使用全载免疫作用化学和三维重建对咽弓动脉的可视化与分析

此方法允许每个咽拱门被分割。然后，每个拱门中都可以量化内皮细胞数，作为研究咽状拱状动脉发育的一种手段。这种方法的主要优点是能够可视化不同血管结构之间的关系，以及定量确定结构如何影响突变体的能力。

主动脉在先天性心脏病中通常发生变异。我们的方法允许研究突变如何改变血管形成和重塑的生理过程。虽然我们使用这种方法来深入了解先天性心脏病的机制，但它可以应用于其他系统，特别是随着光片显微镜的出现。

首先使用玻璃移液器将每只小鼠胚胎日9.5或10.5胚胎移植到含有1毫升PBS的单个两毫升管子中。固定后，使用细钳小心地捏紧胚胎，然后做横向切切，取出胚胎的后半部分。要渗透胚胎，请用PBST替换PBS，并在一夜之间将胚胎在4摄氏度下轻轻搅拌。

第二天，用600微升的阻尼缓冲液代替PBST，无需接触胚胎，在4摄氏度下用温和的搅拌进行16至18小时的孵育。第二天早上，用每管感兴趣的主要抗体的600微升替换阻塞缓冲液，在4摄氏度下用温和的搅拌进行4至5天的孵育。在孵育结束时，在PBST的一毫升中清洗胚胎4至5小时，在室温下温和搅拌，每小时改变PBS，随后在4摄氏度的新鲜PBST中过夜孵育，第二天再用4至5小时洗涤。

最后一次洗涤后，用600微升适当的二次抗体溶液更换每个管中的PBST，在4摄氏度下进行4至5天的孵育。在孵化结束时，将胚胎洗涤至每洗一毫升新鲜PBST，并使用玻璃移液器轻轻地将每个胚胎移植到单独的塑料石蜡模具中。小心地从每个胚胎周围取出任何PBST，将每个胚胎定向到下垂位置。

然后快速添加约500微升的热阿加罗斯到每个模具，直到每个胚胎刚刚覆盖，并放置在冰上覆盖着铝箔的模具，直到阿加罗斯已经凝固。对于胚胎样本的脱水，使用干净的手术刀在每个胚胎周围切割一块黄糖，并使用钳子抓住黄糖转移到含有一毫升25%甲醇的两毫升管中。在黑暗中轻轻搅拌一小时后，用每管50%甲醇的一毫升代替25%甲醇，在黑暗中再孵育一小时。

脱水结束后，用一毫升50%的甲醇代替100%甲醇，在黑暗中轻轻搅拌一小时。在孵育结束时，将 50%BABB 替换为每管 100%BABB 的 1 毫升，在黑暗中轻轻搅拌一小时，然后用 100% BABB 进行第二次孵育，正如刚刚证明的。要安装胚胎进行成像，请从快速井保险杠上取下粘合剂，将保险杠放在 24 由 6 毫升数 1.5 玻璃盖玻片上。

向粘合剂施加温和压力，以去除盖玻片和保险杠之间的任何气泡，并小心地将 100%BABB 从每个管中丢弃。然后使用细钳小心地将胚胎移植到快速井中，而不接触胚胎，并在保险杠上放置第二个盖玻片。要在整个第三咽拱中显示内皮，请打开软件中感兴趣的图像，然后单击添加新表面。

双击曲面 1，将新曲面重命名为第三个咽拱。选择跳过自动创建，手动编辑，并设置到 YZ 平面的表面方向。使用切片位置将第三个咽拱形表面平面放置到第三个 PAA 和后大干道连接的位置。

旋转图像，使第三个咽形拱形表面平面在视图中并关闭正交切片器。在绘制轮廓模式下，选择距离绘制模式功能并根据需要调整参数设置。设置所有参数后，按 Escape 键并单击绘制以使用鼠标光标跟踪第三个咽拱的周长。

然后使用切片位置移动 10 到 25 个切片，并跟踪咽拱的周长。跟踪整个拱门后，单击"创建曲面"以生成跟踪区域的表面。要蒙版结构，请在编辑菜单中选择第三个 PAA 和 DAPI 的蒙版选择，然后单击"确定"。然后将新通道重命名为 PAA DAPI。

对其余通道重复此步骤。要将内皮丛与 PAA 分开可视化，请选择第三个 PAA 的蒙版选择，然后选择 DAPI。取消选中曲面外部的体素，并选中曲面内的选名体。

将曲面内的选择体素设置为零，然后单击"确定"。将新通道重命名为非 PAA DAPI。对其余通道重复此步骤。为第三个 PA 选择蒙版选择，然后选择非 PAA DAPI，然后单击"确定"。将新通道重命名为丛达皮。

对其余通道重复此步骤。要量化每个感兴趣结构中的单个内皮细胞，在显示调整面板中，请关闭除 PAA ERG 通道之外的所有通道。在属性菜单下，单击"添加新点"并单击以重命名点内皮单元格总数一个 PAA 总数。

单击蓝色箭头，然后选择源通道的 PAA ERG 通道。将估计的 XY 直径调整为四微米，然后单击蓝色箭头以进入下一个面板。使用滑动刻度调整斑点数，以确保每个 ERG 正内皮细胞核由一个点表示。

接下来，单击绿色双箭头并关闭显示调整面板中的 PAA ERG 通道。打开 PAA VEGFR2 通道以可视化 PAA 内皮，然后单击编辑和添加/删除以选择对象表面。然后按"转义"并按住 Shift 以删除所有不是 VEGFR2 正点的点，然后单击统计选项卡以确定内皮单元格的总数。

全安装免疫荧光产生清晰、干净的结果，使咽拱内皮的三维重建。在此图像中，大亮点的存在是抗体或阻塞缓冲液中颗粒物的结果。在咽拱和PAA表面染色后，使用掩膜功能可以直观地分离表面区域并独立分析。

掩蔽还允许对每个结构中的内皮细胞数进行单独的分析和定量。例如，此处使用点特征来量化 PAA 和丛中的内皮细胞总数，为每个表示 ERG 的核分配一个点。在此图像中，可以观察到由点函数生成的 ERG 正 VEGFR2 负点。

因此，必须验证软件识别的每个点是否实际表示单个内皮单元格。为了获得清晰和清晰的图像，请记住旋转所有溶液，并在抗体孵化后正确彻底地清洗每个胚胎。重要的是要记住，BABB具有腐蚀性和毒性。

正确处理和丢弃溶剂，确保完全密封熔化的胚胎，防止 BABB 泄漏。