量化微图形化细胞中细胞外排的时空参数

本方案展示了如何利用TOF显微镜进行活体成像以研究细胞分泌，并提供了用于检测分泌物聚集事件或高活性区域的工具。通过本方案，我们可在微图案化表面培养细胞，使细胞分裂趋于一致，从而便于观察分泌事件的空间分布特征。细胞会分泌多种大分子物质，这些物质在免疫调节中发挥着重要作用。

在癌症中，分泌功能的失调会影响促进侵袭的蛋白水解酶的释放。对分泌过程进行定量分析将有助于我们更深入地理解癌症中异常的分泌现象以及其他动态过程，例如抗原呈递。尽管我们的成像与分析方案较为直接，但它需要生成能够在微图案表面充分铺展的单个细胞。

在本视频中，我们将演示如何在微图案盖玻片上培养细胞，以及如何利用空间统计工具对分泌事件进行可视化和分析。为微图案化准备盖玻片时，先将经乙醇灭菌的直径25毫米的玻璃盖玻片置于深紫外光下活化5分钟。在盖玻片活化的同时，在湿润 chamber 内的石蜡膜上，为每张盖玻片加入一滴30 µL的聚赖氨酸接枝聚乙二醇溶液。

激活结束后，将盖玻片的活化面朝下放置于液滴上，盖上湿盒，在室温下孵育一小时。孵育结束后，用蒸馏水洗涤盖玻片两次。在盖玻片干燥的同时，用蒸馏水清洗石英光掩模一次，再用酒精清洗一次。

用过滤的气流吹干光刻掩膜，并将镀铬面朝上的光刻掩膜暴露于深紫外光下照射五分钟。照射结束后，在每张光刻掩膜的镀铬面上滴加10 µL水滴，并将每个盖玻片的聚乙二醇面置于对应的水滴上。去除多余水分后，在载玻片上覆盖一层薄膜以防止脱水。

在向光刻掩模中加入过量水以去除盖玻片之前，将光刻掩模未镀铬的一侧额外暴露于深紫外光下照射五分钟。此步骤将在表面形成微图案印迹。随后，在层流罩内，将盖玻片置于湿润室中的石蜡膜上，并在细胞外基质蛋白溶液中孵育一小时。

将细胞接种到制备好的微图案表面时，在孵育结束时，将盖玻片放入磁性盖玻片架中，微图案面朝上，并立即向盖玻片上加入图案化培养基。加入密封圈后，使用磁性装置固定盖玻片，然后向盖玻片架中补充额外的图案化培养基。最后用玻璃盖板封闭盖玻片架。

当细胞准备就绪后，将5 × 10⁵个转染的永生化视网膜色素上皮细胞加入到盖玻片上，并将细胞置于培养皿中，在细胞培养箱中孵育10分钟。孵育结束后，使用一支移液枪吸除旧培养基，同时用另一支移液枪用新鲜培养基洗涤细胞，每次洗涤重复五次，以去除未贴壁的细胞及任何残留的胎牛血清。最后一次洗涤完成后，将培养皿放回培养箱中继续孵育3小时，以使细胞充分铺展。

为了成像胞吐事件，将盖玻片支架置于全内反射荧光显微镜下，寻找一个完全铺展且表达VAMP7-pHluorin的细胞。调整激光角度，直至达到能够观察到VAMP7-pHluorin胞吐事件的全内反射荧光角度，然后以与胞吐速率和时间尺度相匹配的频率进行五分钟的图像采集。为了获得胞吐事件的坐标，将采集到的胞吐事件视频在Fiji中打开，并通过观察向外扩散的明亮信号手动识别胞吐事件。

使用点工具标记胞吐事件的中心位置，并通过分析和测量功能获取其 x 和 y 坐标以及时间坐标。将一个细胞的测量结果保存在一个文本文件中。在电子表格中打开该文本文件，并删除除切片 x 和 y 坐标列之外的所有其他列。

接下来，使用椭圆工具进行测量，以确定每个细胞的中心位置和直径，并获取每个细胞的 x 和 y 坐标以及 Feret 直径。将所有细胞的测量结果保存在一个文本文件中。在电子表格中打开该文本文件，并仅保留 x 坐标、y 坐标和 Feret 直径三列，删除其余各列。

然后添加每个细胞的半径测量值，再根据每个细胞的Feret直径获取半径。使用直线工具测量每个细胞微图案环的厚度。将所有细胞的该测量值保存在一个文本文件中，然后用黏附长度除以细胞半径，计算归一化的黏附长度。

进行单细胞空间分析时，首先在 RStudio 中安装并加载该软件包。使用 ESA 函数运行该软件包，将打开一个用户界面，然后选择用于数据集 TXT 文件的目录以及用于输出图表的目录。

该脚本将自动启动并执行分析，生成相应图谱的 PDF 文件以及包含数值结果的 TXT 文件。在细胞内，探针的荧光信号因溶酶体的低 pH 环境而被淬灭；但在胞吐过程中，随着质子释放导致 pH 升高，pHluorin 开始发出荧光信号。pHluorin 信号在胞吐期间出现一个峰值，代表溶酶体质子的快速释放，随后信号呈指数衰减，反映探针在质膜上的二维扩散过程。

通常，转染的永生化人视网膜色素上皮细胞表现出重要的溶酶体分泌活性，平均胞吐速率为 0.28 赫兹。可通过核密度估计来可视化胞吐事件的二维分布，以揭示局部密度的差异。相对于完全空间随机性，可能存在三种偏离情况：聚集、分散，或聚集与分散的混合模式。

Ripley's K 函数可用于评估这些偏差。值得注意的是，非黏附区域的胞吐事件也呈簇状分布，这表明黏附分子并非唯一能在质膜上诱导分泌热点的结构。根据代表性细胞的模量绘制胞吐事件的直方图，可观察到在黏附区与非黏附区交界处附近出现一个峰值。

成对分析表明，黏附区域的表面密度低于非黏附区域，这可能是由于细胞周边胞吐作用显著减弱所致。将细胞在微图案上的黏附与统计分析相结合，有助于精确定位分泌等复杂细胞过程在空间上是如何被调控的。未来还需进一步研究以确定介导分泌活性聚集的分子机制。