Name: LarvaSPA，一种用于长期延时成像的安装果蝇幼虫的方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 了解LarvaSPA技术，一种利用PDMS立方体固定果蝇幼虫进行超过10小时连续活体成像的方法，用于研究外周感觉神经元的树突发育与退化动态过程。该技术具有高时空分辨率、成本低且可重复使用的优势。

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感谢唐凌峰建立了LarvaSPA方法的早期版本；感谢康奈尔大学奥林大厅机械车间的Glenn Swan制作了成像室的早期原型；感谢Philipp Isermann构建金属框架，并对制备PDMS立方体提供了建议；感谢康奈尔大学BRC成像中心提供显微镜使用权限（由NIH资助项目S10OD018516支持）；感谢Maria Sapar对稿件提出的宝贵修改意见。本研究得到了授予H.J.的康奈尔奖学金、康奈尔大学启动资金以及NIH资助项目（R01NS099125和R21OD023824）的支持。H.J.与C.H.共同构思了研究项目并设计了实验方案。H.J.完成了实验工作。H.J.和C.H.共同撰写了稿件。

1. 制作成像室
<ol>
	<li>金属框架可在普通机械加工车间使用铝块加工而成。框架的具体参数如图1A所示。</li>
	<li>构建成像室时，使用长盖玻片（22 mm × 50 mm）和紫外胶将金属框架底部密封（图1A）。使用手持式紫外灯固化紫外胶。</li>
</ol>
2. 制备PDMS立方体
<ol>
	<li>准备PDMS立方体的模具。
	<ol>
		<li>将包装胶带的层粘贴到矩形（80 mm × 55 mm）培养皿或圆形细胞培养板的内表面。对于二龄幼虫使用一层（0.063 mm厚），早期三龄幼虫使用两层（0.126 mm厚），晚期三龄幼虫使用三层（0.189 mm厚）（图1B）。</li>
		<li>用剃刀片将胶带切成特定宽度的条状：单层胶带宽度为1.5 mm，双层或三层胶带宽度为2 mm。条带的宽度和厚度将决定最终PDMS立方体所能容纳的幼虫大小。两条胶带之间至少保留5 mm的间距，并移除覆盖该区域的胶带层（图1B）。</li>
		<li>使用粘性胶带清除培养板内表面的灰尘。模具现已准备就绪，可供使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备PDMS混合物。
	<ol>
		<li>在小容器中充分混合7 g PDMS基质与0.7 g固化剂（10:1比例）。</li>
		<li>将容器置于真空干燥器中至少15分钟，以去除混合物中的空气。</li>
		<li>缓慢将约5.5 g PDMS混合物倒入模具中，使其厚度达到1–2 mm（图1B）。</li>
		<li>再次将PDMS混合物放入真空干燥器中至少15分钟，以去除残留的气泡。使用移液器吸头刺破最后残留的几个气泡。</li>
		<li>将PDMS在65 °C的恒温培养箱中于平坦表面固化2小时。</li>
		<li>用剃刀片沿模具边缘轻轻撬动固化的PDMS，使其脱离模具。将PDMS置于两片大面积粘性胶带之间，室温保存。</li>
		<li>对于早期和晚期三龄幼虫，沿胶带条形成的凹槽中心（步骤2.1.2）将PDMS切割成8 mm × 2 mm × 1 mm的立方体（沿图1B中的虚线），立方体长边中心对准凹槽（图1B,C）。对于二龄幼虫，将立方体切割为8 mm × 1 mm × 1 mm。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 长时间延时成像用幼虫的制备
<ol>
	<li>准备用于固定的上层盖玻片。
	<ol>
		<li>选择六个PDMS立方体，其凹槽尺寸需与幼虫大小相匹配。根据步骤2.1.1、2.1.2和2.2.7中推荐的PDMS凹槽尺寸进行选择。</li>
		<li>使用粘性胶带清除PDMS表面的灰尘。</li>
		<li>在长盖玻片（22 mm × 50 mm）上粘贴四段双面胶（12 mm × 5 mm），用于后续固定PDMS立方体。两段双面胶之间的间距应与PDMS凹槽的宽度相同。</li>
		<li>在每个PDMS立方体的凹槽内加入少量紫外胶（约1.2 μL），并在盖玻片上双面胶之间的区域滴加六小滴紫外胶。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备待固定的幼虫。
	<ol>
		<li>使用镊子将幼虫在水中清洗，以去除体表附着的食物残渣。</li>
		<li>将清洗后的幼虫放置于一个无盖的小型（35 mm）培养皿中的湿润滤纸片上。将该小培养皿放入一个较大的（60 mm）培养皿中，大培养皿内放置一片干燥滤纸。在通风橱中，使用塑料移液器向干燥滤纸上滴加8–12滴（160–240 μL）异氟烷，然后盖上大培养皿的盖子。</li>
		<li>等待2–3分钟并观察幼虫状态。当幼虫口钩停止运动时，将其从大培养皿中取出。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定动物样本。
	<ol>
		<li>若需成像动物背侧结构，将已固定的幼虫放置于盖玻片上双面胶之间的紫外胶上，使幼虫背侧表皮朝向盖玻片。</li>
		<li>将每个幼虫覆盖一个PDMS块，并将幼虫躯干部分嵌入PDMS凹槽中，头部和尾部保留在凹槽外。注意避免紫外胶堵塞幼虫的气门。</li>
		<li>轻轻按压PDMS块的两端，使其粘附于双面胶上，但不要对凹槽区域施加压力。轻拉幼虫尾部，使PDMS下方的表皮展平。</li>
		<li>使用手持式紫外灯在高功率模式下照射4分钟，固化紫外胶（光照强度约为0.07 mW/mm2）。 
		注意：使用紫外灯时需佩戴护目镜以保护眼睛。</li>
		<li>将盖玻片翻转，重复步骤3.3.4。</li>
		<li>用20 µL–30 µL水润湿一小片镜头纸（15 mm × 30 mm），并将润湿的镜头纸置于成像室底部（图1A,D）。</li>
		<li>将盖玻片放置于成像室上，使幼虫朝向室内一侧。使用紫外胶将盖玻片两端粘附于金属表面（图1A,D）。此时幼虫背侧已准备好用于共聚焦显微镜成像（图1E）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 成像
<ol>
	<li>使用合适的显微镜对幼虫进行成像。本方案中展示的所有结果（图2、图3、视频S2、视频S3 和 视频S4）均采用配备40倍（1.30 NA）油镜物镜的共聚焦系统获得。</li>
</ol>
5. 成像室和PDMS立方体的回收
<ol>
	<li>成像后，使用镜头纸去除顶部盖玻片上的油。用剃刀刀片插入盖玻片与金属框之间的缝隙，将顶部盖玻片从金属框上取下。成像室即可重复使用。</li>
	<li>用镊子将PDMS立方体从顶部盖玻片上取下。将PDMS立方体在粘性胶带上滚动，以去除胶残留物和灰尘。PDMS立方体即可重复使用。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无竞争利益。

本文介绍了 LarvaSPA，这是一种用于长期延时成像的活体Drosophila幼虫固定通用方法。该方法无需回收或重新固定幼虫，可实现连续不间断的成像，因此特别适用于追踪耗时数小时才能完成的生物学过程，例如树突的退化与再生。该方法还可用于成像细胞内钙动力学以及微管生长等亚细胞事件。由于在成像过程中幼虫体壁保持稳定，空间和时间分辨率可根据具体成像需求进行调整（例如，用于追踪快速的亚细胞囊泡运动，或监测神经元分支模式的缓慢整体变化）。此外，该方法适用于不同发育阶段的幼虫，且无需特殊设备。因此，LarvaSPA 有望被众多Drosophila实验室用于解决多种科学问题。
影响该方法成功的关键因素，包括PDMS长方体的性质以及幼虫的发育阶段 
PDMS长方体的尺寸和沟槽的深度需与幼虫的大小相匹配。若PDMS长方体过宽，可能覆盖幼虫的头部和尾部，导致缺氧；而过窄的PDMS长方体则可能无法有效限制幼虫移动。同样，沟槽过深将无法产生足够的压力来固定幼虫，而过浅的沟槽则无法容纳足够的胶水以将幼虫牢固粘附在盖玻片上。根据...

延时活体成像是一种研究动态细胞过程的有力方法。延时录像所提供的时空信息能够揭示回答细胞生物学问题所需的重要细节。Drosophila 幼虫因其透明的体壁可实现对内部结构的无创成像，已成为活体成像研究中广泛使用的体内模型1,2。此外，Drosophila 拥有大量可用于荧光标记解剖结构和大分子的遗传工具3。然而，对 Drosophila 幼虫进行长期延时成像仍具挑战性。与静止的早期胚胎或蛹不同，Drosophila 幼虫会持续运动，因此活体成像时必须将其固定。有效的活体 Drosophila 幼虫固定方法包括使用含氯仿的卤代烃油封片4、采用异氟烷或敌敌畏溶液进行麻醉5，以及通过盖玻片与载玻片之间加压固定6。尽管其中一些方法已被用于显微成像，但均不适用于长期活体成像。另有方法被开发用于在爬行幼虫中利用传统共聚焦显微镜或光片显微镜对体壁神经元进行成像7,8,9，但由于幼虫的运动，这些方法在监测细胞动态方面并不理想。
已开发出新方法以实现长期延时成像 果蝇 幼虫。使用聚二甲基硅氧烷（PDMS） &#34;幼虫芯片&#34;, 果蝇 幼虫可通过特制微室中的真空负压吸附实现有效固定，且无需麻醉。然而，该方法在细胞生物学研究中无法提供较高的时间分辨率，且对动物体型有严格限制。10另一种使用麻醉装置的方法实现了活体成像 果蝇 在多个时间点对幼虫进行观察，并已应用于神经肌肉接头的研究11,12,13,14,15,16然而，该方法同样无法实现超过30分钟的连续成像，且需要反复使用地氟烷，后者可能抑制神经活动并影响所研究的生物学过程17,18最近，一种结合微流控装置与低温麻醉的新方法已被用于在短时间内（数分钟）固定不同大小的幼虫19然而，该方法需要使用冷却系统等专用设备，且长时间固定需要对幼虫进行重复冷却。
在此，我们介绍一种多功能的固定化方法 果蝇 适用于持续超过10小时无间断延时成像的幼虫培养方法。我们称之为 &#34;通过部分附着实现幼虫固定&#34; （幼虫SPA，LarvaSPA）涉及将幼虫表皮粘附到盖玻片上，并置于定制的成像室中进行成像。本方案描述了如何制备成像室以及如何固定不同发育阶段的幼虫。在LarvaSPA方法中，利用紫外光反应性胶水将幼虫特定体节固定于盖玻片上。此外，使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）长方体对幼虫施加压力，防止其移动逃逸。成像室内保持空气与湿度，确保部分固定的幼虫在成像过程中维持存活。相较于其他技术，LarvaSPA具有以下优势：（1）它是首个允许对完整幼虫进行连续活体成像的方法 果蝇 幼虫可进行数小时的高时空分辨率成像；（2）该方法对幼虫尺寸的限制较少；（3）成像室和PDMS立方体可低成本制备，且可重复使用。
除了描述幼虫装片方法外，我们还提供了该方法在研究果蝇（Drosophila）树突状分支（da）神经元树突发育和树突退化中的若干应用实例。

<table><tbody><tr><td>6061 铝棒</td><td>McMaster-Carr</td><td>9246K421</td><td></td></tr><tr><td>3M 双面胶带</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>16093</td><td></td></tr><tr><td>3M Scotch 包装胶带</td><td>3M</td><td></td><td>1.88&quot; 宽 × 22.2 码</td></tr><tr><td>DUMONT #3 镊子</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-241-34</td><td></td></tr><tr><td>玻璃盖玻片</td><td>Azer Scientific</td><td>1152250</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Midwest Veterinary Supply</td><td>193.33161.3</td><td></td></tr><tr><td>Leica 共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>SP8，配备谐振扫描器</td><td></td></tr><tr><td>镜头纸</td><td>Berkshire</td><td>LN90.0406.24</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（中号）</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（小号）</td><td>VWR</td><td>10799-192</td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>121-20</td><td></td></tr><tr><td>矩形培养皿</td><td>VWR</td><td>25384-322</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 试剂盒（PBMS 试剂盒）</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>24236-10</td><td></td></tr><tr><td>移液管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1371126</td><td></td></tr><tr><td>紫外胶</td><td>Norland products</td><td>#6106, NOA 61</td><td>折射率 1.56</td></tr><tr><td>紫外灯（Workstar 2003）</td><td>Maxxeon</td><td>MXN02003</td><td></td></tr><tr><td>真空干燥器</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71232</td><td></td></tr><tr><td>擦拭纸</td><td>Kimberly-Clark</td><td>Kimwipes</td><td></td></tr></tbody></table>

larvaspa：一种幼虫固定方法 果蝇 用于长期延时成像的幼虫

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

活体成像是一种研究细胞生物学问题的宝贵方法。果蝇幼虫特别适合进行体内活体成像，因为其幼虫体壁和大多数内部器官具有透明性。然而，对完整的果蝇幼虫进行超过30分钟的连续活体成像一直具有挑战性，原因是难以在不造成损伤的情况下长时间固定幼虫。本文介绍一种名为LarvaSPA的幼虫装片方法，可实现对活体果蝇幼虫持续超过10小时的高时间与空间分辨率连续成像。该方法通过使用紫外反应性胶将幼虫部分粘附于盖玻片，并利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）块进一步限制幼虫运动，从而实现稳定固定。该方法适用于从二龄到游走期三龄的各个发育阶段的幼虫。我们展示了该方法在研究果蝇体感神经元动态过程中的应用，包括树突生长以及损伤诱导的树突退化。该方法还可用于研究发生在幼虫体壁附近的多种其他细胞过程。

幼虫成像室通过将定制的金属框架与两片盖玻片用胶粘合而成。图1A 中详细说明了金属框架的设计。成像室内的 Drosophila 幼虫借助紫外胶和PDMS立方块固定在上方的盖玻片上。PDMS立方块上的凹槽及其所附着的双面胶带共同形成容纳幼虫的空间（图1B,C）。PDMS同时施加轻微压力，以展平幼虫体壁并物理限制其运动。最后，在成像室底部放置一小片湿润的镜头纸以提供湿度。该装置可将 Drosophila 幼虫固定超过10小时，用于连续成像。大多数幼虫在10小时后仍存活，并可被回收继续发育至蛹期。该成像室最多可同时容纳九只幼虫。图1D 展示了在成像室内固定好的六只晚期三龄幼虫。幼虫躯干被固定，而头部和尾部仍可自由活动（图1E 和 视频S1）。该方法已成功用于对二龄至游走期三龄幼虫进行长达15小时的连续高分辨率成像。该...

本方案描述了一种安装方法 果蝇 幼虫，以实现对完整活体动物超过10小时的连续延时成像。该方法可用于成像靠近幼虫体壁的多种生物学过程。

LarvaSPA：一种幼虫固定方法 果蝇 用于长期延时成像的幼虫

活体成像是研究细胞生物学问题的一种有价值的方法。果蝇幼虫特别适合进行体内活体成像，因为……

LarvaSPA 是首个能够对完整的黑腹果蝇幼虫进行超过10小时连续活体成像的方法，具有高时间分辨率和空间分辨率。该方法可用于揭示幼虫外周感觉神经元的动态细胞过程，并可用于研究发生在幼虫体壁附近的多种其他细胞过程。该方法操作简便，对幼虫尺寸的限制较少。可同时将六至九只幼虫固定在成像室中，从而实现该实验。PDMS 立方体上的成像室可低成本制备，且可重复使用。该方法特别适用于利用果蝇幼虫的树突型授权神经元研究树突发育与树突退化的机制。能够对同一个神经元进行数小时的成像，可以揭示树突模式的长期全局性变化是如何从单个分支水平的短期行为产生的。使用与幼虫尺寸相匹配的PDMS立方体可提高幼虫固定的成功率。请在我们的故障排除部分查找更多有用的胶带信息。从机加工车间制备铝块后，使用长条形盖玻片和紫外胶将金属框架底部密封。用手持式紫外灯照射30秒，使紫外胶固化。在矩形培养皿或圆形细胞培养板的内表面粘贴多层包装胶带。使用一层胶带用于二龄幼虫，两层胶带用于早期三龄幼虫，或三层胶带用于晚期三龄幼虫。用剃刀刀片将胶带切成特定宽度的条状，单层胶带宽度为1.5毫米，双层或三层胶带宽度为2毫米。两条胶带之间至少留出5毫米的间距。移除覆盖空间的胶带层。使用胶带清除平板内表面的灰尘。此后，模具即可用于实验。制备PDMS混合物时，将7克PDMS基质与0.7克固化剂在小容器中充分混合。将容器置于真空干燥器中至少15分钟，以去除混合物中的气泡。缓慢将约5.5克PDMS混合物倒入模具中，使其厚度达到1至2毫米。将PDMS混合物再次放入真空干燥器中至少15分钟，以去除混合物中残留的气泡。用移液器吸头刺破最后残留的几个气泡。将PDMS置于平坦表面，在65摄氏度的恒温培养箱中固化两小时。接下来，使用剃刀刀片沿模具边缘松动固化的PDMS，并将其从模具上剥离。将PDMS置于两片大面积粘性胶带之间，在室温下保存。对于早期和晚期三龄幼虫，将PDMS切割成8个长、宽、高分别为2毫米、2毫米、1毫米的长方体，切割时应将胶带条形成的凹槽置于长方体长边的中心位置。对于二龄幼虫，将立方体切割为 8 × 1 × 1 毫米。为准备用于固定的上层盖玻片，选择六个带有与幼虫尺寸相匹配凹槽的 PDMS 立方体。使用胶带去除 PDMS 表面的灰尘。在尺寸为 22 × 50 毫米的长条形盖玻片上，粘贴四段尺寸为 12 × 5 毫米的双面胶，用于后续固定 PDMS 立方体。调整每两段双面胶之间的间距，使其与 PDMS 凹槽的宽度相同。在每个 PDMS 立方体的凹槽内加入一滴紫外固化胶，并在盖玻片上双面胶之间的区域滴加六小滴紫外固化胶。为准备幼虫的封片，使用一对镊子将幼虫在水中清洗，以去除体表附着的食物残渣。将清洗干净的幼虫置于一小片湿润的滤纸片上，放入无盖的小培养皿中，并将该小培养皿放入一个较大的培养皿内，大培养皿中放置一片干燥的滤纸。在化学通风橱中，使用塑料移液器将160至240微升异氟烷滴加到干燥的滤纸上，然后盖上大培养皿的盖子。在观察幼虫的同时等待两到三分钟。一旦其口钩停止活动，立即将幼虫从大型培养皿中取出。将已固定的幼虫放置在盖玻片的双面胶之间的紫外胶上，使背表皮朝向盖玻片。用 PDMS 块覆盖每只幼虫，并将幼虫的躯干嵌入 PDMS 的凹槽中。使幼虫的头部和尾部露在 PDMS 凹槽之外。避免胶水堵塞幼虫的气门。将PDMS块的两端按压到双面胶带上，注意不要对沟槽施加压力。轻轻拉拽幼虫尾部，使表皮在PDMS下展平。佩戴护目镜，并使用手持式紫外灯在高功率模式下照射四分钟，以固化紫外胶。将盖玻片翻转，使用紫外灯照射紫外胶，再固化四分钟。在成像室底部放置一片尺寸为15乘以30毫米的镜头纸。用20至30微升水润湿纸片。将盖玻片放置在样品腔上，使幼虫朝向腔内。使用紫外胶将盖玻片两端粘附在金属表面。幼虫的背侧已准备好用于共聚焦显微镜成像。成像后，使用镜头纸去除顶盖玻片上的油。用刀片切割盖玻片与金属框之间的缝隙，将顶盖玻片从金属框上取下。成像室即可准备重复使用。用镊子将PDMS立方体从顶部盖玻片上取下。将PDMS立方体在粘性胶带上滚动，以去除胶残留物和灰尘。PDMS立方体即可重复使用。在此方案中，果蝇幼虫被固定超过10小时以进行连续成像。该图显示了六只晚期三龄幼虫被安置在成像室中。幼虫的躯干部分被固定，而头部和尾部仍可自由活动。在此，我们展示了利用四型da神经元作为模型，应用LarvaSPA研究神经元树突动态及树突退化的实验方法。使用该方法固定幼虫时，关键在于一旦幼虫口钩停止运动即停止异氟烷暴露，并在幼虫完全苏醒前完成紫外胶的固化。为研究树突的退化与再生，可在幼虫固定于成像室后进行激光损伤操作。LarvaSPA 已帮助我们理解动态生长的树突为何无法像肝细胞蛋白聚糖那样支配表皮细胞，以及在激光损伤后退化树突上磷脂酰丝氨酸如何暴露。使用紫外灯时，请佩戴安全眼镜以保护眼睛。使用异氟烷击倒幼虫时，应在通风橱中进行。

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LarvaSPA，一种用于长期延时成像的安装果蝇幼虫的方法

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介观荧光断层成像技术 体内 发育过程成像 果蝇

本方案描述了一种对完整的黑腹果蝇（Drosophila...

体内成像完整果蝇幼虫的亚细胞分辨率研究

来源： Hellerman, M. B., 等 活体成像 果蝇 蛹期复眼 视频实验杂志 (2015)该视频展示了一种用于研究黑腹果蝇（Drosophila...

活体成像的 果蝇 使用荧光显微镜观察蛹眼

本文展示了一种利用快速扫描共聚焦显微镜透过蛹壳直接成像细胞行为的方法。通过保持蛹壳完整，该方法能够在果蝇发育的某一难以直接研究的阶段，实现对动态细胞过程的观察与测量。...

透过黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）蛹壳进行成像

本文介绍一种简单且易于实现的显微成像技术，用于从侧向获取高质量的 Drosophila...

从侧向视角获取高质量的 Drosophila 幼虫及成虫行为数字视频

本方案介绍了一种高效成像活体样本的方法 果蝇...

活体成像 果蝇 蛹期复眼

本方案详细描述了一种用于长期培养的实验方法 离体 培养与活体成像 果蝇...

长期活体成像 果蝇 眼盘

本文介绍了一种在高时空分辨率下对活体样本进行伤口修复及伴随的炎症反应实时成像的实验方案 在体该方法利用果蝇的蛹期阶段 果蝇...

长期 活体成像 炎症细胞动态的追踪 果蝇 蛹

在此，我们描述了用于在活体样本中成像高度运动性树突丝状伪足的方法 黑腹果蝇...

延时活体成像及快速树突分支动态在发育期 Drosophila 神经元中的定量分析

光片荧光显微镜是发育生物学中最有价值的工具。在比较研究中，一个主要问题是环境变异。我们的实验方案描述了一种可同时对多个样本进行活体成像的实验框架，从而主动解决了这一问题。...

基于样品腔的光片荧光显微镜中对多个昆虫胚胎进行同步活体成像

本文介绍了一种在蛹期对Drosophila腿部进行长期活体成像的实验方案，涉及完全去除蛹壳。该方案也可应用于其他组织。...

长期活体成像 黑腹果蝇 去除蛹壳后的蛹腿发育

了解LarvaSPA技术，一种利用PDMS立方体固定果蝇幼虫进行超过10小时连续活体成像的方法，用于研究外周感觉神经元的树突发育与退化动态过程。该技术具有高时空分辨率、成本低且可重复使用的优势。

LarvaSPA：一种幼虫固定方法果蝇用于长期延时成像的幼虫

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