Name: 使用基因组-规模CRISPR/Cas9基因屏幕进行细胞表面受体识别 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 学习使用全基因组CRISPR/Cas9筛选技术识别细胞表面受体-配体相互作用的方法。该技术不依赖受体生物学先验知识，适用于神经科学、免疫学和宿主-病原体相互作用研究，具有重要的治疗应用前景。

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本工作由惠康信托基金（Wellcome Trust）资助，资助编号206194，授予GJW。我们感谢细胞计量核心设施的Bee Ling Ng、Jennifer Graham、Sam Thompson和Christopher Hall在FACS方面的帮助。

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文描述了一种基于CRISPR的筛选策略，用于鉴定编码参与细胞识别过程的细胞组分的基因。类似地，使用CRISPR激活的方法也提供了一种遗传学手段，可直接鉴定重组蛋白的相互作用受体，而无需构建大规模的蛋白文库26。然而，该方法的一个主要优势在于，其适用于由细胞表面天然表达的分子介导的相互作用，而不依赖于受体的过表达——后者可能影响受体的结合亲和力。因此，与其他方法不同，该技术不对受体的生物化学特性或细胞生物学性质做任何预设，能够研究那些通常难以通过生化方法分析的蛋白介导的相互作用，例如分子量极大的蛋白、多次跨膜蛋白、与其他蛋白形成复合物的蛋白，以及非蛋白类分子（如聚糖、糖脂和磷脂）介导的相互作用。鉴于该方法具有全基因组尺度的覆盖能力，其另一优势在于不仅能鉴定出受体，还能识别结合事件所必需的其他细胞组分，从而为理解受体的细胞生物学特性提供深入见解。
使用该方法鉴定孤儿蛋白受体时，一个主要局限在于首先需要鉴定出能够与该蛋白结合的细胞系。这并不总是容易实现，而找到既表现出结合表型又适用于遗传筛选的细胞系，往往是实施该检测时耗时最长的步骤。某些细胞系比其他细胞系更容易非特异性地结合更多蛋白。这一点对于能够结合肝素硫酸蛋白多糖（HS）的蛋白尤为重要，因为这类蛋白倾向于结合任何表达HS侧链的细胞系，而不论其天然结合环境如何。此外，我们观察到，在细胞系中上调syndecans（即含有HS的蛋白聚糖）的表达会增强HS结合蛋白的结合能力26。在选择用于筛选的细胞系时，这一点值得考虑。然而，同样重要的是，HS的结合效应是叠加性的，而非与特异性受体结合相互依赖，因此不会干扰蛋白与特异性受体的结合。这意味着，如果检测到结合信号，该结合可能完全由HS介导，因为在本实验中HS介导的结合是叠加性的而非共依赖性的19。在此类情况下，文中所述的肝素阻断方法即可识别出此类结合行为，而无需进行完整的遗传筛选。
用于选择细胞系的一个有用资源是 Cell Model Passport，其中包含约 1,000 种癌症细胞系的基因组学、转录组学和培养条件信息27。根据具体的生物学背景，可依据细胞的表达谱来选择细胞系。为了辅助细胞系的选择，我们根据约 1,500 种预先注释的人类细胞表面糖蛋白的表达情况，对 Cell Model Passport 中的约 1,000 个细胞系进行了聚类分析28（补充图 2；各细胞系的聚类信息及其培养条件详见 补充表 2）。在检测功能未知蛋白的结合能力时，建议从每个聚类中选择一组代表性细胞系，以提高覆盖多种受体的可能性。在条件允许的情况下，应优先选择易于培养且易于转导的细胞系。由于这些细胞系将用于全基因组规模的筛选，因此最好能够方便地大量扩增，并对慢病毒转导具有较高的敏感性，因为慢病毒转导是后续步骤中基于 CRISPR 的遗传筛选递送 sgRNA 最常用的方法。
通常，表型筛选通过单次分选完成。然而，具体操作取决于染色细胞群体与对照相比的荧光强度。当目标表型的信噪比较低，或筛选目的是鉴定具有显著表型的突变体时，可采用多轮迭代式筛选。在基于流式细胞术（FACS）的筛选中使用迭代分选策略时，需注意分选过程可能导致细胞死亡，主要原因是分选仪产生的剪切力。因此，并非所有收集到的细胞都能在下一轮分选中被代表。
文库复杂度是进行成功遗传筛选的一个非常重要的因素，尤其是在负筛选中，因为此类筛选的耗竭程度只能通过与起始文库中存在的成分进行比较来确定。对于负筛选，通常需要维持500-1,000倍复杂度的文库。然而，正筛选对文库大小的依赖性较低，因为在这些筛选中，预期仅有少数突变体会被选择出特定表型。因此，在本研究所描述的正筛选中，文库复杂度可降低至50-100倍而不影响筛选质量。此外，在这些筛选中，还可以在同一天针对特定细胞系使用一个对照文库作为该细胞系当天所有分选样本的&#34;通用对照&#34;，从而减少需要构建和测序的对照文库数量。
采用该方法时另一个重要的考虑因素是，功能缺失筛选在鉴定对体外细胞生长至关重要的基因方面存在局限性。在此方面，筛选的时间点非常关键：突变细胞在培养中维持的时间越长，携带必需基因突变的细胞越可能失去活力，从而不再存在于突变文库中。作为Project Score计划的一部分，近期在超过300种细胞系中开展的遗传筛选显示，KEGG注释的蛋白质分泌和N-糖基化通路中的多个基因常被鉴定为多种细胞系生长所必需的基因（补充图3）29。在设计筛选实验时，若需研究增殖和存活相关基因在细胞识别过程中的作用，则应考虑这一因素。在此情况下，通常宜在较早时间点进行筛选（例如转导后第9天）。然而，若该方法旨在鉴定少数具有显著效应大小的靶点，而非普遍的细胞通路，则可在较晚时间点进行筛选（例如转导后第15–16天）。
筛选结果非常可靠；在过去进行的八次重组蛋白结合筛选实验中，细胞表面受体在每次实验中均为排名第一的候选分子19。因此，在使用该方法鉴定相互作用伙伴时，预期能够以高度统计学置信度鉴定出该受体及其在细胞表面呈现过程中起作用的相关因子。一旦完成筛选，并通过单个gRNA敲除实验验证了候选分子，可进一步采用现有的生化方法进行后续研究，例如AVEXIS4，以及利用表面等离子共振技术对纯化蛋白进行直接的可饱和结合分析。本文所述方法适用于所有能够制备可溶性重组结合探针的蛋白质。
综上所述，这是一种基于全基因组规模的CRISPR基因敲除方法，用于鉴定由细胞表面蛋白介导的相互作用。该方法具有广泛的适用性，可用于鉴定多种不同生物学背景下细胞表面识别所必需的细胞通路，包括生物体自身细胞之间的识别（例如神经和免疫识别），以及宿主细胞与病原体蛋白之间的相互作用。该方法为受体鉴定提供了遗传学替代方案，相较于传统的生化方法，它无需对受体的生化特性或细胞生物学性质进行任何先验假设，因而具有发现全新未知机制的巨大潜力。

细胞表面受体蛋白介导的细胞外相互作用调控着组织构建、宿主-病原体识别以及免疫调节等重要的生物学过程。由于膜受体是单克隆抗体等系统性给药治疗手段的作用靶点，因此这类相互作用的研究受到生物医学领域的广泛关注。尽管膜受体具有重要意义，但对其相互作用的研究在技术上仍具挑战性。这主要是因为嵌入膜中的受体具有两亲性，难以从生物膜中分离出来进行生化操作，且其相互作用通常表现为较弱的结合亲和力（解离常数 KD 在 µM 至 mM 范围）1。因此，许多常用方法均不适用于检测此类蛋白质相互作用1,2。
已开发出多种方法，用于特异性研究细胞外受体-配体相互作用，这些方法充分考虑了其独特的生化特性3。其中一些方法涉及在哺乳动物或昆虫细胞表达系统中表达受体的完整胞外域，以可溶性重组蛋白的形式进行生产，从而确保这些蛋白含有结构上重要的翻译后修饰，例如糖链和二硫键。为克服低亲和力结合的问题，通常将胞外域进行寡聚化，以增强其结合的协同性（avidity）。已成功将具有协同结合能力的蛋白胞外域用作结合探针，在直接的重组蛋白-蛋白相互作用筛选中鉴定相互作用伙伴4,5,6,7。尽管这类方法总体上取得了广泛成功，但基于重组蛋白的技术要求膜受体的胞外域能够以可溶性蛋白形式表达。因此，该方法通常仅适用于含有连续胞外区域的蛋白（例如单次跨膜I型、II型或GPI锚定型蛋白），而不适用于多次跨膜的受体复合物或多跨膜结构的膜蛋白。
通过将互补DNA（cDNA）文库转染细胞并检测其是否获得结合表型的表达克隆技术，也已被用于鉴定细胞外蛋白质-蛋白质相互作用8。近年来，大量已克隆并测序的cDNA表达质粒的可获取性，促进了相关方法的发展，即通过筛选高表达编码细胞表面受体cDNA的细胞系，检测其与重组蛋白的结合，从而识别相互作用9,10。与基于重组蛋白的方法不同，基于cDNA过表达的方法能够在质膜环境中鉴定相互作用。然而，使用cDNA表达载体的成功与否，取决于细胞能否以正确折叠的形式过表达目标蛋白，而这一过程通常需要转运蛋白、分子伴侣以及正确的寡聚组装等细胞辅助因子。因此，仅转染单个cDNA可能不足以实现蛋白在细胞表面的有效表达。
使用cDNA构建体或重组蛋白探针的筛选技术资源消耗较大，且需要大量的cDNA或重组蛋白文库。近年来，已采用一些专门设计的基于质谱的方法来鉴定细胞外相互作用，这些方法无需构建大规模文库。然而，这些技术需要对细胞表面进行化学修饰，可能改变细胞表面分子的生化特性，且目前仅适用于由糖基化蛋白介导的相互作用11,12。目前大多数可用的方法主要集中于蛋白质之间的相互作用，而很大程度上忽略了膜微环境（包括聚糖、脂质和胆固醇等分子）的贡献。
近年来，基于CRISPR的高效双等位基因靶向技术的发展，使得能够在单一细胞池中构建基因组规模的细胞文库，这些细胞缺失特定的基因，从而可以系统性且无偏倚地筛选参与不同生物学过程的细胞组分，包括解析细胞信号通路、鉴定赋予药物、毒素和病原体抗性的扰动因素，以及确定抗体的特异性13,14,15,16。本文描述了一种基于CRISPR的基因组规模基因敲除细胞筛选实验方法，该方法为当前生化手段鉴定细胞外受体-配体相互作用提供了替代方案。这种通过遗传筛选鉴定由膜受体介导的相互作用的方法，特别适用于对特定配体有聚焦研究兴趣的研究人员，因为它避免了构建大规模cDNA文库或重组蛋白库的需要。
该实验包含三个主要步骤：1）制备由目的受体胞外区组成的高亲和力重组蛋白结合探针，并将其用于基于荧光的流式细胞术结合实验；2）通过结合实验鉴定出表达该重组蛋白探针相互作用伴侣的细胞系；3）构建可表达Cas9的、与目的蛋白发生相互作用的细胞系，并进行全基因组规模的CRISPR/Cas9介导的基因敲除筛选（图1）。在此遗传筛选中，重组蛋白与细胞系的结合能力作为可测量的表型指标，利用基于荧光的活化细胞分选技术（FACS）对失去与探针结合能力的敲除文库中的细胞进行分选，再通过测序鉴定导致结合表型丧失的相关基因。原则上，该方法可鉴定出编码高亲和力探针结合受体的基因，以及参与其在细胞表面表达所需的其他基因。
本方案的第一步是制备代表膜结合受体胞外域的高亲和力重组蛋白探针。已知这些受体在将其胞外域表达为可溶性重组蛋白时，通常仍能保持其细胞外结合功能。1对于目标蛋白，只要能够进行寡聚化以增强结合亲和力，并含有可用于基于荧光的流式细胞术结合实验的标签（例如 FLAG 标签、生物素标签），即可在任何合适的真核蛋白表达系统中以任意形式表达可溶性重组蛋白。此前已有文献详细描述了利用 HEK293 蛋白表达系统生产膜受体可溶性胞外域的方法，以及不同的多聚化技术，还包括用于生产五聚体蛋白和单体蛋白的蛋白表达载体。1,17本方案将介绍通过将单体生物素化蛋白与荧光染料偶联的链霉亲和素（如藻红蛋白，PE）结合，制备荧光亲和探针的步骤。该探针可直接用于基于细胞的结合实验，其优势在于无需使用二抗进行检测。全基因组规模筛选的一般性实验方案已有描述。20,21因此，该方案主要聚焦于利用人类V1文库的CRISPR/Cas9基因敲除筛选系统，开展基于流式细胞术的重组蛋白结合筛选的具体操作步骤。&#34;Yusa&#34;）文库18.

<table><tbody><tr><td>抗小鼠碱性磷酸酶</td><td>Sigma</td><td>A4656</td><td></td></tr><tr><td>杀稻瘟菌素</td><td>Chem-Cruz</td><td>SC-204655</td><td></td></tr><tr><td>血液 &amp;amp; 细胞培养 DNA 大量提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>13362</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>二乙醇胺</td><td>Sigma</td><td>398179</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy 血液与组织试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-96 侧向磁铁</td><td>Invitrogen</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T 包装细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>肝素</td><td>Sigma</td><td>H4784-1G</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Kapa</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine LTX 转染试剂（含 PLUS 试剂）</td><td>Invitrogen</td><td>15338100</td><td></td></tr><tr><td>MoFlo XDP 细胞分选仪</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni2+-NTA 琼脂糖凝胶珠</td><td>Jena Bioscience</td><td>AC-501-25</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>OX-68 抗体</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1022R</td><td></td></tr><tr><td>对硝基苯基磷酸盐</td><td>Sigma</td><td>1040-506</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 脱盐柱</td><td>GE 医疗</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 床体积的聚丙烯管</td><td>Qiagen</td><td>34964</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶K，重组，PCR级</td><td>罗氏</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Q5热启动高保真2&amp;times; 预混液</td><td>NEB</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 纯化试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>短链脂肪酸滤器</td><td>Nalgene</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>索尼细胞分选仪</td><td>索尼</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPRI 磁珠（Agencourt AMPure XP 磁珠）</td><td>贝克曼</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素包被的微量滴定板</td><td>Nalgene</td><td>734-1284</td><td></td></tr><tr><td>链霉亲和素-PE</td><td>Biolegend</td><td>405204</td><td></td></tr></tbody></table>

利用全基因组规模的crispr/cas9遗传筛选鉴定细胞表面受体

关键词：细胞表面受体，crispr/cas9，全基因组筛选，遗传筛选，功能基因组学，基因敲除，sgrna文库，流式细胞术，高通量筛选

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

膜结合型细胞表面受体之间的直接相互作用所介导的细胞间通讯，对于多细胞生物的正常发育和功能维持至关重要。然而，检测这些相互作用在技术上仍具有挑战性。本文描述了一种系统的全基因组规模CRISPR/Cas9基因敲除遗传筛选方法，可揭示特定细胞表面识别事件所必需的细胞通路。该检测方法利用在哺乳动物蛋白表达系统中产生的重组蛋白作为高亲和力结合探针，在基于细胞的遗传筛选中鉴定相互作用伙伴。该方法可用于鉴定由对应于膜结合受体胞外域的重组结合探针所检测到的细胞表面相互作用所必需的基因。重要的是，由于该方法具有全基因组规模的特性，其优势不仅在于能够鉴定直接的受体分子，还能发现受体在细胞表面正确表达所必需的其他细胞组分，从而为受体的生物学特性提供宝贵的见解。

本文描述了一种基于细胞的全基因组筛选方法，用于鉴定细胞外受体-配体相互作用。

利用全基因组规模的CRISPR/Cas9遗传筛选鉴定细胞表面受体

关键词：细胞表面受体，CRISPR/Cas9，全基因组筛选，遗传筛选，功能基因组学，基因敲除，sgRNA文库，流式细胞术，高通量筛选

膜表面受体介导的细胞间直接相互作用对于正常发育和……至关重要

利用目前可用的生物化学方法检测细胞表面相互作用仍面临技术挑战。本方案提供了一种基于全基因组规模细胞筛选的遗传学替代方法，用于鉴定细胞表面的受体-配体相互作用。与大多数现有方法不同，该方法不对受体的生物学特性作任何预设假设。该方法为识别由多种细胞表面分子介导的相互作用提供了机会。细胞表面分子可直接与单克隆抗体等药物结合，因此，鉴定这些分子所介导的相互作用可能具有重要的治疗意义。该方法普遍适用于对探索细胞信号传导和识别过程感兴趣的研究人员，可应用于多种生物学背景，包括神经和免疫相互作用以及宿主-病原体相互作用。本实验方案需要高通量细胞分选仪和下一代测序仪。在开始实验前，请确保这些设备可用。首先在96孔板中对生物素化蛋白样品进行八倍系列稀释，确保每种稀释液的最终体积至少为200微升，并包含一个仅带标签的对照。通过从每个孔中取出100微升并转移至新的96孔板，制备样品的重复板。包含一个仅带标签的蛋白质对照，该对照将在所有结合实验中用作对照探针。向其中一块板的孔中加入 100 微升浓度为 0.1 微克/毫升的链霉亲和素-PE，向另一块板的孔中加入 100 微升稀释缓冲液。在室温下孵育 20 分钟。同时，用稀释缓冲液封闭链霉亲和素编码板的孔，封闭 15 分钟。洗涤平板后，确保其完全干燥。然后将两块平板中样品的总体积分别转移至链霉亲和素编码平板的各个孔中，在室温下孵育一小时。孵育结束后，用200微升洗涤缓冲液洗涤平板三次。加入100微升小鼠抗大鼠Cd4d3+4 IgG，将酶标板再孵育1小时。重复洗涤步骤。加入100微升碱性磷酸酶标记的抗小鼠抗体，室温下放置1小时。然后用洗涤缓冲液洗涤各孔三次，再用稀释缓冲液洗涤一次。在显色乙醇胺缓冲液中配制浓度为1毫克/毫升的对硝基磷酸苯酯溶液，并向每孔加入100微升。37℃孵育15分钟后，在405纳米波长下测定各孔的吸光度。使用在平板上无信号的最低稀释度作为制备四聚体的合适稀释倍数。将链霉亲和素-PE与适当稀释的生物素化蛋白在室温下孵育30分钟。随后将偶联蛋白置于避光管中，在4°C保存，以备后续使用。将处理组和对照组样品的锥形管在200 × g条件下离心5分钟。弃去上清液，将其中一支试管中的沉淀在-20 °C冷冻保存以备后续使用。将另一支试管中的沉淀用含有1% BSA的10 mL PBS重悬，并在96孔板中留出100 µL细胞作为阴性对照。然后将预偶联的重组蛋白加入锥形管和96孔板中的细胞悬液中。在室温下，于4°C条件下，在旋转摇床上以温和旋转方式孵育至少一小时进行细胞染色。随后在200 × g离心5分钟使细胞沉淀，并弃去上清液。洗涤细胞两次后，将细胞重悬于 5 毫升 PBS 中。使用 30 微米细胞筛过滤，以去除细胞团块。随后使用流式细胞仪进行分析。使用阴性对照样本设门，筛选出BFP阳性且PE阴性的细胞。然后分选样本，将50万至100万BFP阳性且PE阴性的细胞收集到1.5毫升离心管中。分选得率取决于细胞与蛋白的结合情况，但通常可收集到PE阴性样本中1%至5%的细胞。现在将分选后的细胞在500 × g条件下离心5分钟，然后小心移除上清液。沉淀物可在-20摄氏度下保存长达六个月。使用Magic的计数功能将未分选和分选后群体的序列比对至参考文库，从而获得原始计数文件。使用未分选对照样本的原始计数作为对照，分选样本的计数作为处理，运行 magic 的测试功能。打开生成的基因汇总文件，将暂停秩（pause rank）列按升序排列。然后筛选出错误发现率小于 0.05 的显著结果。该受体通常排名较高，常位列第一。最后使用R或相应的软件绘制正向选择的稳健排名算法得分。分别在NCI-SNU-1和HEC-293细胞中进行了全基因组规模的基因敲降筛选，以鉴定人TNFSF9和恶性疟原虫或人TNFSF9和恶性疟原虫Rh5的结合伴侣。Rh5的结合行为受到硫酸乙酰肝素及其已知受体BSG的影响，而TN-FRSF-9在与可溶性肝素预孵育后，对其已知受体TN-FSF-9的结合能力未受影响。对照突变文库中的GNA分布显示，该文库的复杂性在实验过程中得以维持。通过比较靶向非必需基因参考集的gRNA所观察到的倍数变化分布与靶向必需基因参考集的分布，评估了筛选实验的技术质量。此外，通路水平的富集分析显示，在缺失基因群体中鉴定出预期的必需通路，并且这些通路显著富集。该分析基于对照样本与原始质粒文库的比较。稳健排序算法（RRA评分）可用于评估哪些G-RNA的排序 consistently 高于预期。在针对TNFRSF9的筛选中，排名最高的基因为TNFSF9，其为已知的结合伴侣。此外，还鉴定出多个与TP53通路相关的基因。对于RH5而言，除了已知的受体以及合成硫酸化糖胺聚糖（gags）所必需的基因外，还鉴定出了SLC16A1基因。这种筛选方法通常非常可靠，直接相互作用的受体基因在该群体富集基因列表中的排序应较高。对筛选获得的候选基因进行验证至关重要。如果该相互作用由蛋白质介导，则可采用设计用于研究二元蛋白质-蛋白质相互作用的生化方法进行进一步的验证研究。由于该方法具有无偏倚的全基因组规模特性，我们预期其将有助于探索由难以研究的细胞分子（如脂质、多次跨膜蛋白和聚糖）所介导的相互作用。该方法还可能揭示受体转运和生物学功能所必需的新信号通路。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

使用基因组-规模CRISPR/Cas9基因屏幕进行细胞表面受体识别

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使用荧光PCR-毛细管凝胶电泳技术高通量基因分型CRISPR/Cas9介导的敲除突变体

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HOX 基因座靶向的CRISPR/sgRNA文库筛选鉴定关键CTCF边界

CRISPR-Cas9 技术提供了一种高效的方法，可精确编辑任何细胞类型的哺乳动物基因组，并代表了一种进行全基因组遗传筛选的新手段。本文提供了一个详细方案，阐述了成功实施混合式全基因组 CRISPR-Cas9...

哺乳动物细胞中基于CRISPR的 pooled 遗传筛选

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在嵌合抗原受体T细胞中进行体外全基因组CRISPR敲除筛选

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通过结合CRISPR/Cas9技术与细胞计数评估造血干细胞和祖细胞的异常生长相关基因

通过应用全基因组CRISPR/Cas9筛选方法，系统而严谨地筛选辐射抗性与敏感性相关基因。该方案还可作为研究临床用药化学药物耐药机制的通用框架，适用于其他相关研究工作。...

全基因组CRISPR筛选揭示放射敏感与放射耐受基因

改进CAR T细胞中CRISPR-Cas9筛选：一种优化的文库构建方法

学习使用全基因组CRISPR/Cas9筛选技术识别细胞表面受体-配体相互作用的方法。该技术不依赖受体生物学先验知识，适用于神经科学、免疫学和宿主-病原体相互作用研究，具有重要的治疗应用前景。

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