建立一种用于 Clostridioides difficile 的幼年斑马鱼感染模型

该方法可以解答关于先天免疫系统在梭菌感染中作用的关键问题，例如巨噬细胞是否以及如何识别或吞噬该病原体。该方法的主要优势在于，它可应用于多种不同的厌氧细菌，感染时间可以人为调控，并且口服给药方式更接近于人类自然感染过程。培养后，取一毫升培养物转移至分光光度计比色皿中，测定OD600。

将所需量转移至新的1.5毫升离心管中，使最终体积为1毫升时的OD值达到1至1.2。用1毫升1×PBS洗涤一次，在室温下以5,000 × g离心3分钟。用1毫升1×PBS重悬。

向1毫升细菌悬液中加入3微升制备好的荧光染料工作液。将样品在室温避光条件下孵育15分钟。随后，用1×PBS洗涤染色后的艰难梭菌一次，以去除残留染料，并将菌体重悬于1毫升1×PBS中，使OD600达到1.0。

首先，在培养皿中的斑马鱼幼鱼上滴加一滴 0.8% 低熔点琼脂糖，使其完全覆盖。轻轻调整幼鱼至侧卧位置。将培养皿置于冰上 30 至 60 秒，使低熔点琼脂糖凝固。

加入含 0.02% 至 0.04% 三卡因的 30% Danieau 培养基，以覆盖琼脂糖。为制备注射液，将 1 微升含 0.5% 酚红的 PBS 溶液加入 9 微升染色的艰难梭菌接种物中。使用 Microloader 将注射液吸入校准过的显微注射针中。

将装好样品的针头安装到显微操作仪上，并置于体视显微镜下。调节注射压力至600至900百帕之间。设定注射时间为0.1至0.3秒，以获得0.5至1.0纳升的注射体积。

将显微操作仪上的针头调整至大约45度角，指向包埋的幼虫。将针尖置于消化道上方，靠近泌尿生殖孔的位置。用针尖刺穿琼脂糖，然后刺入肌肉。

然后将其插入肠腔，并注射 0.5 至 1.0 纳升的 Clostridioides difficile。使用荧光显微镜监测注射后的幼虫，并用柔性 Microloader 吸头挑取注射正确的幼虫用于共聚焦成像。在含有凹槽的 1.5% 琼脂糖平板上，滴加一滴 0.8% 低熔点琼脂糖覆盖斑马鱼幼虫。

轻轻调整幼鱼，使其头部朝上呈45度角置于凹槽中，尾部紧贴凹槽壁。轻柔地将针头穿过琼脂糖，进入斑马鱼幼鱼的口部，并通过食道。当针尖进入前肠膨大部后，按压注射踏板，释放0.5至1纳升的细菌培养液。

填充肠道管腔，避免液体从食管或泄殖腔溢出。轻轻将针头从斑马鱼的口中抽出。

灌胃后，使用柔软的Microloader吸头先切开琼脂糖，然后提起感染的斑马鱼幼鱼，将其从琼脂糖中取出。将这些幼鱼转移至无菌的30% Danieau培养液中，并清洗两次。在麻醉斑马鱼幼鱼后，加入200至300微升1%低熔点琼脂糖，以覆盖麻醉后的幼鱼。

尽可能将幼虫的感染区域紧贴玻璃载片。将琼脂糖在冰上固定 30 至 60 秒。将琼脂糖浸入含有 0.02% 至 0.04% 三卡因的 30% Danieau's 培养基中。

使用共聚焦激光扫描显微镜对幼鱼进行成像。在处死感染的斑马鱼幼鱼后，将一根针插入斑马鱼幼鱼头部附近的背部主干部位以固定斑马鱼。用采血针在鳃后方切除头部。

将第二根针插入斑马鱼背部躯干的中部。将第三根针插入斑马鱼的腹部，并将肠道从体腔中拉出。使用显微注射针将10至15条肠道转移至含有200微升无菌1X PBS的1.5毫升离心管中。

使用研杵充分研磨肠道组织，以破坏组织并制备匀浆。确保研杵触及管底，以彻底破坏所有肠道组织。向匀浆中加入含有D-环丝氨酸和头孢西丁的艰难梭菌培养基，可选择性添加牛磺胆酸盐，并在厌氧培养箱中进行孵育。

在本研究中，中性粒细胞和巨噬细胞均到达感染部位。一个活化的巨噬细胞吞噬两个细菌的示例展示了通过吞噬作用和消化清除标记的艰难梭菌（Clostridioides difficile）。在受精后五天，通过微灌胃将荧光标记的艰难梭菌（Clostridioides difficile）递送至巨噬细胞和中性粒细胞报告品系的肠腔内，模拟了艰难梭菌（Clostridioides difficile）感染的自然途径。

然而，中性粒细胞和巨噬细胞在显微灌胃后长达12小时内并未表现出向胃肠道明显的迁移。与此同时，标记的艰难梭菌荧光在显微灌胃后约5小时消失。感染后24小时的肠道样本被分离，结果显示细菌生长。

对照组中未见细菌生长。在较晚的时间点，只有在含有TCA的培养基中孵育的样品有细菌生长，表明肠道中总的艰难梭菌已形成芽孢。16S rDNA PCR鉴定出所培养的细菌为艰难梭菌，其可产生大小约为800个碱基对的特异性PCR扩增产物。

在CHROMID平板上培养的细菌菌落呈典型的黑色，进一步表明这些来自斑马鱼肠道的细菌为艰难梭菌。操作厌氧菌时，需尽量缩短有氧步骤的时间，因为这自然会影响细菌的生物学特性。斑马鱼的天然免疫细胞可被操控。

例如，他们可以解析先天免疫细胞对感染的反应机制。我们的方法表明，斑马鱼可作为研究人类肠道厌氧病原体的工具。操作多重耐药病原体时，必须采取适当的安全防护措施。