Name: 定量微模式细胞细胞外细胞异细胞的时态参数 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: 了解如何使用TOF显微镜和微图案化技术对视网膜色素上皮细胞中的溶酶体胞吐作用进行时空定量分析。该方法有助于研究癌症和免疫调节中的分泌动态。

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我们非常感谢 Thierry Galli（精神病学与神经科学中心，法国国家健康与医学研究院）提供 VAMP7-pHluorin 质粒。感谢 Tarn Duong 在统计分析方面的建议，以及 GOUD 实验室成员富有成效的讨论。作者衷心感谢细胞与组织成像平台（PICT-IBiSA @Burg、PICT-EM @Burg 和 PICT-IBiSA @Pasteur）以及居里研究所（巴黎）尼康影像中心，该中心是法国国家研究基础设施法国生物成像（ANR10-INBS-04）的成员。H.L. 的研究得到了法国癌症研究协会（ARC）的支持，P.M. 获得了欧盟“地平线 2020”研究与创新计划玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里基金协议编号 666003 的资助。本研究还获得了 INFECT-ERA（ANR-14-IFEC-0002-04）、Labex CelTisPhyBio（ANR-10-LBX-0038）和巴黎科学与文学大学 Idex（ANR-10-IDEX-0001-02 PSL）的资助，以及法国国家科学研究中心和居里研究所的支持。&#160;

1. 微图形化细胞的制备
<ol>
	<li>细胞转染
	<ol>
		<li>转染前一天，将 2.5 × 106 个 hTERT-RPE1 细胞接种至 12 孔板（2 × 2 cm）的一个孔中，加入 1 mL 培养基。</li>
		<li>转染当天，用 VAMP7-pHluorin 质粒制备转染混合物（100 µL 缓冲液、0.8 µg DNA、3 µL 转染试剂），室温孵育 10 分钟。 
		注：VAMP7 是一种溶酶体 v-SNARE 蛋白，与腔内 pHluorin 标签融合。pHluorin 探针在低 pH 条件下荧光被淬灭，但在胞吐过程中质子释放，pH 升高，pHluorin 开始发出荧光信号10,11。</li>
		<li>将转染混合物直接加入细胞培养基中。</li>
		<li>转染混合物加入细胞后 4 小时更换培养基。</li>
		<li>在转染后的 24–48 小时内进行实验。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>微图案制备（光刻法）
	<ol>
		<li>用乙醇清洗盖玻片（直径 25 mm），室温干燥 5 分钟。</li>
		<li>用深紫外光照射盖玻片 5 分钟以活化其表面。</li>
		<li>通过将纸巾充分润湿并放置石蜡膜来构建一个湿润室。在纸巾上滴加 Poly-L-Lysine-graft-Polyethylene Glycol（PLL-g-PEG）溶液（0.1 mg/mL，10 mM HEPES，pH = 7.4），每片 22 mm 盖玻片加 30 μL。将活化后的盖玻片表面朝下置于液滴上，盖上湿润室盖子，孵育 1 小时。</li>
		<li>用 PBS 洗涤盖玻片两次，再用去离子水洗涤一次，然后使其干燥。</li>
		<li>用去离子水清洗石英光掩模，随后用乙醇或丙醇清洗，再用过滤后的气流吹干。 
		注：石英光掩模单面镀有抗反射铬层，其上具有微图案形状的孔洞。本实验方案使用直径为 37 µm 的环形微图案光掩模。当深紫外光照射时，光线仅能通过这些孔洞12。</li>
		<li>将光掩模（镀铬面）暴露于深紫外光下 5 分钟，以清洁表面。</li>
		<li>在光掩模的镀铬面滴加少量水滴（20 mm 盖玻片加 10 µL），将已处理 PLL-g-PEG 的盖玻片表面朝下贴附于水滴上，并吸除多余水分。确保光掩模与盖玻片之间无气泡产生。 
		注：水的毛细作用力可使盖玻片固定。</li>
		<li>将带有盖玻片的光掩模翻转，使非镀铬面朝上（盖玻片附着于下方表面），再进行 5 分钟深紫外光照射。 
		注：光线仅能通过孔洞，从而修饰位于光掩模下方的盖玻片上 PLL-g-PEG 处理区域的表面。</li>
		<li>通过加入过量水将盖玻片从光掩模上分离。 
		注：盖玻片应迅速浮起脱离。</li>
		<li>将盖玻片置于湿润室中的石蜡膜上，加入细胞外基质蛋白溶液（50 μg/mL 纤连蛋白，5 μg/mL 荧光标记纤维蛋白原，溶于去离子水），在层流罩中孵育 1 小时，防止污染。 
		注：此时可暂停实验，将盖玻片保存于 4 °C 的 PBS 中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在微图案化表面上接种细胞
	<ol>
		<li>使用与微图案化盖玻片尺寸匹配的磁性盖玻片支架固定盖玻片。在成像当天，将支架预热至 37 °C，以避免后续步骤中细胞受到热冲击。</li>
		<li>通过在 DMEM/F12 培养基中添加 20 mM HEPES 和 2% 青霉素/链霉素，制备图案化培养基。</li>
		<li>将盖玻片微图案面朝上放入支架中，一旦盖玻片置于支架底座上，立即加入图案化培养基。盖上密封圈，并用磁性装置固定。向支架中充满图案化培养基，最后盖上玻璃盖板。 
		注：操作应迅速，防止盖玻片干燥。实验之间切勿用乙醇清洗支架，因为密封圈可能残留乙醇，与 PLL-g-PEG 发生反应，导致细胞应激。支架仅可用肥皂水清洗。此外，可将连接处于 37 °C 的图案化培养基中孵育 1 小时，以稀释残留物质。</li>
		<li>通过胰酶消化收集转染后的 hTERT-RPE1 细胞（每孔 12 孔板使用 0.5 mL 胰酶），加入 1 mL 含 10% FBS 的 DMEM/F12 培养基终止消化。</li>
		<li>向盖玻片支架中加入 0.5 × 106 个转染后的 hTERT-RPE1 细胞，重新封闭支架，在培养箱中孵育 10 分钟。</li>
		<li>用图案化培养基冲洗支架 5 次，以去除未贴壁细胞和残留的 FBS。使用一支移液器加入培养基，另一支移液器吸出液体，形成冲洗流。始终在支架中保留少量培养基，防止微图案化盖玻片上的细胞干燥，否则会导致细胞死亡。</li>
		<li>在培养箱中继续孵育 3 小时，使细胞充分铺展。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 胞吐数据的采集
<ol>
	<li>胞吐事件的成像
	<ol>
		<li>将盖玻片支架置于全内反射显微镜（TIRM）下。信号需由配备最佳可用成像格式的高灵敏度相机检测。 
		注意：&#160;在本实验中，使用了100倍物镜和EMCCD相机，检测区域为512 × 512像素，对应像素大小为160 nm。</li>
		<li>寻找表达VAMP7-pHluorin且完全铺展的细胞（图1A）。 
		注意：表达VAMP7的细胞可被清晰识别，因其呈现绿色信号。</li>
		<li>调整激光角度，直至达到可观察VAMP7-pHluorin胞吐事件的全内反射荧光（TIRF）角度。使用显微镜软件以与胞吐速率和时间尺度相匹配的频率（通常为3 Hz，图1D）进行5分钟的图像采集。 
		注意：在微图案上，hTERT-RPE1细胞的溶酶体分泌速率约为0.3 Hz。溶酶体胞吐的典型持续时间为1秒，其特征为强度峰值后接指数衰减。此时探针的扩散应清晰可见（图1B、C）。</li>
		<li>对每个细胞，还需使用显微镜软件采集微图案的图像（图1A）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>胞吐事件坐标的获取
	<ol>
		<li>使用ImageJ/FIJI打开采集的视频。选择文件 | 导入 | 图像序列。通过肉眼识别胞吐事件。胞吐事件的特征是出现向外扩散的明亮信号（图1）。</li>
		<li>使用点工具标记胞吐事件的中心。选择分析 | 测量，测量X和Y坐标以及时间坐标（帧编号）。对视频中所有胞吐事件执行上述测量。</li>
		<li>保存结果（结果 | 文件 | 另存为）。为每个分析的细胞准备一个名为“Results(细胞名称).txt”的文本文件，按顺序包含所有胞吐事件的帧编号、X坐标和Y坐标。 
		 
		文本文件应如下所示： 
		ID         X          Y          Feret's diameter         Radius 
		RPE1_WT_Cell1                      167      136      230      115 
		RPE1_WT_Cell2                      164      160      230      115 
		 
		注意：请务必用小数点替换所有逗号。</li>
		<li>使用“椭圆工具”测量每个细胞的中心和直径。拟合一个完美的圆（不要使用椭圆），并使用“测量”功能获取X和Y坐标以及Feret直径。将每个细胞的标识（ID）、X和Y坐标、Feret直径和半径（直径/2）保存在一个名为“Spherical parameter.txt”的文本文件中。 
		 
		文本文件应如下所示： 
		ID         X          Y          Feret's diameter         Radius 
		RPE1_WT_Cell1                      167      136      230      115 
		RPE1_WT_Cell2                      164      160      230      115 
		 
		注意：请务必用小数点替换所有逗号。</li>
		<li>使用直线工具测量微图案环的厚度（黏附长度），并将细胞ID、细胞半径（来自文件“Spherical parameter.txt”）和黏附长度保存在一个名为“Pattern parameter.txt”的文本文件中。通过将黏附长度除以细胞半径计算归一化的黏附长度。 
		注意：请务必用小数点替换所有逗号。 
		 
		文件应如下所示： 
		ID         Cell radius       adhesion length          Normalized adhesion length 
		RPE1_WT_Cell1                      115      34        0.295652174 
		RPE1_WT_Cell2                      115      35        0.304347826</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 单细胞空间分析
<ol>
	<li>R 包及其安装 
	注意：本分析所用的 R 包利用 Spatstat 包13 来计算二维（2D）密度和 Ripley’s K 函数。该代码为开源，使用先前已描述的文本文件。
	<ol>
		<li>从 https://www.r-project.org/ 下载并安装 R（本分析使用版本 3.5.2）。</li>
		<li>从以下地址下载该软件包（及示例数据集）：https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper</li>
		<li>在 R Studio 中使用“工具”菜单下的“安装包”功能进行安装。在“安装自：”类别中选择“包存档文件 (.zip; .tar.gz)”，然后选择软件包文件，点击“安装”。</li>
		<li>在 R Studio 中输入命令“library(&#34;ExocytosisSpatialAnalysis&#34;)”并按“回车”以加载该软件包。</li>
		<li>在 R Studio 中输入命令“ESA()”并按“回车”以运行该软件包。 
		注意：将打开一个用户界面。</li>
		<li>选择数据集目录（.txt 文件）以及输出图像的目录。 
		注意：分析参数（见下文）可通过用户界面进行修改。</li>
		<li>该脚本将自动启动并执行分析，生成对应图表的 .pdf 文件以及包含数值结果的 .txt 文件。&#160;</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytosis+and+endocytosis%3A+modes%2C+functions%2C+and+coupling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms.</a> Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).</li>
<li>Samie, M. A., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+exocytosis+and+lipid+storage+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders.</a> Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).</li>
<li>Neher, E., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrete+changes+of+cell+membrane+capacitance+observed+under+conditions+of+enhanced+secretion+in+bovine+adrenal+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).</li>
<li>Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+defines+the+topology+of+endocytosis+and+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling.</a> The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).</li>
<li>Fourriere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAB6+and+microtubules+restrict+protein+secretion+to+focal+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions.</a> Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).</li>
<li>Wang, Y., McNiven, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+matrix+degradation+at+focal+adhesions+occurs+via+protease+recruitment+by+a+FAK-p130Cas+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex.</a> Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).</li>
<li>Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+spatial+organization+of+molecules+with+robust+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics.</a> PLoS One. 12, 80914(2013).</li>
<li>Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+Detection+and+Analysis+of+Exocytosis+Reveal+Fusion+%22Hotspots%22+Organized+by+the+Cytoskeleton+in+Endocrine+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion "Hotspots" Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells.</a> Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).</li>
<li>Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+organization+of+exocytosis+emerges+during+neuronal+shape+change%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change.</a> Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).</li>
<li>Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Tetanus+Neurotoxin+Insensitive+Vesicle-Associated+Membrane+Protein+%28Ti-Vamp%29+in+Vesicular+Transport+Mediating+Neurite+Outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).</li>
<li>Alberts, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+and+Actin+Control+Polarized+Expression+of+TI-VAMP+Vesicles+to+Neuronal+Growth+Cones+and+Their+Fusion+with+the+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+Cell%22%5BJournal%5D)">Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane.</a> Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).</li>
<li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).</li>
<li>Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaddeley%2C+A+%22Spatial+point+Patterns%3A+Methodology+and+Applications+with+R%22">Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R</a>. , CRC Press. Indianapolis, IN. (2015).</li>
<li>Schauer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probabilistic+density+maps+to+study+global+endomembrane+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Probabilistic density maps to study global endomembrane organization.</a> Nature Methods. 7, 560-566 (2010).</li>
<li>Advani, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seven+Novel+Mammalian+SNARE+Proteins+Localize+to+Distinct+Membrane+Compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments.</a> Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).</li>
<li>North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Note+on+the+Calculation+of+Empirical+P+Values+from+Monte+Carlo+Procedures%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures.</a> American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).</li>
<li>Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+approach+for+analyzing+the+spatio-temporal+distribution+of+3D+intracellular+events+in+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy.</a> eLife. 7, 32311(2018).</li>
<li>Chen, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+kernel+estimators+for+density+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Computational+Statistics+%26+Data+Analysis%22%5BJournal%5D)">Beta kernel estimators for density functions.</a> Computational Statistics & Data Analysis. 31, 131-145 (1999).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们通过全内反射荧光显微镜（TIRFM）对环形微图案化细胞中VAMP7-pHluorin进行活细胞成像，监测了溶酶体区室的胞吐事件，并对胞吐事件的空间参数进行了严格的统计分析。利用转换后的Ripley’s K函数以及基于最近邻距离的统计检验，我们证实溶酶体分泌并非随机过程8,9。两种统计分析均有力地表明，胞吐事件呈现簇状分布（图2D和2G）。将类似分析工具应用于非黏附区域，我们发现胞吐事件在非黏附区域同样呈簇状聚集（图2E和2I）。因此，先前报道可介导簇状分布的黏附分子6并非唯一能在质膜上诱导分泌热点的结构。然而，细胞黏附增强了簇状聚集：在非黏附区域，胞吐事件之间的平均最近邻距离显著更大（图2H）。与此一致，我们基于核密度估计和累积分布函数的分析发现，在环形微图案化细胞中，胞吐富集...

胞吐作用是一种普遍存在的细胞过程，其中囊泡与质膜融合并释放其内容物。囊泡可以完全与质膜融合（全融合），也可以形成一个在有限时间内保持开放的融合孔道（“亲吻即走”模式）1。例如，新合成的蛋白质通过来自高尔基体复合物的囊泡释放到细胞外环境中。这种生物合成的顺向运输途径至关重要，尤其在多细胞生物中，用于分泌信号肽（如激素、神经递质）和细胞外基质成分（如胶原蛋白），以及将跨膜蛋白转运至质膜。此外，分泌还可来自不同类型的内体：1）回收内体，用于再利用跨膜蛋白；2）多泡体（MVBs），用于释放外泌体；3）溶酶体，用于释放蛋白水解酶。已有研究表明，内体分泌在神经突生长、伪足形成、质膜修复以及ATP依赖性信号传导中具有重要作用2。
为了在单细胞水平上研究胞吐作用，已采用多种技术。膜片钳技术能够在多种活细胞中以高时间分辨率检测单个胞吐事件3。然而，该方法无法提供胞吐事件发生位置的信息，也无法确定其来源于哪个细胞区室。电子显微镜可直接以高空间分辨率观察胞吐事件，结合免疫标记技术还能提供有关参与该过程的区室及分子特异性的信息。但该方法的缺点在于缺乏对过程动态变化的信息，且难以进行高通量研究。诸如全内反射荧光显微镜（TIRFM）等光学显微技术利用渐逝波照射盖玻片附近（约100 nm范围内）的荧光分子，可实现对胞吐事件的良好时间和空间分辨率观察。然而，该方法仅适用于贴壁细胞，且只能用于观察细胞的腹侧/下部区域。
值得注意的是，细胞膜的异质性显著，这种异质性源于仅存在于特定区域的黏附复合物。例如，这种异质性会限制不同配体的摄取4。类似地，最近有研究报道，高尔基体复合物的分泌活动集中在细胞膜上的“热点”区域5。此外，已知某些运输货物通过与黏着斑相关的胞吐作用进行分泌6。因此，应特别关注胞吐事件在空间上是随机分布，还是集中在细胞膜的特定区域这一问题。已有若干基于Ripley's K函数的统计工具被提出，用于探讨这些问题7,8,9。我们的方法将这些统计工具与微图形化技术相结合，以控制细胞形态和细胞膜的异质性。该技术不仅能够区分黏附与非黏附区域，还可实现不同细胞和条件之间的比较，并提高统计分析的效力。
本研究采用多种统计学工具，通过TIRFM活细胞成像技术监测环形微图案化的hTert-RPE1细胞中VAMP7-pHluorin在溶酶体区室的分泌事件，分析其空间分布特征。结果证实，溶酶体来源的分泌并非随机过程8,9，且分泌事件呈现簇状分布。值得注意的是，我们发现分泌事件在非黏附区域同样存在聚集现象，表明细胞膜上的分泌热点并非仅由黏附分子诱导形成。然而，细胞黏附确实增强了分泌事件的簇状分布。与此一致，我们的分析鉴定出分泌事件富集区域主要位于黏附区与非黏附区的交界处。

<table><tbody><tr><td>Chamlide 磁力腔室</td><td>Chamlide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>21041-025</td><td></td></tr><tr><td>纤维蛋白原</td><td>Molecular Probes，Invitrogen</td><td>F35200</td><td></td></tr><tr><td>牛血浆纤维连接蛋白</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>hTert RPE1细胞系</td><td>https://www.atcc.org</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>http://rsbweb.nih.gov/ij/</td><td>n/a</td><td>作者：W. Rasband，美国国立卫生研究院/国家精神卫生研究所</td></tr><tr><td>JetPRIME 转染试剂</td><td>Polyplus</td><td>114-07</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>光掩模</td><td>Delta掩膜</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLL-g-PEG 溶液</td><td>表面解决方案</td><td>PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td><td></td></tr><tr><td>R 软件</td><td>https://www.r-project.org/</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶（TrypLE Express 1X）</td><td>Gibco</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>紫外臭氧炉</td><td>Jelight Company Inc</td><td>342-220</td><td></td></tr><tr><td>VAMP7-pHFluorin 质粒</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>论文参考文献：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis.&lt;br/&gt; J Biol Chem. 2008年12月5日;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200.&lt;br/&gt; HRB 在网格蛋白依赖性内吞作用中的功能&lt;br/&gt; Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T</td></tr></tbody></table>

量化微图形化细胞中细胞外排的时空参数

Quantifying Spatiotemporal Parameters of Cellular Exocytosis in Micropatterned Cells

通过全内反射荧光显微镜（TIRFM）对pHluorin标记的可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（v-SNARE）囊泡相关膜蛋白7（VAMP7）进行活体成像，是研究溶酶体区室分泌过程的一种简便方法。利用细胞在微图案化表面上培养以标准化细胞形态，结合多种统计学工具对分泌模式进行空间分析。通过Ripley’s K函数及基于最近邻距离（NND）的统计检验，我们证实溶酶体的分泌并非随机过程，而是表现出显著的簇状分布。值得注意的是，我们的分析揭示胞吐事件不仅在非黏附区域也呈簇状聚集，表明黏附分子并非唯一能在质膜上诱导分泌热点的结构。然而，我们发现细胞黏附可增强这种簇状分布。除了具有明确定义的黏附与非黏附区域外，这些微图案的环形几何结构还允许使用极坐标，从而简化分析过程。我们采用核密度估计（KDE）以及对胞吐事件极坐标数据的累积分布函数，识别出胞吐事件富集的区域。在环形微图案细胞中，簇状分布主要发生在黏附区与非黏附区的交界处。本研究展示了如何利用统计学工具来探究多种生物过程的空间分布特征。

通过在hTert-RPE1细胞中利用VAMP7-pHluorin标记的溶酶体，分析了胞吐事件的时空特征10,11。hTert-RPE1细胞是一种非转化细胞，易于进行微图形化处理，并已在先前基于微图形的研究中被广泛使用4,14。VAMP7是一种溶酶体v-SNARE蛋白15，在其N端融合了超增强型pHluorin荧光蛋白，位于溶酶体腔内。在细胞内，由于溶酶体的低pH环境，pHluorin探针的荧光被淬灭；而在胞吐过程中，随着质子释放导致pH升高，pHluorin开始发出荧光信号。通过全内反射荧光显微镜（TIRFM）对环形微图形上的活细胞进行成像，监测VAMP7-pHluorin的动态变化（图1A–B）。pHluorin信号在胞吐过程中出现一个峰值，代表溶酶体质子的快速释...

在微图形化细胞上进行溶酶体胞吐的活体成像，可实现对该过程的空间定量分析。利用微图形进行形态学标准化，是揭示细胞过程空间分布普遍规律的有力工具。

活体成像pHluorin标记的可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（v-SNARE）囊泡相关膜蛋白7

本方案展示了如何利用TOF显微镜进行活体成像以研究细胞分泌，并提供了用于检测分泌物聚集事件或高活性区域的工具。通过本方案，我们可在微图案化表面培养细胞，使细胞分裂趋于一致，从而便于观察分泌事件的空间分布特征。细胞会分泌多种大分子物质，这些物质在免疫调节中发挥着重要作用。在癌症中，分泌功能的失调会影响促进侵袭的蛋白水解酶的释放。对分泌过程进行定量分析将有助于我们更深入地理解癌症中异常的分泌现象以及其他动态过程，例如抗原呈递。尽管我们的成像与分析方案较为直接，但它需要生成能够在微图案表面充分铺展的单个细胞。在本视频中，我们将演示如何在微图案盖玻片上培养细胞，以及如何利用空间统计工具对分泌事件进行可视化和分析。为微图案化准备盖玻片时，先将经乙醇灭菌的直径25毫米的玻璃盖玻片置于深紫外光下活化5分钟。在盖玻片活化的同时，在湿润 chamber 内的石蜡膜上，为每张盖玻片加入一滴30 µL的聚赖氨酸接枝聚乙二醇溶液。激活结束后，将盖玻片的活化面朝下放置于液滴上，盖上湿盒，在室温下孵育一小时。孵育结束后，用蒸馏水洗涤盖玻片两次。在盖玻片干燥的同时，用蒸馏水清洗石英光掩模一次，再用酒精清洗一次。用过滤的气流吹干光刻掩膜，并将镀铬面朝上的光刻掩膜暴露于深紫外光下照射五分钟。照射结束后，在每张光刻掩膜的镀铬面上滴加10 µL水滴，并将每个盖玻片的聚乙二醇面置于对应的水滴上。去除多余水分后，在载玻片上覆盖一层薄膜以防止脱水。在向光刻掩模中加入过量水以去除盖玻片之前，将光刻掩模未镀铬的一侧额外暴露于深紫外光下照射五分钟。此步骤将在表面形成微图案印迹。随后，在层流罩内，将盖玻片置于湿润室中的石蜡膜上，并在细胞外基质蛋白溶液中孵育一小时。将细胞接种到制备好的微图案表面时，在孵育结束时，将盖玻片放入磁性盖玻片架中，微图案面朝上，并立即向盖玻片上加入图案化培养基。加入密封圈后，使用磁性装置固定盖玻片，然后向盖玻片架中补充额外的图案化培养基。最后用玻璃盖板封闭盖玻片架。当细胞准备就绪后，将5 × 10⁵个转染的永生化视网膜色素上皮细胞加入到盖玻片上，并将细胞置于培养皿中，在细胞培养箱中孵育10分钟。孵育结束后，使用一支移液枪吸除旧培养基，同时用另一支移液枪用新鲜培养基洗涤细胞，每次洗涤重复五次，以去除未贴壁的细胞及任何残留的胎牛血清。最后一次洗涤完成后，将培养皿放回培养箱中继续孵育3小时，以使细胞充分铺展。为了成像胞吐事件，将盖玻片支架置于全内反射荧光显微镜下，寻找一个完全铺展且表达VAMP7-pHluorin的细胞。调整激光角度，直至达到能够观察到VAMP7-pHluorin胞吐事件的全内反射荧光角度，然后以与胞吐速率和时间尺度相匹配的频率进行五分钟的图像采集。为了获得胞吐事件的坐标，将采集到的胞吐事件视频在Fiji中打开，并通过观察向外扩散的明亮信号手动识别胞吐事件。使用点工具标记胞吐事件的中心位置，并通过分析和测量功能获取其 x 和 y 坐标以及时间坐标。将一个细胞的测量结果保存在一个文本文件中。在电子表格中打开该文本文件，并删除除切片 x 和 y 坐标列之外的所有其他列。接下来，使用椭圆工具进行测量，以确定每个细胞的中心位置和直径，并获取每个细胞的 x 和 y 坐标以及 Feret 直径。将所有细胞的测量结果保存在一个文本文件中。在电子表格中打开该文本文件，并仅保留 x 坐标、y 坐标和 Feret 直径三列，删除其余各列。然后添加每个细胞的半径测量值，再根据每个细胞的Feret直径获取半径。使用直线工具测量每个细胞微图案环的厚度。将所有细胞的该测量值保存在一个文本文件中，然后用黏附长度除以细胞半径，计算归一化的黏附长度。进行单细胞空间分析时，首先在 RStudio 中安装并加载该软件包。使用 ESA 函数运行该软件包，将打开一个用户界面，然后选择用于数据集 TXT 文件的目录以及用于输出图表的目录。该脚本将自动启动并执行分析，生成相应图谱的 PDF 文件以及包含数值结果的 TXT 文件。在细胞内，探针的荧光信号因溶酶体的低 pH 环境而被淬灭；但在胞吐过程中，随着质子释放导致 pH 升高，pHluorin 开始发出荧光信号。pHluorin 信号在胞吐期间出现一个峰值，代表溶酶体质子的快速释放，随后信号呈指数衰减，反映探针在质膜上的二维扩散过程。通常，转染的永生化人视网膜色素上皮细胞表现出重要的溶酶体分泌活性，平均胞吐速率为 0.28 赫兹。可通过核密度估计来可视化胞吐事件的二维分布，以揭示局部密度的差异。相对于完全空间随机性，可能存在三种偏离情况：聚集、分散，或聚集与分散的混合模式。Ripley's K 函数可用于评估这些偏差。值得注意的是，非黏附区域的胞吐事件也呈簇状分布，这表明黏附分子并非唯一能在质膜上诱导分泌热点的结构。根据代表性细胞的模量绘制胞吐事件的直方图，可观察到在黏附区与非黏附区交界处附近出现一个峰值。成对分析表明，黏附区域的表面密度低于非黏附区域，这可能是由于细胞周边胞吐作用显著减弱所致。将细胞在微图案上的黏附与统计分析相结合，有助于精确定位分泌等复杂细胞过程在空间上是如何被调控的。未来还需进一步研究以确定介导分泌活性聚集的分子机制。

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

定量微模式细胞细胞外细胞异细胞的时态参数

能够正常化细胞结构的黏附性微图案可用于提高药物效应检测的灵敏度，改善实验重复性，并简化自动图像采集与分析。该技术将有助于在传统细胞培养支持物上进行的药物/siRNA筛选实验，此类实验通常因细胞间变异性过大而受限。...

利用微图案化细胞改善药物效应的可视化与定量分析

来源：Pioli, R., et al., 通过连续毛细辅助组装实现微生物与微粒的图案化。 J. Vis. Exp. (2021)本视频演示了使用无碳悬浮液和可控流体，通过微流控捕获装置捕获单个荧光标记的大肠杆菌（Escherichia...

基于微流控图案化与荧光标记的单细胞细菌生长追踪

本文介绍了基于流式细胞术和显微镜技术的两种互补方法，可在单细胞水平上定量分析酵母中由MAPK通路激活所诱导的基因表达动态变化。...

单个酵母细胞中MAPK诱导表达的时间定量分析

本研究的目的是 该方案旨在建立一种可用于肥大细胞分泌功能基因组学分析的方法。该方法基于对与目的基因共转染的荧光报告基因释放量的定量评估，并结合实时检测 分泌颗粒形态的分析。...

探究肥大细胞分泌颗粒：从生物合成到胞吐作用

细胞间通讯对于调控细胞内外多种生理活动至关重要。本文介绍了一种用于测量单个细胞分泌物时空特性的实验方案。为实现这一目标，采用了一种多学科交叉的方法，将无标记纳米等离子体传感技术与活细胞成像相结合。...

一种用于单细胞分泌物时空成像的无标记技术

渗透压应激影响胞吐作用以及在此过程中释放的神经递质的量。我们展示了如何结合电化学方法与透射电子显微镜技术，用于研究细胞外渗透压对胞吐活性、囊泡量子大小以及胞吐过程中释放的神经递质量的影响。...

监测渗透压胁迫对分泌囊泡及胞吐作用的影响

本文介绍的方法结合微图形化技术与定量成像，以揭示哺乳动物细胞培养物中的空间组织结构。该技术易于在标准的细胞生物学实验室中建立，为体外研究模式形成提供了一个可操作的实验系统。...

利用微图形技术和定量成像技术绘制哺乳动物细胞的自组织空间结构

在本实验方案中，我们介绍了基于活细胞显微镜技术的细胞铺展实验的操作步骤。我们提供了一个开源的计算工具，用于对荧光标记的细胞进行无偏分割，并对细胞铺展过程中的片状伪足动态进行定量分析。...

细胞铺展过程中细胞边缘动力学的定量分析

我们开发了自动化的计算机视觉软件，用于检测由pH敏感型荧光探针标记的胞吐事件。在此，我们演示如何使用图形用户界面和RStudio来检测融合事件，分析并展示融合事件的时空参数，并将事件分类为不同的融合模式。...

胞吐作用的自动检测与分析

利用成像衍生的均方位移（iMSD）分析来研究巨胞饮泡，以突出其在结构和动态特性方面随时间演变的内在特性。随后将巨胞饮泡与胰岛素分泌颗粒（ISGs）进行比较，后者作为具有时间不变平均结构/动态特性的亚细胞结构的参照。...

通过时空涨落光谱探测转运亚细胞纳米结构的结构与动态特性

本方案旨在测量铺展细胞边缘突起的动态参数（突起、回缩、皱褶）。...

利用活细胞显微镜测量细胞边缘突出在铺展过程中的动态变化

了解如何使用TOF显微镜和微图案化技术对视网膜色素上皮细胞中的溶酶体胞吐作用进行时空定量分析。该方法有助于研究癌症和免疫调节中的分泌动态。

量化微图形化细胞中细胞外排的时空参数

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