使用Chromagnon在超分辨率生物成像时代高精度校正三维色差

石珊瑚的显微图像在三个维度上存在色差，这会影响高分辨率图像的共定位分析。通常难以消除由生物样本本身引起的色差，而我们的方法能够利用单独获取的参考图像来校正生物样本中的色差。

演示该实验步骤的是我团队的技术员 Takako Koujin。首先，在35毫米玻璃底培养皿中接种2.5 × 10⁵个愈合细胞，并将其置于二氧化碳培养箱中培养。培养24小时后，用2 mL含3.7%甲醛的PBS溶液替换培养基，并轻轻混匀。

在室温下于旋转平台上固定样品15分钟。用2 mL PBS洗涤细胞3次，每次5到10分钟。在旋转条件下，用含0.1% Triton X-100的PBS溶液2 mL对细胞进行透化处理10分钟，随后重复用PBS洗涤。

然后按照文稿中所述的标准抗体染色方案对细胞进行染色。为了获得宽场显微镜的串扰参考图像，向样本中加入两毫升浓度为0.5微克/毫升的Dappy以标记DNA。将细胞置于旋转平台上孵育30分钟。

然后用100微升封片剂替换溶液，以获得适用于各类显微镜（包括共聚焦显微镜和超分辨率显微镜）的生物学标定参考图像。按照先前所述方法固定细胞，并在1.5毫升甲醇中配制鬼笔环肽荧光染料的储备液。将鬼笔环肽加入PBS中稀释，Alexa Fluor 405按1:100稀释，Alexa Fluor 488按1:1000稀释，Alexa Fluor 594按1:200稀释。

向细胞中加入一毫升溶液，旋转孵育30分钟。用两毫升磷酸盐缓冲液洗涤细胞三至五次。然后将磷酸盐缓冲液替换为100微升封片介质。

使用宽场显微镜采集荧光图像时，将目标样本放置在显微镜上，在成像软件中打开实验设计和运行窗口，设置合适的Z步进值，并选择蓝色、绿色和红色通道。在“运行”选项卡中，添加图像文件名并开始成像。为测量样本中的色差而采集串扰参考图像时，仅选择Dappy的激发光，并确保使用与目标样本完全相同的载物台位置和Z高度。

或者，可使用明场图像作为参考，在宽场显微镜下将目标样本定位，并采集目标在蓝色、绿色和红色通道中的荧光图像。随后，在完全相同的载物台位置和相同的Z轴高度下，采集目标在蓝色、绿色和红色通道中的明场图像。若需使用超分辨率显微镜（如三维结构光照明显微镜，3D-SIM）采集荧光图像，请将目标样本置于显微镜上，并采集目标在蓝色、绿色和红色通道中的荧光SIM图像。

然后重建超分辨率图像。接下来，将使用多色鬼笔环肽染色的样本置于3D-SIM显微镜上，获取多个荧光SIM图像作为生物学校准参考图像，采集位置为点阶段的不同位置，随后重建超分辨率图像。

使用网络浏览器下载 Chromagnon 的最新二进制版本。解压程序并将可执行文件放置在便于访问的位置。将串扰右场或生物校准参考文件的参考文件拖放到参考框中，或单击参考文件以打开文件选择对话框。

如果程序提示安装 Java 开发工具包，请点击“是”，然后转到下载页面。根据说明下载并安装适用于操作系统的 JDK。将抗体染色的目标文件拖放到目标框中。

选择输出图像格式，并指定输出文件名的后缀。对于具有高信噪比的串扰参考图像，从局部对齐的选项列表中选择投影，并使用最小窗口大小为60。

对于多个生物标定参考图像，请勾选“平均参考”选项，并在局部对齐中选择“无”，然后点击“运行全部”以开始测量。为确保测量正确执行，将参考图像拖放到参考框和目标框中，运行程序并验证图像是否完全重叠。

在宽场显微镜中，可通过串扰参考图像进行色位移校正。该图像使用配备单个相机的宽场显微镜获得。利用Dappy的荧光发射作为参考，对蓝色、绿色和红色通道进行校正。

使用 Chromagnon 进行对齐后，色差和参考图像得到校正。当 Chromagnon 将对齐参数应用于目标图像时，DNA 和后期桥的结构在对齐前错误地位于核膜外，对齐后则如预期般位于核膜内。可利用生物学标定参考图像对 3D sim 图像进行色差校正。

对三张用蓝色、绿色和红色染料标记的鬼笔环肽染色的 HeLa 细胞的 3D sim 图像进行平均，并通过 Chromagnon 测量色差偏移。在对齐后，校正了色差偏移和参考图像。将对齐参数应用于目标图像。

XZ 视图显示通道在 Z 方向以及略微在 X 方向上位置不正确，校准后已得到纠正。为了获得最佳性能，重要的是在与目标图像相同的条件和时间下获取参考图像。