Name: 使用色马格龙的超分辨率生物成像时代3D色变的高精度校正 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 学习使用Chromagnon软件校正超分辨率显微镜三维色像差的方法。本研究以HeLa细胞为模型，通过参考图像实现荧光图像的精确对齐，提高共定位分析的准确性，为生物成像研究提供可靠的数据处理方案。

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本研究由日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金 JP19H03202（授予 A.M.）、JP18H05528 和 JP17H03636（授予 T.H.），以及 JP17H01444 和 JP18H05533（授予 H.Y.）资助。L.S. 感谢威康信托基金会（Welcome Trust）战略奖 091911 和 107457/Z/15/Z 对牛津微结构成像中心（Micron Oxford）先进成像技术的资金支持。

<ol><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+demystified%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy demystified.</a> Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).</li>
<li>Manders, E. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatic+shift+in+multicolour+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Chromatic shift in multicolour confocal microscopy.</a> Journal of Microscopy. 185 (3), 321-328 (1997).</li>
<li>Matsuda, A., Schermelleh, L., Hirano, Y., Haraguchi, T., Hiraoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+and+fiducial-marker-free+correction+for+three-dimensional+chromatic+shift+in+biological+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Accurate and fiducial-marker-free correction for three-dimensional chromatic shift in biological fluorescence microscopy.</a> Scientific Reports. 8 (1), 7583(2018).</li>
<li>Grünwald, D., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+labelled+endogenous+%CE%B2-actin+mRNA+during+nucleocytoplasmic+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of labelled endogenous β-actin mRNA during nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 467 (7315), 604-607 (2010).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li>
<li>Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Expansion microscopy.</a> Science. 347 (6221), 543-548 (2015).</li>
<li>Kraus, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+structured+illumination+microscopy+of+nuclear+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D structured illumination microscopy of nuclear structures.</a> Nature Protocols. 2, 1011-1028 (2017).</li>
<li>Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Far-Field+Optical+Nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Far-Field Optical Nanoscopy.</a> Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Schulz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+doubling+in+fluorescence+microscopy+with+confocal+spinning-disk+image+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Resolution doubling in fluorescence microscopy with confocal spinning-disk image scanning microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America. 110 (52), 21000-21005 (2013).</li>
<li>Müller, C. B., Enderlein, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Scanning+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Image Scanning Microscopy.</a> Physical Review Letters. 104 (19), 198101(1981).</li>
<li>Hayashi, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+superresolution+fluorescence+imaging+with+spinning+disk+confocal+microscope+optics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Ultrafast superresolution fluorescence imaging with spinning disk confocal microscope optics.</a> Molecular Biology of the Cell. 26 (9), 1743-1751 (2015).</li>
<li>Yorifuji, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerin%2C+deficiency+of+which+causes+Emery-Dreifuss+muscular+dystrophy%2C+is+localized+at+the+inner+nuclear+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">Emerin, deficiency of which causes Emery-Dreifuss muscular dystrophy, is localized at the inner nuclear membrane.</a> Neurogenetics. 1 (2), 135-140 (1997).</li>
<li>Woods, A., Sherwin, T., Sasse, R., MacRae, T. H., Baines, A. J., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+individual+components+within+the+cytoskeleton+of+Trypanosoma+brucei+by+a+library+of+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Definition of individual components within the cytoskeleton of Trypanosoma brucei by a library of monoclonal antibodies.</a> Journal of Cell Science. 93 (3), 491-500 (1989).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nature Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein+for+fusion+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein for fusion tags.</a> Nature Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li>
<li>Sawin, K. E., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivation+of+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Photoactivation of green fluorescent protein.</a> Current Biology. 7 (10), 606-607 (1997).</li>
<li>Elowitz, M. B., Surette, M. G., Wolf, P. E., Stock, J., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivation+turns+green+fluorescent+protein+red%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Photoactivation turns green fluorescent protein red.</a> Current Biology. 7 (10), 809-812 (1997).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

色度校正的流程需要在准确性和操作复杂性之间进行权衡。为了节省不必要的工作量，最好事先明确研究所需的准确程度。对于常规的宽场（活体）成像，通常不需要最高的准确性，因此使用明场参考图像往往足以校正色度偏移。同样地，当成像条件和环境保持恒定时，重复使用生物标定参考图像可节省时间。另一方面，如果需要实现高精度的图像配准，则必须使用高质量的串扰或生物标定参考图像。为了获得最佳校正效果，参考图像应尽可能在与目标图像相同条件下、同时获取。只要参考图像和目标图像均通过同一显微镜系统获取，更高的空间分辨率将有助于提高校正准确性。如果参考图像和目标图像均可进行去卷积处理，则在校正前实施去卷积可能进一步提升校正精度。此外，为了实现最佳性能，参考图像和目标图像文件均应满足光学（Z）轴的采样定理要求，以实现精确的亚像素插值（实验方案步骤 2.1.3）。
未能校正色差位移会导致错误的结论。此外，使用错误的校准方法甚至可能加剧色差位移而非纠正它，因此必须避免这种情况。我们已在表2中总结了可能的失败原因及其常见解决方案。要检查失败原因，首先需要直观地确认参考图像中的色差位移是否已精确校正（实验方案步骤3.12）。大多数失败是由于参考图像的质量问题所致，根据表2中的说明通常可轻松解决。关于参考图像的质量，需要注意的是，如果整个视场未被样本填满，则全局配准的准确性会下降（图7，表2）。与图7A所示的良好示例相比，图7B所示的不良示例仅在左上区域包含三个核膜，导致Chromagnon未能成功配准该图像的一部分。这是因为Chromagnon的全局配准方法将视场划分为四个区域（图7C），以高精度测量旋转和放大倍率的差异3。该方法若正确操作，其精度比其他线性方法（如对数极坐标变换和单纯形法）高出一个数量级3。如果四个区域中任一区域缺乏足够特征，则Chromagnon将切换至效果较差的线性方法。因此，为获得最佳性能，应避免出现图7B和图7C所示的情况，应确保四个区域均被足够多的结构填充。用户可通过查看日志文件（“Chromagnon.log”；见实验方案步骤3.10）来检查视场中是否存在无法用于测量的二次区域。幸运的是，通过平均多个生物学校准图像，或对串扰或明场参考图像使用局部配准，可轻松克服此问题（表2）。与参考图像校正失败的情况不同，目标图像校正失败更难识别。此类失败通常源于参考图像与目标图像之间在文件格式、成像条件、成像时间、成像/配准方法上的差异（表2），因此用户在使用与目标图像成像条件或时间不同的参考图像时应格外谨慎。部分示例图像可用于测试（<a href="https://github.com/macronucleus/Chromagnon" target="_blank">https://github.com/macronucleus/Chromagnon</a>），以帮助理解良好与不良示例图像的具体区别。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>问题</td>
			<td>原因</td>
			<td>解决方案</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>未能正确校正参考图像</td>
			<td>对比度低</td>
			<td>尽可能获取更高对比度的图像。如果使用明场参考图像，可尝试在水基溶液中重新采集图像以获得更高的细胞对比度。或者，尝试应用计算去噪方法（例如高斯滤波）。关闭局部对齐功能，因其对噪声更为敏感。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>无关图像的干扰</td>
			<td>若可能，移除样本中产生无关图像的来源。对于串扰参考图像，检查用于目标图像染料的激发光谱。如果染料在串扰图像采集过程中被激发（例如 Alexa Fluor 568 或 594），应考虑更换其他染料（例如 Alexa Fluor 555）。若相机芯片上的灰尘导致明显的通道差异，请清洁相机芯片或使用计算平场校正方法。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>宇宙射线导致的极亮斑点</td>
			<td>若可能，重新采集图像。或者，尝试应用计算去噪方法（例如中值滤波或高斯滤波）。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>去卷积伪影（轴向和侧向边缘处的人工信号）</td>
			<td>去卷积后裁剪边缘像素或Z层面。若裁剪一侧，另一侧也应相应裁剪，以保持图像中心位置不变。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Z步长过大</td>
			<td>应按照协议2.1.3所述，采集满足奈奎斯特准则的Z栈图像。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>光学像差</td>
			<td>球面像差是用户引起的最主要像差。应为样本选择合适的物镜，并使用厚度为170 µm的盖玻片。若物镜配备校正环，请调节校正环，找到焦点处荧光信号最强的位置。对于无校正环的油浸物镜，应调整浸油的折射率，以提高焦点处的荧光信号强度。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>视场未填满（图7）</td>
			<td>对于生物标定参考图像，应平均多幅图像。对于串扰或明场参考图像，使用局部对齐方法。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>未知的软件缺陷</td>
			<td>通过GitHub报告该问题（<a href="https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues" target="_blank">https://github.com/macronucleus/Chromagnon/issues)</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>未能正确校正目标图像</td>
			<td>图像文件的元数据丢失</td>
			<td>使用包含完整元数据的原始显微镜文件格式，避免在处理前转换为多页TIFF文件。使用与协议3.3中所述相同的通道顺序。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>所用显微镜的对齐方法错误</td>
			<td>从生物标定参考图像到目标图像的测量过程中，不应使用局部对齐方法。除宽场显微镜外，不应使用其他类型的串扰参考图像。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>成像条件存在差异</td>
			<td>应按照协议2.3.3所述，保持参考图像与目标图像之间的成像条件一致。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>样本差异（包括盖玻片）</td>
			<td>始终使用相同的封片介质、盖玻片（例如No. 1.5H）以及相近的焦深。</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>自上次校准以来显微镜发生漂移</td>
			<td>建议每两周至少进行一次校准。保持环境温度恒定，并使用防震台以避免显微镜硬件漂移。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：色差校正的故障排除。
<img alt="细胞分割对比：显微图像分析中的良好、较差和不理想结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig07.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 7"> 
图7：参考图像示例。 裂殖酵母细胞的核膜用GFP和mCherry标记。图像通过传统的宽场显微镜采集。使用Chromagnon软件对色差进行校正，未采用局部对齐，而是直接以图像本身作为参考图像。随后对图像进行去卷积处理以显示细节。(A) 视野中包含大量目标对象的良好示例。(B) 仅在图像左上角存在目标对象的较差示例，图像特定区域的错位现象明显。(C) 一个不理想的示例，其中四分之一区域（由虚线十字分隔）为空。A图中的比例尺表示全视野为5 µm，放大视图为1.25 µm，该比例尺适用于所有图像面板。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
在本方案中，我们描述了三种不同类型的参考图像（表1）。其中，串扰参考图像和生物校准参考图像需要进一步详细讨论。对于串扰参考图像，使用DAPI或Hoechst 33342染色并以甘油或商用封片剂封片的样品，可有效用于蓝、绿和红通道的对齐。类似地，Alexa Fluor 488可用于绿通道与红通道的对齐。然而，获取串扰荧光信号通常较为困难，因为除DAPI和Hoechst外，许多蓝色染料的亮度较低且衰减速度比大多数绿色和红色染料更快。此外，现代染料的发射光谱更窄，使得通过该方法对三个以上通道进行对齐变得具有挑战性。还应注意某些常见的红色染料（如Alexa Fluor 568和594，但不包括Alexa Fluor 555）可被紫光激发，这会妨碍从蓝色染料获得高对比度的串扰图像。另一个缺点是，该方法无法测量多色激发中激发光路的色差，因为激发时仅使用单一激发波长（表1）。由于大多数先进的显微镜采用改进的照明光学系统，该方法的应用受到限制。尽管如此，其较高的校正精度仍具有足够优势，因此在本方案中予以描述。通常情况下，应在获取目标图像后采集串扰图像，以避免光漂白或光毒性效应。对于在宽场模式下观察的SMLM，应在采集目标图像前获取参考图像，因为在成像过程中荧光染料可能发生漂白。
生物标定参考图像允许用户轻松对齐任意数量的通道，但需要额外的样品制备。生物标定参考图像的另一个优势是可对多个参考图像进行“平均”处理，有助于覆盖全部视野。如果标定样品制备在不同的载玻片上，则该方法可能受成像条件差异的影响。若将目标样品和参考样品均制备在同一张载玻片上（例如使用商用带腔盖玻片（表1）），并保持其他成像条件与方案步骤2.3.3中一致，则大部分问题可得以解决。在此情况下，可达到与串扰参考图像相似的校正精度3。如本方案所示，使用鬼笔环肽（phalloidin）是对单一细胞结构进行多色染色的最简便方法之一。制备生物标定样品存在多种可能的方案。对于免疫染色，可先用单一的一抗标记样品，再用多种颜色的二抗进行染色，从而实现对同一目标结构的多色标记。另一种方法是使用5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine），通过“点击化学”反应在高密度下对新合成的DNA进行多色标记，具体方法此前已有详细描述8。对于活细胞，可构建转基因菌株，使其携带两个拷贝的基因，分别与GFP或mCherry融合，以实现对同一结构的双色标记。若基因拷贝数至关重要（如常在膜蛋白中观察到的情况），则可将单个基因以串联方式同时与GFP和mCherry融合（图7）。光转化荧光蛋白（如mEOS218）也可用于此目的，通过施加适度强度的紫光照射，获得经光转化和未经光转化的两种蛋白。在低氧条件下，GFP也可作为可光转化蛋白，由绿色转化为红色19,20。因此，选择合适的标定样品将使实验更加稳健。

多色成像在生物荧光显微镜中是一个基本方面，尤其当不同分子或结构之间的空间关系是研究重点时。色差是一种由色散引起的多色光光学像差，会改变所关注的彩色物体的表观位置。类似地，配备多个相机分别采集各颜色通道的显微镜，由于光学元件的差异以及各通道之间未完全对齐，会产生更复杂的色差位移。因此，除非用户明确进行校正，此类色差位移可能导致错误结论。尽管在显微镜分辨率受限于经典分辨率极限的情况下，色差问题并不显著，但近年来超分辨率显微技术1的发展，促使人们需要对色差位移进行更精确的校正。
使用多色微珠校准载玻片来测量显微镜系统的色差位移是一种常见的做法2。基于微珠的校准方法适用于测量显微镜整个光学系统相对于盖玻片表面的色差位移2。然而，该方法无法测量感兴趣生物样本中的色差位移。需要注意的是，许多生物样本具有三维（3D）结构，其色差位移与盖玻片表面处的色差位移不同。此外，色差位移会随成像条件的变化而变化2,3。我们曾对三维生物样本中的色差位移进行测量，发现采用传统的多色微珠校准方法时，色差位移的不确定性通常可达350 nm3。因此，有必要在感兴趣的成像深度和实际使用的成像条件下，直接在生物样本中测量色差位移。
此处，我们介绍测量生物样品中色位移并使用我们的软件校正这些位移的方法。 Chromagnon3为了测量生物样本中的色度偏移，本方法使用两类数据集，一种 &#34;目标&#34; 图像和一个 &#34;参考文献&#34; 图像。该 &#34;目标&#34; 图像是感兴趣的多色图像，例如染色显示DNA、核膜和微管的图像。通常无法在此类图像中测量色差偏移，因此我们需要一个 &#34;参考文献&#34; 专门用于测量样品中色度偏移的图像。唯一的定义是一个 &#34;参考文献&#34; 图像是同一物体的多色图像。从这个意义上说，多色微球图像也是一种参考图像。本文描述了三种用于测量生物样品中色差的参考图像类型： &#34;串扰参考图像&#34;, &#34;明场参考图像&#34; 和 &#34;生物校准参考图像&#34;参考图像的类型取决于所使用的显微镜类型或所需的校正精度，如表中所示。 表1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>串扰</td>
			<td>明场</td>
			<td>生物学校准（在另一张载玻片上）</td>
			<td>生物学校准（在同一张载玻片上）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>准确性a</td>
			<td>+++</td>
			<td>+</td>
			<td>++b</td>
			<td>+++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>简便性</td>
			<td>++</td>
			<td>+++</td>
			<td>++</td>
			<td>++</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>适用的显微镜类型</td>
			<td>宽场</td>
			<td>宽场</td>
			<td>所有类型</td>
			<td>所有类型</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>局部校准的可用性</td>
			<td>+</td>
			<td>+</td>
			<td>-c</td>
			<td>-c</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">a：加号&#34;+&#34;的数量表示评分递增。单个加号对应约50 nm，三个加号对应约15 nm（三维条件下）。 
			b：准确性取决于成像条件变化的恒定程度。 
			c：可通过多种荧光微珠样品测量局部校准，方法如方案第4节所述。</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：选择参考图像类型时的参数。
&#34;串扰参考图像&#34; 具有最高的校正精度，且实现相对简单3,4（表1）。其缺点是由于无法测量激发光路中的色差位移，因此在显微镜应用中受到限制。此外，要获得此类图像，显微镜必须配备多波段二向色镜以及可独立于激发滤光片或光源进行控制的发射滤光片。适用的显微镜技术包括传统的宽场显微镜、单分子定位显微镜（SMLM），例如光激活定位显微镜/随机光学重建显微镜（PALM/STORM）5,6，以及通过宽场显微镜观察的扩展显微镜7。串扰参考图像是从目标样本本身获取的，即一种荧光染料在所有所需通道中产生的串扰（渗漏）荧光图像。荧光发射总是向更长波长方向扩展，因此需激发发射波长最短的染料，以在较长波长的通道中获得串扰荧光。例如，当样本被蓝色、绿色和红色染色时，仅激发蓝色染料，并在蓝色、绿色和红色通道中采集发射光信号。在本方案中，使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色的DNA来获取串扰荧光。
&#34;明场参考图像&#34; 是一种比 &#34;串扰参考图像&#34; 更简便且光毒性更低的替代方法，但其准确性最低3（表 1）。这些图像是目标样本的明场图像，通过采集目标图像所用的所有颜色通道获得。
&#34;生物标定参考图像&#34;的优势在于其适用于任何类型的显微镜，因为它能够测量激发和发射光路中的色差3,8（表1）。适用的显微镜包括宽场显微镜、共聚焦显微镜、光片显微镜、受激辐射损耗显微镜（STED）9、结构光照明显微镜（SIM）10、Airyscan/SORA11,12、在全内反射荧光（TIRF）模式下观测的单分子定位显微镜（SMLM）、奥林巴斯超分辨显微镜（OSR）13等。生物标定参考图像是从与目标样本制备方式相似的标定样本中获取的，但需对同一结构使用多种荧光染料进行染色。该方法的校正精度优于大多数超分辨显微镜的分辨率，且制备生物标定样本相对简单。另一个优势是可以对&#34;多个参考图像进行平均&#34;。因此，即使单个图像中包含的色差测量信息较少，通过多幅图像平均仍可提高信息含量。校正精度取决于成像条件保持恒定的程度。在这方面，当目标样本与参考样本位于同一载玻片上时性能最佳，例如使用8孔腔室盖玻片（表1，最右侧）。在本实验方案中，使用三种颜色的鬼笔环肽对肌动蛋白进行染色作为生物标定参考。
获得参考图像后，可使用我们的软件 Chromagnon 测量并校正色位移。Chromagnon 对可测量和校正色位移的通道数、Z 轴层数和时间帧数没有限制。Chromagnon 通过两个步骤测量色位移。第一步获取 X、Y、Z 轴方向的平移、X、Y、Z 轴方向的放大倍数以及绕 Z 轴旋转的&#34;全局&#34;或&#34;仿射&#34;配准参数。全局配准的计算精度在三维（3D）中约为 16 nm，在二维（2D）中约为 8 nm。第二步是在投影图像上进行可选的二维迭代&#34;局部配准&#34;，以获得更高的精度。在局部配准过程中，图像被划分为多个区域，并测量这些局部区域内的色位移。随后，区域被进一步细分，并迭代测量子区域中的色位移，直到区域内的像素数量达到最小像素数（通常为 60 × 60 像素）。生成的局部配准图与全局配准参数结合，并通过弹性变换应用于目标图像。完成此步骤后，计算精度提升至三维（3D）约 14 nm，二维（2D）约 6 nm。由于参考图像中的生物结构与目标图像中的生物结构不同，局部配准不适用于生物校准参考图像（表 1）。因此，对于生物校准参考图像，仅使用全局配准。
局部色差来源于两个方面：显微镜仪器的局部畸变和生物结构的不均一性。由于显微镜仪器的局部畸变是恒定的，因此可以通过多色微球参考样品进行测量，并作为固定参数予以校正。Chromagnon 可以整合显微镜仪器的局部畸变图和来自生物标定的全局对齐参数（表1）。采用该方法，预计生物标定的平均精度可进一步提高1−2 nm。
本文介绍了一种利用我们开发的软件Chromagnon对三维荧光图像中的色差位移进行校正的实验方案，涵盖从最基础到最高精度的各个级别。我们以HeLa细胞的免疫荧光染色为例，采用三维宽场显微镜和三维结构光照明显微镜（3D-SIM）进行观察。在第一部分中，我们描述了如何制备目标样本和生物学校准样本；该部分方案应根据具体研究目标进行优化。在第二部分中，我们介绍了通过显微镜获取三类参考图像的采集方法。默认获取蓝色、绿色和红色通道的图像，但具体通道组合应根据研究目标及显微镜配置进行调整。显微镜配备单个相机或多个相机均不影响本方法的适用性。在第三部分中，我们说明了如何利用本软件，结合参考图像对目标图像的色差位移进行测量与校正。最后，在第四部分中，我们介绍了一种利用显微镜仪器自身的局部校准功能来补充生物学校准参考图像的方法。

<table><tbody><tr><td>16% 甲醛溶液</td><td>Polyscience</td><td>18814-10</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 玻底培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 405 鬼笔环肽</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A30104</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 鬼笔环肽</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 鬼笔环肽</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>牛血清</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16170078</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Matsunami</td><td>No. 1S HT</td><td></td></tr><tr><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，二盐酸盐）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良伊格尔培养基（含 L-谷氨酰胺和丙酮酸钠）</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08458-16</td><td></td></tr><tr><td>封片剂（VECTASHIELD）</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗微管蛋白单克隆抗体（TAT1）</td><td></td><td></td><td>见参考文献15。</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II 多孔腔室载玻片（8 孔）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155409</td><td></td></tr><tr><td>兔抗emerin多克隆抗体（ED1）</td><td></td><td></td><td>由日本群马大学 Hiroshi Yorifuji 和日本国立神经与精神卫生中心 Kiichi Arahata 惠赠；已故。</td></tr><tr><td>偶联 Alexa Fluor 488 的二抗</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>偶联 Alexa Fluor 555 的二抗</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21424</td><td></td></tr><tr><td>偶联 Alexa Fluor 594 的二抗</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11032</td><td></td></tr><tr><td>TetraSpeck 微球，0.2 &amp;micro;m</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7280</td><td></td></tr></tbody></table>

使用chromagnon在超分辨率生物成像时代高精度校正三维色差

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

定量多色荧光显微镜技术依赖于在不同波长下获取的颜色通道之间精确的空间匹配。由于色差以及相机对准不完美，各通道所获取的图像可能在三个维度中的任意维度上发生位移、放大或旋转。传统的校准方法通过附着在盖玻片表面的多色微球来测量色差位移，已有多种软件可用于从此类校准样品中测量色差位移。然而，色差可能随成像深度变化，受观测条件影响，并可能由生物样本本身引起，从而阻碍对目标样本及整个成像体积中真实色差位移量的准确确定。在超分辨率显微镜中，更高精度的色差校正尤为重要，因为即使微小的色差也可能影响定量分析并改变对多色图像的解读。我们开发了一款开源软件Chromagnon及配套方法，用于测量和校正生物样本中的三维色差位移。本文提供了一个详细的应用方案，包括针对样本制备、数据采集和软件处理的特殊要求，以在目标生物样本中准确测量色差位移。

使用串扰参考图像进行色差校正的示例如图5所示。该图像通过配备单个相机的宽场显微镜获得。利用DAPI的荧光发射作为参考（图5A,B），对蓝色、绿色和红色通道进行校正。图像包含60个Z切片的3个通道，每个切片由256 × 256像素组成。在测量色差之前，图像已进行去卷积处理。在配备Intel Core i7（四核八线程，2.7 GHz）、16 GB内存和1 TB闪存存储的Mac计算机上，使用Chromagnon测量局部色差耗时51秒。将所得的配准参数应用于目标图像（图5C,D），该目标图像与参考图像具有完全相同的体素数量。生成配准后文件耗时3秒。由于在配准过程中裁剪了边缘像素（图1C中的crop margins复选框），配准后的体素数量减少（图5B，51个Z切片，252 × 251像素）。在配准前，后期桥（anaphase bridge）中的DNA（由箭头指示）错误地显示在核膜外侧（图5C，在显示XZ视图的下层面板中尤为明显）；而在配准后，DNA正确地位于核膜内侧（图5D）。
使用生物标定参考图像进行色差校正的示例如图6所示。图像由配备三个相机的SIM显微镜获取。对用蓝色、绿色和红色染料标记的鬼笔环肽染色的HeLa细胞采集的三幅图像进行了平均处理（图6A）。参考图像包含76个Z层切片的3个通道，每个切片由1,024 × 1,024像素组成。在上述Mac系统上，使用Chromagnon软件在未进行局部对齐的情况下测量色差耗时194秒。该参数被应用于一个包含73个Z层切片的3通道目标图像，每个切片由1,024 × 1,024像素组成。生成对齐后的文件耗时25秒。XZ视图显示通道在Z方向上存在明显位置偏差，在X方向上也有轻微偏差（图6A,C），但对齐后该错位现象得到校正（图6B,D）。
<img alt="细胞分析中的荧光显微镜校准过程；校准前后的视觉对比。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：使用串扰参考图像进行校准的示例。 HeLa 细胞用 DAPI 染色标记 DNA（显示为品红色），用 Alexa Fluor 488 标记核膜（显示为黄色），用 Alexa Fluor 555 标记微管（显示为蓝色）。图像通过单台相机的三维宽场显微镜采集，并进行去卷积处理。(A,B) 使用 DAPI 发射光获得的代表性串扰参考图像，在使用 Chromagnon 进行校准前后的对比。三个颜色通道以叠加方式显示。(C,D) 三维图像堆栈中一个光学切片在三个通道中校准前后的对比。箭头所示的后期桥接结构处的轴向色差明显可见。图 A 中的比例尺适用于所有图，长度为 5 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微镜校准对比；参考图像与目标图像；荧光成像结果；校准前/后。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60800/60800fig06.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：使用生物校准参考图像进行对齐的示例 图像通过配备三台相机的三维结构光照明显微镜（3D-SIM）获取。(A,B) 对三幅图像进行平均后得到的参考图像，分别为对齐前 (A) 和对齐后 (B)。HeLa细胞使用与Alexa Fluor 405、488或594偶联的鬼笔环肽染色。(C,D) 目标图像在对齐前 (C) 和对齐后 (D) 的结果。HeLa细胞用DAPI染色DNA（显示为品红色），Alexa Fluor 488标记核膜（显示为黄色），Alexa Fluor 594标记微管（显示为蓝色）。A图中的比例尺表示5 µm，适用于所有子图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60800/60800fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

在三维（3D）多色荧光显微图像中校正色差位移对于定量数据分析至关重要。本实验方案旨在通过获取合适的参考图像，并利用开源软件Chromagnon进行处理，以测量和校正生物样品中的色差位移。

使用Chromagnon在超分辨率生物成像时代高精度校正三维色差

定量多色荧光显微镜技术依赖于在不同波长下采集的各颜色通道之间的精确空间匹配。由于……

石珊瑚的显微图像在三个维度上存在色差，这会影响高分辨率图像的共定位分析。通常难以消除由生物样本本身引起的色差，而我们的方法能够利用单独获取的参考图像来校正生物样本中的色差。演示该实验步骤的是我团队的技术员 Takako Koujin。首先，在35毫米玻璃底培养皿中接种2.5 × 10⁵个愈合细胞，并将其置于二氧化碳培养箱中培养。培养24小时后，用2 mL含3.7%甲醛的PBS溶液替换培养基，并轻轻混匀。在室温下于旋转平台上固定样品15分钟。用2 mL PBS洗涤细胞3次，每次5到10分钟。在旋转条件下，用含0.1% Triton X-100的PBS溶液2 mL对细胞进行透化处理10分钟，随后重复用PBS洗涤。然后按照文稿中所述的标准抗体染色方案对细胞进行染色。为了获得宽场显微镜的串扰参考图像，向样本中加入两毫升浓度为0.5微克/毫升的Dappy以标记DNA。将细胞置于旋转平台上孵育30分钟。然后用100微升封片剂替换溶液，以获得适用于各类显微镜（包括共聚焦显微镜和超分辨率显微镜）的生物学标定参考图像。按照先前所述方法固定细胞，并在1.5毫升甲醇中配制鬼笔环肽荧光染料的储备液。将鬼笔环肽加入PBS中稀释，Alexa Fluor 405按1:100稀释，Alexa Fluor 488按1:1000稀释，Alexa Fluor 594按1:200稀释。向细胞中加入一毫升溶液，旋转孵育30分钟。用两毫升磷酸盐缓冲液洗涤细胞三至五次。然后将磷酸盐缓冲液替换为100微升封片介质。使用宽场显微镜采集荧光图像时，将目标样本放置在显微镜上，在成像软件中打开实验设计和运行窗口，设置合适的Z步进值，并选择蓝色、绿色和红色通道。在“运行”选项卡中，添加图像文件名并开始成像。为测量样本中的色差而采集串扰参考图像时，仅选择Dappy的激发光，并确保使用与目标样本完全相同的载物台位置和Z高度。或者，可使用明场图像作为参考，在宽场显微镜下将目标样本定位，并采集目标在蓝色、绿色和红色通道中的荧光图像。随后，在完全相同的载物台位置和相同的Z轴高度下，采集目标在蓝色、绿色和红色通道中的明场图像。若需使用超分辨率显微镜（如三维结构光照明显微镜，3D-SIM）采集荧光图像，请将目标样本置于显微镜上，并采集目标在蓝色、绿色和红色通道中的荧光SIM图像。然后重建超分辨率图像。接下来，将使用多色鬼笔环肽染色的样本置于3D-SIM显微镜上，获取多个荧光SIM图像作为生物学校准参考图像，采集位置为点阶段的不同位置，随后重建超分辨率图像。使用网络浏览器下载 Chromagnon 的最新二进制版本。解压程序并将可执行文件放置在便于访问的位置。将串扰右场或生物校准参考文件的参考文件拖放到参考框中，或单击参考文件以打开文件选择对话框。如果程序提示安装 Java 开发工具包，请点击“是”，然后转到下载页面。根据说明下载并安装适用于操作系统的 JDK。将抗体染色的目标文件拖放到目标框中。选择输出图像格式，并指定输出文件名的后缀。对于具有高信噪比的串扰参考图像，从局部对齐的选项列表中选择投影，并使用最小窗口大小为60。对于多个生物标定参考图像，请勾选“平均参考”选项，并在局部对齐中选择“无”，然后点击“运行全部”以开始测量。为确保测量正确执行，将参考图像拖放到参考框和目标框中，运行程序并验证图像是否完全重叠。在宽场显微镜中，可通过串扰参考图像进行色位移校正。该图像使用配备单个相机的宽场显微镜获得。利用Dappy的荧光发射作为参考，对蓝色、绿色和红色通道进行校正。使用 Chromagnon 进行对齐后，色差和参考图像得到校正。当 Chromagnon 将对齐参数应用于目标图像时，DNA 和后期桥的结构在对齐前错误地位于核膜外，对齐后则如预期般位于核膜内。可利用生物学标定参考图像对 3D sim 图像进行色差校正。对三张用蓝色、绿色和红色染料标记的鬼笔环肽染色的 HeLa 细胞的 3D sim 图像进行平均，并通过 Chromagnon 测量色差偏移。在对齐后，校正了色差偏移和参考图像。将对齐参数应用于目标图像。XZ 视图显示通道在 Z 方向以及略微在 X 方向上位置不正确，校准后已得到纠正。为了获得最佳性能，重要的是在与目标图像相同的条件和时间下获取参考图像。

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生物学

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