LarvaSPA：一种幼虫固定方法 果蝇 用于长期延时成像的幼虫

LarvaSPA 是首个能够对完整的黑腹果蝇幼虫进行超过10小时连续活体成像的方法，具有高时间分辨率和空间分辨率。该方法可用于揭示幼虫外周感觉神经元的动态细胞过程，并可用于研究发生在幼虫体壁附近的多种其他细胞过程。该方法操作简便，对幼虫尺寸的限制较少。

可同时将六至九只幼虫固定在成像室中，从而实现该实验。PDMS 立方体上的成像室可低成本制备，且可重复使用。该方法特别适用于利用果蝇幼虫的树突型授权神经元研究树突发育与树突退化的机制。

能够对同一个神经元进行数小时的成像，可以揭示树突模式的长期全局性变化是如何从单个分支水平的短期行为产生的。使用与幼虫尺寸相匹配的PDMS立方体可提高幼虫固定的成功率。请在我们的故障排除部分查找更多有用的胶带信息。

从机加工车间制备铝块后，使用长条形盖玻片和紫外胶将金属框架底部密封。用手持式紫外灯照射30秒，使紫外胶固化。在矩形培养皿或圆形细胞培养板的内表面粘贴多层包装胶带。

使用一层胶带用于二龄幼虫，两层胶带用于早期三龄幼虫，或三层胶带用于晚期三龄幼虫。用剃刀刀片将胶带切成特定宽度的条状，单层胶带宽度为1.5毫米，双层或三层胶带宽度为2毫米。两条胶带之间至少留出5毫米的间距。

移除覆盖空间的胶带层。使用胶带清除平板内表面的灰尘。此后，模具即可用于实验。

制备PDMS混合物时，将7克PDMS基质与0.7克固化剂在小容器中充分混合。将容器置于真空干燥器中至少15分钟，以去除混合物中的气泡。缓慢将约5.5克PDMS混合物倒入模具中，使其厚度达到1至2毫米。

将PDMS混合物再次放入真空干燥器中至少15分钟，以去除混合物中残留的气泡。用移液器吸头刺破最后残留的几个气泡。将PDMS置于平坦表面，在65摄氏度的恒温培养箱中固化两小时。

接下来，使用剃刀刀片沿模具边缘松动固化的PDMS，并将其从模具上剥离。将PDMS置于两片大面积粘性胶带之间，在室温下保存。对于早期和晚期三龄幼虫，将PDMS切割成8个长、宽、高分别为2毫米、2毫米、1毫米的长方体，切割时应将胶带条形成的凹槽置于长方体长边的中心位置。

对于二龄幼虫，将立方体切割为 8 × 1 × 1 毫米。为准备用于固定的上层盖玻片，选择六个带有与幼虫尺寸相匹配凹槽的 PDMS 立方体。使用胶带去除 PDMS 表面的灰尘。

在尺寸为 22 × 50 毫米的长条形盖玻片上，粘贴四段尺寸为 12 × 5 毫米的双面胶，用于后续固定 PDMS 立方体。调整每两段双面胶之间的间距，使其与 PDMS 凹槽的宽度相同。在每个 PDMS 立方体的凹槽内加入一滴紫外固化胶，并在盖玻片上双面胶之间的区域滴加六小滴紫外固化胶。

为准备幼虫的封片，使用一对镊子将幼虫在水中清洗，以去除体表附着的食物残渣。将清洗干净的幼虫置于一小片湿润的滤纸片上，放入无盖的小培养皿中，并将该小培养皿放入一个较大的培养皿内，大培养皿中放置一片干燥的滤纸。在化学通风橱中，使用塑料移液器将160至240微升异氟烷滴加到干燥的滤纸上，然后盖上大培养皿的盖子。

在观察幼虫的同时等待两到三分钟。一旦其口钩停止活动，立即将幼虫从大型培养皿中取出。将已固定的幼虫放置在盖玻片的双面胶之间的紫外胶上，使背表皮朝向盖玻片。

用 PDMS 块覆盖每只幼虫，并将幼虫的躯干嵌入 PDMS 的凹槽中。使幼虫的头部和尾部露在 PDMS 凹槽之外。避免胶水堵塞幼虫的气门。

将PDMS块的两端按压到双面胶带上，注意不要对沟槽施加压力。轻轻拉拽幼虫尾部，使表皮在PDMS下展平。佩戴护目镜，并使用手持式紫外灯在高功率模式下照射四分钟，以固化紫外胶。

将盖玻片翻转，使用紫外灯照射紫外胶，再固化四分钟。在成像室底部放置一片尺寸为15乘以30毫米的镜头纸。用20至30微升水润湿纸片。

将盖玻片放置在样品腔上，使幼虫朝向腔内。使用紫外胶将盖玻片两端粘附在金属表面。幼虫的背侧已准备好用于共聚焦显微镜成像。

成像后，使用镜头纸去除顶盖玻片上的油。用刀片切割盖玻片与金属框之间的缝隙，将顶盖玻片从金属框上取下。成像室即可准备重复使用。

用镊子将PDMS立方体从顶部盖玻片上取下。将PDMS立方体在粘性胶带上滚动，以去除胶残留物和灰尘。PDMS立方体即可重复使用。

在此方案中，果蝇幼虫被固定超过10小时以进行连续成像。该图显示了六只晚期三龄幼虫被安置在成像室中。幼虫的躯干部分被固定，而头部和尾部仍可自由活动。

在此，我们展示了利用四型da神经元作为模型，应用LarvaSPA研究神经元树突动态及树突退化的实验方法。使用该方法固定幼虫时，关键在于一旦幼虫口钩停止运动即停止异氟烷暴露，并在幼虫完全苏醒前完成紫外胶的固化。为研究树突的退化与再生，可在幼虫固定于成像室后进行激光损伤操作。

LarvaSPA 已帮助我们理解动态生长的树突为何无法像肝细胞蛋白聚糖那样支配表皮细胞，以及在激光损伤后退化树突上磷脂酰丝氨酸如何暴露。使用紫外灯时，请佩戴安全眼镜以保护眼睛。使用异氟烷击倒幼虫时，应在通风橱中进行。