	<li>将一段肠管（约 5–7 cm）外置于体外。</li>
	<li>在对系膜侧使用电灼法纵向切开已外置的肠段。</li>
	<li>暴露黏膜，并用生理盐水短暂冲洗以去除粪便内容物。 
	注意：可选操作，可在肠道局部直接应用赛拉嗪以避免因蠕动引起的运动伪影。</li>
	<li>用吖啶橙和罗丹明-B标记肠黏膜表面（10 kDa 右旋糖酐）。
	<ol>
		<li>用移液器将 1 mg/mL 吖啶橙溶液（100 µL）逐滴加至黏膜表面，孵育 3 分钟。用 PBS 洗去残留溶液。</li>
		<li>用移液器将 2 mg/mL 罗丹明-右旋糖酐溶液（100 µL）逐滴加至黏膜表面，孵育 3 分钟。用 PBS 洗去残留溶液。 
		注意：可选操作，可使用无菌棉签清除标本上的血液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将麻醉后的小鼠仰卧位放置于已用预热生理盐水（37 °C）冲洗过的成像腔室内的盖玻片上。 
	注意：将打开的肠段黏膜面向下放置于盖玻片上。</li>
	<li>将标本（带小鼠的腔室）置于倒置显微镜载物台上。</li>
	<li>用恒温垫（约 37 °C）覆盖动物。</li>
	<li>立即开始活体显微成像。 
	注意：保持手术区域持续用预热生理盐水冲洗，以防止组织脱水和细胞死亡。</li>
</ol>
2. 活体显微成像
注意：在开始手术准备之前，请先执行步骤 2.1，以避免在麻醉、手术和图像采集之间等待时间过长。如有必要，可对已完成手术准备的动物追加麻醉剂剂量，以维持其在成像实验期间处于麻醉状态。
<ol>
	<li>设置共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）。
	<ol>
		<li>打开显微镜底座和扫描器盒以启动CLSM显微镜。按下启动按钮开启计算机。</li>
		<li>通过双击图标启动图像采集软件（例如LAS X）。选择适当的配置（配置：机器；显微镜：DMI6000），然后点击确定。
		<ol>
			<li>定义合适的分辨率。进入配置 | 硬件 | 分辨率 | 位深度，选择12。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>进入采集菜单。从下拉菜单中选择xyzt作为图像采集模式。从下拉菜单中选择物镜（20x 或 40x）。</li>
		<li>设计顺序采集设置。点击Seq，然后点击添加按钮（+）增加第二个序列，并选择帧间采集。
		<ol>
			<li>配置序列1（检测吖啶橙；416 nm激发；514 nm发射）。打开可见激光器盒，激活PMT1（开启），定义发射波长范围（490–550 nm）。</li>
			<li>配置序列2（检测罗丹明B-葡聚糖；570 nm激发；590 nm发射）。打开可见激光器盒，激活PMT2（开启），定义发射波长范围（550–760 nm）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>激活相应的激光器（488 和 552）。进入配置 | 激光器，激活488 nm和552 nm激光器（开启）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据当前实验的具体特征调整设置。
	<ol>
		<li>打开光源（按下电源键）。将样品（麻醉后的小鼠置于成像腔内）放置在显微镜载物台上，并调节xy位置，使照明轴对准组织样本。</li>
		<li>使用标准光源和目镜选择感兴趣的区域。
		<ol>
			<li>选择滤光立方体（I3），打开快门。使用粗调和微调旋钮对肠黏膜表面进行聚焦。通过调节XY位置，在视野中寻找可清晰观察到多个绒毛的区域。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>确认该区域也可观察到罗丹明-葡聚糖染色信号。更换滤光立方体（N2.1），通过目镜检查图像。</li>
		<li>从软件启动CLSM图像采集，优化两个序列的采集参数。
		<ol>
			<li>选择序列1，调节序列1的激光功率、增益和偏移量。</li>
			<li>选择序列2，调节序列2的激光功率、增益和偏移量。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>定义z轴堆叠范围。
		<ol>
			<li>打开z轴堆叠下拉菜单，使用z轴控制对准黏膜表面，按下开始。</li>
			<li>对准到底部信号仍可检测的位置，按下结束。</li>
			<li>定义z轴层数（10层）。确保连续两个时间点之间的成像时间间隔不超过2分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>定义时间设置。进入时间菜单，点击最小化，选择持续采集直至停止。</li>
		<li>定义行平均。选择Seq 1，设置行平均为2；选择Seq 2，设置行平均为2。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采集相应图像。
	<ol>
		<li>选择格式（1024 × 1024）和速度（400），按下开始。</li>
		<li>在完成所需图像采集时间后，按下停止。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>保存文件。进入项目，右键点击相应文件，按下另存为。
	<ol>
		<li>为文件命名，选择合适的文件夹，然后按下保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>如需进一步分析，对动物实施安乐死（颈椎脱位），并收集组织样本。</li>
</ol>
3. 图像分析：确定细胞脱落速率和肠上皮
<ol>
	<li>细胞脱落速率
	<ol>
		<li>启动图像采集软件。</li>
		<li>进入“打开项目”，选择相应的文件。</li>
		<li>确定图像采集的总时长。
		<ol>
			<li>选择最后一个完整的Z层扫描图像，从先前选定的时间点中选择最后一个Z位置，读取屏幕右下角显示的时间（即图像采集的总时长）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>选择一个绒毛。
		<ol>
			<li>选择合适的Z层位置（位于绒毛表面，但足够深以避免已脱落细胞和其他管腔内成分的干扰）。</li>
			<li>测量基底膜的长度。选择标尺工具，将绒毛划分为若干线段以覆盖或描绘整个绒毛周长，累加各线段数值（即基底膜总长度），随后删除标尺工具的各线段。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>统计在整个图像采集期间发生的脱落事件次数。
		<ol>
			<li>将绒毛划分为适当大小的区段，通过滑动时间轴浏览不同时间点的图像序列，分析每个区段内的事件发生情况，并标注识别出的细胞脱落事件。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>计算单位时间单位基底膜长度内的脱落事件数（即细胞脱落速率）。每段视频分析最多5个绒毛，每只小鼠至少分析两段视频，共获得10个测量值后计算其平均值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>渗漏
	<ol>
		<li>选择一个绒毛。</li>
		<li>选择合适的Z层位置（位于绒毛表面，但足够深以避免已脱落细胞和其他管腔内成分的干扰），统计每个绒毛上皮细胞的总数。</li>
		<li>统计渗漏点的数量（即罗丹明葡聚糖的细胞旁路存在现象；该事件为短暂性，可通过检查前后时间点的图像加以确认）。</li>
		<li>计算渗漏点数量与上皮细胞总数的比值。每样本/视频分析10个不同的绒毛，计算每个绒毛的平均渗漏点数和通透性细胞数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Buhner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+basis+for+increased+intestinal+permeability+in+families+with+Crohn%27s+disease%3A+role+of+CARD15+3020insC+mutation%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Genetic basis for increased intestinal permeability in families with Crohn's disease: role of CARD15 3020insC mutation?</a> Gut. 55 (3), 342-347 (2006).</li>
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</ol>

尽管技术上具有挑战性，基于活体显微镜的方法仍是一种独特的实验手段，可实时观察高度动态的细胞过程，例如细胞脱落行为。迄今为止，尚无其他实验方法能够在体内可视化细胞挤出过程。我们相信，该方案有助于描述多种在维持肠道稳态中发挥重要作用的细胞过程。
利用活体显微技术，本文所介绍的方法能够实现对活体动物肠道上皮细胞脱落过程的实时可视化观察。因此，通过对麻醉小鼠的肠道黏膜进行局部染色（吖啶黄和罗丹明B-葡聚糖），可借助共聚焦显微镜以单细胞分辨率进行成像。结合常规示踪实验，该方法可在体内识别肠道通透性异常，并区分细胞旁路与跨细胞通透性。结合报告基因小鼠模型，类似方案可用于监测上皮细胞脱落过程，还可揭示紧密连接重新分布以封闭脱落细胞所遗留的暂时性渗漏区域的现象（拉链样效应）22,26。
除了上皮细胞脱落外，本文所述方法的改进已被应用于分析发生在肠黏膜表面的其他高度动态的细胞过程。例如，通过静脉注射示踪分子并使用抗CD31抗体对...

肠道是一个高度特化的器官，其功能受到严格调控，能够同时实现两种相互矛盾的过程，即营养吸收和抵御有害的管腔物质。作为人体与外界环境之间的界面，肠上皮发挥着物理和免疫屏障的作用，并有助于维持肠道黏膜稳态1,2。上皮完整性丧失以及紧密连接通透性增加，已被广泛证实与炎症性肠病（IBD）密切相关3,4,5,6。因此，上皮结构的改变在IBD中既被视为慢性肠道炎症的诱因，也被认为是炎症持续放大的继发因素。因此，深入理解IBD患者肠道中早期上皮改变，对于开发恢复上皮完整性的新策略、实现IBD复发的可靠预测和有效预防具有重要意义。
肠上皮经历着复杂且受到严密调控的更新过程。从隐窝底部开始，由多能干细胞分化而来的终末分化肠上皮细胞（IECs）向上迁移至绒毛顶端，在此处衰老或受损的细胞被排出进入肠腔7。细胞分裂与细胞脱落之间的平衡可维持肠上皮细胞数量的稳定，避免形成细胞间隙和渗漏，同时也防止上皮细胞过度积聚，从而避免形成细胞团块及肿瘤发生8,9,10。尽管上皮细胞脱落对肠道上皮的生理更新具有关键作用，但目前对驱动绒毛顶端细胞脱落的分子机制仍了解有限。因此，亟需基础研究对上皮细胞脱落过程中所涉及的分子事件序列进行精确描述。
肠道黏膜内不同细胞类型之间的复杂相互作用对于理解调控上皮更新和肠道稳态的分子机制至关重要。因此，在这一领域，体内研究相较于体外和离体方法具有显著优势。此外，实时成像技术能够描述调控特定现象的事件序列。在此背景下，研究高度动态的过程需要采用优化的高分辨率技术，以实现对组织的直接观察。活体成像技术正是研究肠道上皮细胞脱落过程的独特且适宜的工具。
“&#34;活体显微成像&#34;”一词指利用高分辨率成像技术（如双光子或共聚焦显微镜）直接在活体动物体内原位观察细胞和组织的实验方法11。该技术能够以单细胞分辨率实时获取活体内的生物学信息，相较于静态或低分辨率方法具有明显优势。活体显微成像可提供互补性信息，并克服经典或高端技术中因组织处理所导致的人为假象等部分局限性。然而，其主要限制在于待观察组织必须直接暴露于显微镜下，这在大多数情况下需要进行手术操作。尽管已有复杂技术可维持成像组织的活性并将其损伤降至最低（如皮肤折叠腔室和成像窗）12,13，但在多数实验中仍采用简单的皮肤切口以暴露组织（皮肤瓣）14。在过去十年中，这些方法为研究以往难以解析的高度动态生物学过程提供了关键证据。从转化医学角度看，实时成像技术已揭示了干细胞与白细胞归巢15，以及肿瘤扩散和转移形成过程中的新生物学机制13,16。在临床应用中，内窥显微成像目前已被用作癌症17及炎症性肠病（IBD）等胃肠道疾病18,19的诊断工具；而共聚焦马赛克显微成像则在手术过程中发展为一种快速病理检测手段20。综上所述，活体显微成像近年来已成为生物医学研究中一种重要且多功能的工具，并具有广阔的临床应用前景。
活体显微技术在此用于实时可视化观察肠上皮渗漏及上皮细胞脱落事件。肠道通透性的渗漏也可通过其他体内无创技术进行识别，例如通过定量血清中口服给予的荧光示踪剂来检测21。然而，该技术无法直接观察细胞脱落过程，也无法区分旁细胞与跨细胞通透性。标准示踪实验与活体显微技术的结合提供了一种合适的方法：i）识别肠道通透性异常；ii）区分旁细胞与跨细胞上皮通透性。除了细胞脱落外，活体显微技术结合体内荧光标记还可用于研究其他细胞与分子机制（例如，利用荧光报告小鼠研究细胞脱落过程中紧密连接的重分布22，或肠上皮细胞与肠黏膜内其他细胞之间的相互作用23）。
本文所述方法是对活体显微技术的一种改进，旨在利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）实现对肠黏膜的实时观察。为此，我们使用肠上皮细胞（IECs）中GGTase（香叶基香叶基转移酶）条件性基因敲除的小鼠模型（Pggt1biΔIEC小鼠），因为这些小鼠会出现严重的肠道疾病并伴有上皮通透性增加24。文中详细描述了小鼠的手术准备、肠黏膜染色方法，以及成像过程中所采用的合适参数设置和图像采集后的分析流程。该实验方案可为今后深入研究肠上皮细胞脱落的动力学与动力学特征提供支持。此外，该方案也可作为基础，进一步拓展用于研究肠黏膜表面及其他组织表面发生的多种生物学现象。

<table><tbody><tr><td>盐酸吖啶黄</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8251</td><td>1 mg/mL PBS 溶液</td></tr><tr><td>DeltaPhase 恒温垫</td><td>BrainTree</td><td>B-DP-PAD</td><td>-</td></tr><tr><td>Gemini 电凝系统</td><td>BrainTree</td><td>B-GEM-5917</td><td>-</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>WDT</td><td>9089.01.00</td><td></td></tr><tr><td>LAS X</td><td>Leica</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>SP8 共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biochrom</td><td>L182</td><td></td></tr><tr><td>罗丹明B葡聚糖</td><td>Invitrogen</td><td>D1824</td><td>分子量 10,000 kDa；2 mg/mL 溶液</td></tr><tr><td>标准镊子（Dumont SS）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11203-23</td><td>-</td></tr><tr><td>直头精细剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-10</td><td>-</td></tr><tr><td>他莫昔芬</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T5648</td><td>乙醇中 50 mg/mL 溶液</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Bayer</td><td>1320422</td><td></td></tr></tbody></table>

基于活体显微镜的肠道通透性与上皮细胞脱落功能评估方法

An Intravital Microscopy-Based Approach to Assess Intestinal Permeability and Epithelial Cell Shedding Performance

利用共聚焦成像技术对活体动物肠道进行活体显微观察，可实时监测上皮细胞脱落及屏障渗漏现象。因此，可对麻醉小鼠的肠黏膜局部施用非特异性染料（吖啶黄）和荧光示踪剂（罗丹明-B-葡聚糖），将其置于经生理盐水冲洗的载片上，直接使用共聚焦显微镜进行成像。该技术可作为其他无创性检测肠道通透性渗漏方法的补充，例如口服示踪剂跨黏膜转运的检测。此外，本文所述方法能够实现对细胞脱落事件的实时直接观察。结合适当的荧光报告小鼠模型，该方法适用于揭示调控肠上皮细胞外排的细胞与分子机制，也可用于研究其他生物学过程。在过去几十年中，利用活体显微技术开展的多项有趣研究，已增进了人们对内皮通透性、免疫细胞归巢至肠道、免疫-上皮细胞间通讯以及管腔成分侵入等现象的认识。综上所述，本文所述实验方案不仅有助于深入理解调控上皮细胞外排的机制，还可能为开发用于观察其他高度动态细胞过程（甚至在其他组织中）的新方法奠定基础。在技术局限性方面，特定组织的光学特性以及所选用的成像技术和显微镜配置，将决定成像的工作距离和所获图像的分辨率。

本文所述方案介绍了一种基于活体显微镜的技术，用于实时观察肠道上皮通透性及肠上皮细胞脱落过程。简言之，对小鼠进行麻醉并实施手术准备，以暴露小肠黏膜表面。通过局部应用吖啶橙对肠上皮细胞（IECs）进行染色；同时将罗丹明B标记的葡聚糖经肠腔灌注，作为示踪剂以检测其从肠腔向黏膜下间隙的跨膜迁移。随后，将完成手术准备的小鼠置于培养皿内的载玻片上，并使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行时间序列成像（图1）。成像后的数据分析可计算出上皮细胞脱落速率（每分钟每基底膜长度的细胞脱落事件数），以及在特定时间点的瞬时渗漏百分比（细胞旁通透性）和“通透性细胞”比例（跨细胞通透性）。
为了诱导上皮完整性的改变，我们利用了先前报道的肠上皮细胞（IEC）特异性GGTase缺陷型条件性小鼠模型（Pggt1biΔIEC小鼠），该模型通过LoxP-Cre系统构建<sup class="...

利用活体显微技术，本文所介绍的方法能够实现对活体动物肠道上皮细胞脱落过程的实时可视化观察。因此，通过对麻醉小鼠的肠道黏膜进行局部染色（吖啶黄和罗丹明B-葡聚糖），可借助共聚焦显微镜以单细胞分辨率进行成像。

利用共聚焦成像技术对活体动物肠道进行活体显微观察，可实时监测上皮细胞脱落和屏障渗漏现象。

利用活体显微成像技术，本方案可实现对肠道组织的实时观察，分辨率可达单细胞水平，并可用于研究细胞脱落等高度动态的生物学过程。结合标准示踪剂实验，该方案能够在体内识别肠道通透性异常，并区分细胞旁通路与跨细胞通路的通透性变化。本方案可作为开发其他活体显微成像方法的基础，用于可视化多种组织中其他感兴趣的高动态细胞过程。该方法的可视化演示对于理解手术准备步骤以及以利于获取肠道黏膜表面图像的方式固定活体动物至关重要。在开始操作之前，打开共聚焦激光扫描显微镜的底座和扫描盒，并按下启动按钮以开启计算机。启动图像采集软件，并选择适当的配置。为设置合适的图像分辨率，请选择配置、硬件、分辨率、位深度为12。在采集菜单下，选择XYZT作为图像采集模式，并将物镜设置为20倍或40倍。要设置连续采集参数，请点击“seek and add”并选择帧间采集模式。要配置序列一，请打开可见激光器盒子，将第一光电倍增管设为开启状态，并定义发射波长。要配置序列二，请打开可见激光器盒子。将第二根光电倍增管设为开启状态，并设定发射波长。随后激活相应的激光器。确认小鼠对足趾夹捏无反应后，用棉签将眼膏涂抹于麻醉小鼠的眼睛，并在腹部左侧心室区域做一厘米切口。使用镊子将一段3至5厘米长的肠管移出体外。在肠段的顶端和底端各做一个小切口，将玻璃微吸管插入肠腔内。然后沿对系膜侧纵向电灼切开外置的肠段，暴露黏膜。 用生理盐水短暂冲洗组织，以去除粪便内容物。对于肠黏膜表面染色，将100微升浓度为1毫克/毫升的吖啶橙溶液以滴状施加到暴露的黏膜表面，静置染色3分钟，随后用PBS洗去残留溶液。接着，将100微升浓度为2毫克/毫升的罗丹明葡聚糖溶液以滴状施加到黏膜上，孵育3分钟后用PBS洗涤。然后将麻醉后的小鼠仰卧置于已用37摄氏度生理盐水冲洗过的腔室载玻片上，必要时调整其位置，并将标本放置于倒置显微镜载物台上。将小鼠放上载物台后，立即打开光源，并调节XY方向位置，直至照明光轴对准组织标本。为选择视野范围，请选择合适的滤光镜组。打开快门，使用宏观和微观调节轮聚焦于肠黏膜表面。调节XY位置，定位一个视野内可观察到多个绒毛的区域，并更换滤光立方体，确认该区域内的罗丹明葡聚糖染色亦可见。确定感兴趣区域后，开始图像采集，并选择序列一，调节序列一的激光功率、增益和偏移。然后选择序列二，并调整序列二的激光功率、增益和偏移量。要定义Z轴扫描范围，请打开Z-stack下拉菜单。使用Z轴控制功能聚焦于黏膜表面，然后点击开始。聚焦于信号仍可检测的下限位置，然后单击结束。设定Z层扫描的数量，避免连续两个时间点之间的时间间隔超过两分钟，并打开时间菜单，选择最小化并持续采集直至停止。为定义线平均，依次选择寻址一、线平均二、寻址二和线平均二。然后，为获取图像，将格式设置为 1024 × 1024 像素，速度设置为 400，并点击开始。肠道上皮细胞特异性 GGTase 缺陷型条件性小鼠表现出严重的肠道病理变化，表现为小肠组织损伤评分升高，且通过口服给予 FITC-葡聚糖的活体实验可检测到肠道上皮通透性增加。细胞脱落事件可被识别为细胞从上皮单层移出至肠腔，导致上皮顶端出现暂时性间隙，随后邻近细胞相互接触而闭合该间隙，即所谓的“拉链效应”。在对照组和GGTase缺陷型小鼠中均观察到这些间隙，尽管后者的发生频率更高。有趣的是，其他细胞似乎也能摄取葡聚糖。这些所谓的可渗透细胞事件也主要发生在条件性敲除小鼠中。可通过免疫染色检测细胞骨架相关蛋白和紧密连接蛋白，以鉴定可能通过活体显微镜确定的上皮通透性破坏的相关特定靶点。该方法还可用于分析肠道黏膜表面的其他现象，例如在肠道感染背景下发生的内皮渗漏或免疫-上皮细胞间的通讯。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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分析营养补充剂在实验性结肠炎期间对肠道上皮屏障功能的有益作用

本方案描述了在对人肠道类器官进行药物处理后，利用荧光显微镜和活细胞显微镜实时测量上皮屏障通透性的方法。...

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本文介绍了两种评估肠道屏障功能的方法。使用上皮电阻仪（伏特/欧姆计）直接在组织培养板孔中测量培养上皮细胞的跨上皮电阻，以评估其屏障完整性。在小鼠中，采用荧光素异硫氰酸酯标记的葡聚糖（FITC-dextran）灌胃法测定肠道通透性。 体内.

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基于活体显微镜的肠道通透性与上皮细胞脱落功能评估方法

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