Name: 具有更严格特异性的限制内核内核酶的体外定向进化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 了解利用体外区室化和定向进化技术对限制性内切酶进行定向改造的方法。该方案通过体外转录翻译和亚饱和诱变筛选具有更严格序列特异性的酶变体，为分子生物学和基因工程研究提供高效工具。

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本工作得到了科学与高等教育部资助（MB：0295/B/PO1/2008/34，KS：N301 100 31/3043）、波兰国家科学中心（NCN）资助（MB：UMO-2011/02/A/NZ1/00052、UMO-2014/13/B/NZ1/03991 和 UMO-2014/14/M/NZ5/00558）以及KS获得的EMBO短期奖学金（ATSF 277.00-05）的支持。

1. 胚胎干细胞的制备
<ol>
	<li>将待改造的限制-修饰系统中的甲基转移酶克隆至低拷贝数质粒（例如 pACYC184 或 pACYC174 或其衍生物）中。 
	注意：细菌宿主菌株必须能够耐受克隆酶引入的甲基化，并提供T7 RNA聚合酶的可诱导表达。推荐使用ER2566菌株（携带McrA、McrBC和Mrr突变）。</li>
	<li>通过用10单位同源限制性内切酶在供应商推荐的缓冲液和温度条件下处理0.5 µg质粒DNA 2小时，确认重组质粒DNA受到保护而不被同源限制性内切酶切割。</li>
	<li>制备该菌株的感受态细胞。 
	注意：可采用任意方法。NlaIV改造项目使用了简单的氯化钙法12。</li>
	<li>构建一个重组质粒，其中限制性内切酶的开放阅读框（ORF）受来自不同排斥组的T7启动子调控，并使用与步骤1.1中含甲基转移酶基因质粒不同的筛选标记。可使用pET28和pET30载体。</li>
	<li>通过引入同义突变，去除重组质粒中T7启动子与酶ORF终止密码子之间区域内的所有该工程酶识别位点（图2，表1A）。 
	注意：如果需要去除多个此类位点，则需进行多轮突变（步骤1.5.1–1.5.7）。
	<ol>
		<li>使用反向PCR反应扩增全长质粒，引物5'端设计有特定变异（表2A）。</li>
		<li>向50 µL PCR反应体系中加入10 U DpnI限制性内切酶，以去除模板DNA，在37 °C孵育2小时。</li>
		<li>通过琼脂糖凝胶电泳分离产物，切下对应于全长质粒的条带，并使用商业试剂盒纯化。</li>
		<li>加入10×连接缓冲液（至1×浓度），补充ATP（至1 mM），加入10 U T4多核苷酸激酶，在37 °C孵育20分钟。随后在70 °C加热10分钟以灭活酶活性。</li>
		<li>加入PEG 4000至终浓度5%，再次补充ATP（至1 mM），并加入5 U T4 DNA连接酶。室温（RT）孵育2小时。</li>
		<li>将连接产物转化至携带同源甲基转移酶的感受态细菌菌株中（步骤1.1）。</li>
		<li>小量提取质粒DNA，并通过双脱氧测序确认序列改变的引入。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在寡核苷酸引导突变所靶向的序列附近引入唯一的限制性酶切位点（图2，表1B）。对每个位点均执行步骤1.5.1–1.5.7。 
	注意：此步骤仅在使用靶向突变时进行。若进行随机突变，则跳过步骤2–3，直接进入第3节。在本示例中，所有位点均引入靶向区域上游，但也可引入下游。</li>
	<li>设计用于扩增ESC的引物（表1C）。
	<ol>
		<li>设计一条反向引物，结合于内切酶ORF下游，用于引入选定的识别位点（R1）及其较短版本（R2），其中R2位于选定的NlaIV序列外侧且5'端带有生物素（见图1）。</li>
		<li>设计一条正向引物（F1），结合于ESC中T7启动子上游。该引物还应引入原始识别序列的反向筛选变异体（即原始酶所能识别的序列变异中，排除所选反向序列之外的最大程度变异）。 
		注意：该引物的一个较短版本（F2），覆盖远离反向筛选序列的区域，将在后续的选择性PCR（步骤5.9）中使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 诱变引物的分割与混合合成
注意： 此步骤仅用于需要在多个位点进行亚饱和突变的项目。需要使用具有多个合成柱的合成仪。根据突变频率，分配用于合成随机化 NNS 密码子三联体和野生型密码子三联体的合成柱。例如，如果有七个等体积的合成柱可用，并且在特定位点期望的突变率为 0.3，则在约 0.3 × 7（即两个）柱中加入随机化 NNS 密码子，在约 0.7 × 7（即五个）柱中加入野生型密码子（图 3）。
<ol>
	<li>确定饱和突变的位点。根据位点假设重要性选择突变频率（即位点越重要，突变频率越高），同时考虑文库总体复杂性的限制（参见讨论部分）。</li>
	<li>从3'端开始计数，在第二个亚饱和诱变位点之前的三联体处停止，于所有列中合成寡核苷酸。不要移除&#160;最后一个合成循环中的5'-三苯甲基保护基（在合成仪上使用三苯甲基保留选项）。该保护基将在下一个合成循环开始时去除（步骤1） 图3).</li>
	<li>打开合成柱，将可控孔径玻璃（CPG）合成载体收集至干燥的1.5 mL离心管中，涡旋混匀。将混合均匀的CPG树脂重新分装至新的合成柱中。避免引入湿气，因为湿气会降低总产率（步骤2和4中的 图3).</li>
	<li>从亚饱和突变位点的三联体开始继续合成。根据所需的突变频率，将列分配为随机化的NNS三联体或野生型三联体（见上述注释）。如果存在额外的亚饱和位点，则仅进行至下一个亚饱和突变位点之前的三联体。同样，在末端保留5'-三苯甲基基团（合成仪上的5'-三苯甲基保留选项）（步骤3） 图3。然后继续执行步骤 2.3。</li>
	<li>如果下游不再有亚饱和位点，则完成合成，末端保留5'-三苯甲基（5'-三苯甲基保留选项，见合成仪上的步骤5） 图3).</li>
	<li>根据纯化柱制造商的说明，对寡核苷酸文库进行脱保护和纯化。 
	注意： 从CPG上经脱保护释放的寡核苷酸也可通过反相高效液相色谱（HPLC）进行纯化（三苯甲基保留），随后手动去除三苯甲基（室温下用80%乙酸处理1小时），再进行第二次HPLC纯化。</li>
	<li>在尿素-聚丙烯酰胺凝胶（urea-PAGE）中检测寡核苷酸文库的质量。</li>
</ol>
3. 构建突变文库
注意：使用第1.6步中的重组质粒。
<ol>
	<li>通过寡核苷酸定向诱变构建文库。 
	注意：也可选用EP-PCR方案（步骤3.2）。
	<ol>
		<li>扩增一段从T7启动子到位于目标诱变序列侧翼的特异性限制性内切酶位点之间的区域（若为NlaIV，则使用SalI、EcoRI或Eco52I）（表1B-C、表2B、图4）。第二部分则从该特异性限制性内切酶位点扩增至ESC的3'末端。</li>
		<li>分别将5 µL PCR反应产物（来自步骤3.1.1）与8 µL水、1.5 µL 10x限制性内切酶缓冲液及5单位相应的限制性内切酶（SalI、EcoRI或Eco52I）混合，并在适当温度下孵育2小时。</li>
		<li>采用琼脂糖凝胶电泳分离两个反应的产物。切下预期大小的条带，并使用商品化试剂盒进行纯化。</li>
		<li>将最多1/3的纯化产物上样至琼脂糖凝胶电泳，通过密度测定法测定每条纯化条带的浓度。</li>
		<li>以1:1的摩尔比，将两段ESC片段与1x连接酶缓冲液及1 U T4 DNA连接酶混合进行连接反应，在室温下孵育2小时。</li>
		<li>将连接反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分离。切下预期大小的产物，并使用商品化试剂盒纯化。</li>
		<li>使用引物F1和R2对纯化的连接产物进行PCR扩增（表1C和表2A）。扩增循环数不得超过20个。</li>
		<li>将PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分离。切下目标产物，并使用商品化试剂盒纯化。</li>
		<li>取前一步所得纯化文库的5 µL等分试样进行琼脂糖凝胶电泳，并通过密度测定法测定其浓度。</li>
		<li>克隆少量文库样本（最多5 µL），并对&#62;15个克隆进行测序，以检测突变频率和分布情况（表3）。随后进入步骤4。 
		注意：也可对少量ESC样本进行高通量测序。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行易错PCR（EP-PCR）。
	<ol>
		<li>使用引物F1和R1，从步骤1.5.7获得的质粒中扩增ESC。使用Taq I聚合酶进行20个循环的PCR扩增（表1B）。</li>
		<li>对PCR产物进行凝胶纯化。</li>
		<li>以2 ng上一步纯化的PCR产物为模板，使用引物F1和R1进行15个循环的EP-PCR反应（表1C）。</li>
		<li>对EP-PCR产物进行凝胶纯化，并通过凝胶密度测定法定量。 
		注意：由于纯化的EP-PCR产物浓度较低，用于定量的部分应约为总量的1/3。</li>
		<li>克隆少量文库样本（最多1/5），并对&#62;15个克隆进行测序，以检测突变频率和分布情况（表4）。 
		注意：也可对少量ESC样本进行高通量测序。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 进行区室化的体外转录-翻译反应
<ol>
	<li>在体外转录-翻译系统中检测核酸内切酶的表达及酶活性。
	<ol>
		<li>制备一段较短（200–500 bp）的底物DNA，其中包含一个位于分子中心附近的特异性识别位点，以便于检测切割反应。 
		注意：制备该底物最简便的方法是通过PCR扩增任意DNA分子中的合适片段。底物可进行放射性标记或荧光标记，以简化切割产物的检测。</li>
		<li>按照制造商的建议，设置50 µL的转录-翻译反应体系，加入0.5 µg野生型ESC。将镁盐（可测试MgCl2、MgSO4或醋酸镁）添加至终浓度1.5 mM，并加入上一步中适量的底物（若为未标记DNA，至少0.5 µg）。 
		注意：可使用任何不含镁离子激活的核酸酶的转录/翻译试剂盒。某些厂商在生产过程中使用核酸酶去除DNA污染，随后添加螯合剂作为核酸酶抑制剂。此类试剂盒不适用于本方法。</li>
		<li>根据制造商说明书孵育转录-翻译反应体系，随后将反应混合物转移至限制性内切酶的最适温度下孵育2小时。</li>
		<li>通过琼脂糖凝胶电泳分析底物的切割情况，并采用适当方法进行检测（如DNA染色、荧光成像或放射自显影）（图5）。 
		注意：在进行分隔化操作前，必须实现底物的至少部分切割。若未达到此效果，需进一步优化镁盐的化学形式或其浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在15 mL锥形管中，向5 mL矿物油中加入225 µL Span 80和25 µL Tween 80，配制油-表面活性剂混合液。轻柔倒置管子15次，充分混匀。</li>
	<li>为每个文库准备一个2 mL圆底低温冻存管，向其中加入950 µL上述油-表面活性剂混合液，标记文库名称后置于冰上。向每管中放入一根小型圆柱形搅拌子（5 × 2 mm2）。</li>
	<li>根据制造商建议，配制体外转录-翻译反应混合液（每个文库50 µL）。向混合液中补充氯化镁，使其终浓度为1.5 mM（参见步骤4.1.4）。</li>
	<li>将50 µL反应体系分装至预冷的1.5 mL离心管中，置于冰上。</li>
	<li>向冰上的反应体系中加入1.7 fmol文库DNA（来自第3部分）。 
		注意：为保证筛选效率，请勿使用更高量的表达文库。必须尽量降低单个水相液滴中包含多个DNA分子的频率。</li>
	<li>依次为每个文库制备水包油乳液。
	<ol>
		<li>将装有冰的小烧杯（或大瓶盖）放置于磁力搅拌器上，调节搅拌速度至1,150 rpm。</li>
		<li>将步骤4.3中含950 µL油-表面活性剂混合液及小搅拌子的低温冻存管转移至冰浴中的烧杯内，确认搅拌子正常旋转。</li>
		<li>在2分钟内，每隔30秒加入10 µL体外文库-转录-翻译反应混合液，共加入五次，加完后继续搅拌1分钟。将含有乳液的冻存管转移至冰容器中。随后从步骤4.7.2开始处理下一个文库。</li>
		<li>所有文库处理完毕后，按照试剂盒制造商的建议开始孵育所有样品。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将冻存管转移至工程化核酸内切酶的最适反应温度下继续孵育2小时，然后置于冰上至少10分钟。</li>
</ol>
5. 文库的持续处理与筛选
<ol>
	<li>将乳液从冻存管转移至预冷的1.5 mL离心管中，加入1 µL 0.5 M EDTA，并在室温下以13,000 × g 离心5分钟。</li>
	<li>用移液器去除上层油相。若未见油水界面，将离心管在-20 °C孵育至少5分钟以冻结水相，随后立即吸出液态油相。</li>
	<li>加入100 µL 10 mM Tris-HCl（pH 8.0），并立即加入150 µL苯酚:氯仿（1:1 v/v）进行抽提，短暂涡旋混匀后，在13,000 × g 条件下离心30秒以实现相分离。收集上层水相。</li>
	<li>通过加入0.1倍体积（15 µL）的3 M醋酸钠（pH = 5.2）、2.5–5 µg糖原&#160;以及2.5倍体积（375 µL）乙醇沉淀DNA。在-20 °C孵育1小时，然后在4 °C、13,000 × g 条件下离心15分钟。弃去上清液，并用1 mL预冷的70%乙醇短暂洗涤沉淀。</li>
	<li>在真空浓缩仪中干燥DNA/糖原沉淀，或在空气中干燥&#62;5分钟。</li>
	<li>将沉淀溶解于50 µL 10 mM Tris-HCl（pH = 7.5）中。加入5 µL按制造商说明制备的链霉亲和素磁珠，在室温下混匀1小时，建议使用旋转混合仪或轻柔涡旋。</li>
	<li>将磁珠置于磁力架上分离，收集富含非生物素化DNA的液体部分。</li>
	<li>通过乙醇沉淀法浓缩DNA（步骤5.4–5.5）。</li>
	<li>将上一步获得的浓缩DNA溶解于5 µL水中，并作为PCR反应的模板，使用F2和R1引物（表1A）。 
	注意：为避免模板污染并最小化PCR假象，应使用Taq DNA聚合酶（而非Pfu或Phusion），进行18–20个循环，延伸时间与模板长度成正比（1 kb = 1分钟）（见表2B）。</li>
	<li>将PCR产物在琼脂糖凝胶中进行电泳分离，并切下预期大小的条带。若出现轻微拖尾，表明存在不同大小的产物（见图6）。使用商业化试剂盒从凝胶中纯化DNA。</li>
	<li>以步骤5.10中获得的最多50 ng DNA为模板，使用引物F1和R2，按照步骤5.9相同的方案进行第二轮PCR反应。后续产物纯化步骤同5.10所述。经琼脂糖凝胶密度测定法（而非紫外分光光度法）定量后的纯化DNA可用于下一轮体外筛选（步骤4.6）。</li>
</ol>
6. 筛选具有改变序列特异性的变异体
<ol>
	<li>克隆选定的突变体。
	<ol>
		<li>使用适当的限制性内切酶（用于将ORF克隆至表达载体中，如NlaIV使用NcoI和XhoI），在酶供应商推荐的温度和缓冲液条件下，将第5.10步的产物消化2小时。通过琼脂糖凝胶电泳分离产物，并回收预期大小的DNA片段。</li>
		<li>用与步骤6.1.1相同的双酶切方法处理质粒载体（例如pET28），并通过商业化的DNA凝胶纯化试剂盒对产物进行凝胶纯化。</li>
		<li>通过琼脂糖凝胶电泳结合密度测定法估算载体和插入片段的浓度。</li>
		<li>在酶供应商推荐的1×连接酶缓冲液中，使用1–5 U的T4 DNA连接酶，按载体与插入片段摩尔比1:3–1:5进行连接反应。室温孵育2小时，随后通过转化或电穿孔法将连接产物导入合适的宿主菌（来自步骤1.3）12。</li>
		<li>在含有适当抗生素（pET28或pET30载体使用50 µg/mL卡那霉素）和1%葡萄糖的LB平板上筛选转化子。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>表达蛋白突变体。
	<ol>
		<li>从转化平板上挑取单菌落（一次实验最多可处理24个克隆），接种至含卡那霉素（50 µg/mL）和1%葡萄糖的2 mL LB培养基中，37 °C振荡培养过夜。</li>
		<li>取0.75 mL过夜培养物接种至15 mL预热（37 °C）的LB培养基中（含100 µg卡那霉素，不含葡萄糖），37 °C剧烈振荡培养。 
		注意：可使用50 mL离心管或100 mL锥形瓶。</li>
		<li>向1 mL过夜培养物中加入176 µL甘油（终浓度为15%），充分混匀后于-70 °C冷冻保存。</li>
		<li>培养2–3小时后，向15 mL培养物（来自步骤6.2.1）中加入IPTG至终浓度1 mM，继续培养5小时。</li>
		<li>离心收集菌体沉淀（10,000 x g，4 °C，10 min），并于-70 °C冷冻保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纯化蛋白突变体。
	<ol>
		<li>用宽口移液枪头将20 µL镍亲和树脂悬液转移至含200 µL B1缓冲液的1.5 mL离心管中，轻轻混匀后离心（5,000 x g，30 s，4 °C）。用移液器吸除上清液，将离心管置于冰上备用。</li>
		<li>用剧烈涡旋法将步骤6.2.5获得的菌体沉淀重悬于300 µL B1缓冲液中，转移至1.5 mL离心管。</li>
		<li>加入3 µL 100×蛋白酶抑制剂混合液和溶菌酶溶液（B1缓冲液中终浓度为1 mg/mL）。使用带探头的超声仪进行细胞裂解，每样本进行6次、每次10秒的超声处理，两次之间探头在冰上冷却时间超过&#62;15秒。全程保持细胞悬液处于冰上。</li>
		<li>离心去除细胞碎片（2 min，12,000 x g，4 °C），取250 µL上清液加入步骤6.3.1准备的树脂中。</li>
		<li>在低温环境中孵育15分钟，建议使用旋转混合仪或轻柔涡旋混匀。</li>
		<li>离心（5,000 x g，30 s，4 °C），用移液器吸除上清液。</li>
		<li>加入500 µL洗涤缓冲液（W缓冲液），轻柔重悬树脂，离心（5,000 x g，30 s，4 °C），用移液器吸除上清液。</li>
		<li>重复步骤6.3.7。</li>
		<li>加入20 µL洗脱缓冲液（E缓冲液），轻柔重悬树脂，冰上静置2–5分钟。离心（5,000 x g，30 s，4 °C），收集上清液。</li>
		<li>重复步骤6.3.9，合并上清液。</li>
		<li>取5–10 µL样品进行SDS-PAGE分析（图7）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>筛选具有改变特异性的突变体。
	<ol>
		<li>检测突变体对噬菌体λ DNA的切割活性。蛋白样品体积最多可占反应总体积的10%。建议初始条件为每0.5 µg DNA加入2 µL蛋白样品，反应时间2小时。</li>
		<li>通过琼脂糖凝胶电泳分析反应产物，并与野生型酶的切割产物进行比较。选择切割图谱明显不同于野生型酶的克隆进行后续分析（图8）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Howland, J. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHowland%2C+JL+%22Short+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Short Protocols in Molecular Biology</a>. Ausubel, F., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. , Third edition, John Wiley & Sons. New York. (1995).</li>
<li>Wilson, D. S., Keefe, A. D. Chapter 8 Unit 8.3: Random mutagenesis by PCR. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilson%2C+DS+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22">Current Protocols in Molecular Biology</a>. , John Wiley & Sons. New York. (2001).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述筛选方案已用于测试NlaIV8，这是一种二聚体PD-(D/E)XK折叠结构的限制性内切酶，可识别具有中央NN碱基的回文靶位点，并在NN碱基之间催化产生平末端切割。选择NlaIV的原因在于，其在NN碱基之间发生切割表明，在复合物中这些碱基靠近蛋白质。原则上，该方案可适用于任何序列特异性的限制性内切酶，无论其为单体或二聚体、属于任何折叠类型，且无论其催化双链断裂产生何种交错末端，也不论催化结构域与特异性识别结构域是否重合（如NlaIV示例）或分离（例如FokI）。此外，该方案原则上不仅可用于获得具有更窄特异性的新酶，还可用于消除星号活性（star activity），或构建高保真内切酶。然而，上述应用尚未经过全面验证。特别是，靶向消除星号活性可能较为复杂，因为相同的氨基酸残基可能同时参与对期望靶标和非期望靶标碱基的结合。本方案中描述的体外步骤不仅限于筛选特异性更窄的变体，也可用于筛选其他类型的特异性改变。然而，对于特异性发生改变的内切酶变体，存在一个问题：如果其底物谱包含亲本内切酶无法切割的新靶标，则通常难以有效保护细胞免受该酶活性带来的有害影响。相比之下，若内切酶的特异性仅被缩小，则其靶标为野生型靶标的子集，因此已有的对应甲基转移酶应能提供完全保护。
本实验方案在多个方面不同于传统的定向进化方案。开放阅读框的多样性仅在实验开始时生成一次，而非在每一轮迭代中都进行。此外，该多样性是通过分组混合合成（split-and-mix synthesis）产生，而不是通过错误倾向PCR（EP-PCR）实现。对于本研究中所采用的密码子NNS替换方式，六个位点的组合数为(4 × 4 × 2)6 ≈ 1.07 × 109。因此，在1.7 fmoles的ESC中，平均每个特定变异体仅出现一次。通过使用Glen Research公司提供的含有20种三核苷酸前体的混合物进行合成，或将分组混合寡核苷酸合成策略用于突变频率较低的位点，可将该能力扩展至七个位点。如果可能，建议将变异范围限制在六个位点以内。显然，这种靶向诱变需要对限制性内切酶（REase）中参与底物结合的区域至少具备一定的先验知识。与EP-PCR相比，分组混合合成策略在产生多样性方面具有明显优势。在对NlaIV ESC进行EP-PCR时，我们曾在同一次反应中同时获得未发生改变的野生型序列以及携带八个突变的序列（表4）。EP-PCR构建的文库中含有大量应避免的克隆，包括野生型序列、多重突变、移码突变和无义突变，以及发生在不太可能影响序列特异性位点上的突变。
我们的方案与许多其他定向进化方案的不同之处在于包含两个连续的选择步骤。阳性选择确保保留所需活性，否则生物素标签不会被去除，编码序列可通过下拉法去除。从技术上讲，如果在期望的切割位点附近（而非其他位置）存在合适的切割位点，则偶然出现新的、不重叠的特异性（例如GCATGC）也可能导致生物素标签被切断。然而，这种情况极不可能发生。阴性选择则用于去除编码仍保留非期望活性酶的开放阅读框。此步骤并非绝对必需，因为该方案仍可富集那些能够切割选择序列但无法在ESC其他位置切割的变体，从而使其不适合PCR扩增。然而，选择效率预计会较低，因为具有原始序列特异性的酶不会被清除，从而会优于那些特异性已改变但酶活性有所下降的有前景变体。请注意，在群体水平上，期望和非期望的靶序列均可为简并序列，但并非必须如此。在NlaIV示例中，反靶序列为简并序列，而靶序列为非简并序列。即使在群体水平上存在简并性，在单个液滴中仅存在一个（非简并的）靶序列或反靶序列。在我们的方案中，靶序列和反靶序列在每轮选择步骤中都会被重新引入。因此，只有编码能够切割所有可能靶序列、同时不能切割任何反靶序列的酶的开放阅读框，才能在多轮选择中存活下来。需要注意的是，由于在每轮迭代中都必须重新引入反选择靶序列，因此强制进行两次连续的PCR。第一次PCR使用与反靶序列外部区域退火的引物，从而使反靶序列的切割能够阻断PCR反应。第二次PCR则需要一个跨越反靶序列的引物，并重新引入反靶序列，以确保在多轮选择过程中，每个开放阅读框均被测试针对所有反靶序列变体的耐受性。
对于产生黏性末端的酶，可采用一种基于先前报道的REase ORF分离方法的替代方案10。在我们的实验中使用的通过生物素捕获去除无活性变异体的步骤，在该替代方案中被替换为连接带有特定序列的兼容性接头，该序列在选择性PCR中作为引物结合位点（图9）。只有那些产生具有目标特异性的酶的ESC才能形成可连接的末端，从而被筛选出来。所设计的反向选择序列的黏性末端序列必须确保其无法与接头发生连接反应。通过在选择性PCR中交替使用两种不同的接头以及相应的两种不同的反向引物，可轻松实现筛选过程的迭代。
即使采用新的实验方案，在体外构建具有新特异性的酶仍然极具挑战性。对于典型的II型限制性内切酶（REases），其序列特异性与内切核酸酶活性依赖于相同的蛋白质区域，因此在改变其中一个特性的同时不影响另一个特性十分困难。若采用一种综合考虑酶的作用位点、尊重蛋白质- DNA 相互作用对称性，并基于预先存在的酶学偏好的策略，则更有可能获得成功；这种酶学偏好应通过生化实验事先确定，正如NlaIV的例子中所进行的那样8。

对于II类限制性内切酶（REases），序列特异性工程改造极具挑战性。在这类核酸内切酶中，序列识别与催化作用紧密关联，这很可能是一种进化上的保护机制，用以防止产生比其对应的甲基转移酶具有更广特异性的核酸内切酶，从而避免对宿主DNA造成损伤。在细胞中通过定向进化获得新的特异性时，还需额外保护宿主DNA免受新构建的核酸内切酶活性的影响，这进一步增加了实验难度。因此，目前已报道的REase工程改造成功案例极少，且所有这些研究均利用了特定酶的独特性质1,2,3,4,5,6,7。
本文提供了一种详细的特异性改造方案，可用于构建比亲本酶特异性更严格的核酸内切酶变体，该方案基于我们成功改造NlaIV核酸内切酶的经验8。对于具有任意识别序列的此类酶，均可在识别序列侧翼区域引入额外的特异性。对于识别部分简并序列的亲本酶（例如识别GGNNCC靶序列的NlaIV），还可以在识别序列内部引入额外的特异性。由于新增特异性通常需要蛋白质与DNA之间形成新的相互作用，因此新识别的碱基应位于亲本核酸内切酶在DNA上的结合区域（footprint）之内。原则上，可针对任何期望的识别序列特化模式设计筛选策略。然而，大多数识别回文或近回文靶序列的限制性内切酶均为功能性二聚体，仅识别回文序列的一半位点。因此，若新特异性破坏了蛋白质-核酸相互作用的对称性，则此类筛选策略很可能无法奏效。以二聚体NlaIV为例，理论上可将GGNNCC序列特化为GGATCC，但将其特异性进一步限定为GGAACC则预期更为困难。我们的方案包含阳性筛选和阴性筛选两个部分。
当同时采用负向筛选以去除能够切割除优选的较窄特异性序列以外所有序列的酶时，该过程效率更高。例如，可将针对GGATCC的筛选与针对GGBVCC的反向筛选相结合（其中B代表除A以外的任何碱基，V代表除T以外的任何碱基）。当部分可能的目标序列未被覆盖时，筛选实验的结果取决于正向和负向筛选的效果。在我们对NlaIV的研究中，我们进行了针对GGATCC的筛选，并对GGSSCC（其中S为G或C）进行反向筛选，最终获得的特异性可描述为GGWWCC（其中W为A或T），忽略对称性破坏的目标序列，这表明在此特定情况下，负向筛选比正向筛选更为重要。
我们的方法始于构建表达选择盒（ESC）。ESC由多个区段组成。在内部核心区段中，包含在T7启动子控制下的限制性内切酶（REase）开放阅读框（ORF）的不同变体。该ESC的核心区段中不能含有任何与所设计的REase对应的识别位点。核心区段两侧分别夹有野生型REase的两个对应识别位点：一个是非期望活性的切割位点（反向选择序列，本例中为GGSSCC），另一个是期望活性的切割位点（选择序列，本例中为GGATCC）。ESC制备的最后一步是通过PCR在5'端靠近期望活性位点处引入生物素，并生成多种反向选择序列（本例中为GGSSCC）。选择策略依赖于在体外转录/翻译/选择流程之后，使用精心设计的引物对ESC进行再扩增（图1A）。ESC文库在体外以水包油乳液形式进行区室化的转录与翻译9,10,11。在每个液滴内，所表达酶的特异性会影响ESC的状态（图1B，步骤I）。在本描述的结构中，翻译出的蛋白所具有的期望切割活性会移除DNA上的生物素标签，但不会影响另一端带有反向选择序列的ESC末端。当乳液破裂后，通过链霉亲和素亲和沉降去除带有生物素的片段，仅保留来自具有期望活性液滴的片段（图1B，步骤II）。此步骤可去除无活性的REase变体。沉降后的上清组分随后通过PCR进行扩增。第一轮PCR使用引物F2和R1（图1A,B，步骤III）。引物F2结合于反向选择序列与分子末端之间的ESC区段。因此，对于表达出能够切割反向选择序列的变体的ESC，其F2与R1的结合位点会被分割至两个不同的DNA分子中，从而无法扩增，进而从文库中被剔除。引物R1结合于选择位点与ESC核心之间，因此不受选择位点切割状态的影响，并可恢复期望活性的切割位点（GGATCC）。随后通过第二轮PCR（使用引物F1和R2）完成循环，该步骤在5'端靠近选择位点处重新添加生物素，并在ESC另一端附近的反向选择位点处恢复设计的变异（图1B，步骤IV）。所得的DNA混合物即可用于下一轮选择。
筛选方案的成功在很大程度上取决于对新的、更严格的目标识别序列的恰当选择，以及对诱变策略的精心设计和有效实施。由于在限制性内切酶（REase）已有的微弱偏好基础上进行优化远比克服这些偏好更容易，因此我们建议首先开展对其已有偏好的动力学研究。诱变设计必须谨慎的原因在于，本方案所能处理的突变体文库规模有限（单次实验最多处理109个克隆）。因此，仅能在少数几个位点有效检测全部20种可能的氨基酸替换（见讨论部分）。采用随机诱变方法（如作为替代方案提供的易错PCR，EP-PCR）将导致对现有复杂性的严重取样不足。如果有关于可能参与DNA相互作用的氨基酸位点（或甚至位于对应序列中可变核苷酸附近区域的位点）的任何信息可用，则应充分利用这些信息，以选择少数几个位点进行寡核苷酸引导的饱和诱变（方案步骤1.6–3.10）。

<table><tbody><tr><td>1000&amp;Aring; CPG 载体（dA、dT、dC、dG）</td><td>Biosset</td><td>45-1000-050</td><td>也可使用其他供应商的产品</td></tr><tr><td>ASM-800 DNA/RNA 合成仪</td><td>Biosset</td><td>800-001-000</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET 凝胶回收试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0691</td><td>可使用任何其他同类试剂盒</td></tr><tr><td>Glen-Pak DNA 纯化柱</td><td>Glen Research</td><td>60-5200</td><td></td></tr><tr><td>HIS-Select 镍亲和凝胶</td><td>Sigma</td><td>P6611</td><td></td></tr><tr><td>pET 28a 载体</td><td></td><td></td><td>可使用任何在克隆位点上游含有 T7 启动子的其他载体替代</td></tr><tr><td>Phusion 高保真 DNA 聚合酶</td><td>Thermo Scientific</td><td>F530S</td><td>可使用其他高保真且高效延伸的嗜热聚合酶替代</td></tr><tr><td>多孔钢箔</td><td>Biosset</td><td>40-063</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Translation System&lt;br/&gt; RTS 100, E.coli HY 试剂盒</td><td>Roche</td><td>3 186 148</td><td></td></tr><tr><td>限制性内切酶</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>显然也可使用其他供应商的酶</td></tr><tr><td>链霉亲和素磁珠</td><td>New England Biolabs</td><td>S1420S</td><td>也可使用其他供应商的产品。我们已成功测试过 Sigma 的磁珠</td></tr><tr><td>合成试剂，包括亚磷酰胺</td><td>Carl Roth</td><td></td><td>也可使用其他供应商的产品</td></tr><tr><td>合成柱（不同规格）</td><td>Biosset</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td>可使用任何其他连接酶</td></tr></tbody></table>

体外定向进化具有更高特异性的限制性内切酶

In Vitro Directed Evolution of a Restriction Endonuclease with More Stringent Specificity

限制性内切酶（REase）特异性改造极为困难。本文描述了一种多步骤方案，有助于获得比亲本酶特异性更强的REase变体。该方案需要构建一个表达选择盒（ESC）文库，用于产生REase的变体，理想情况下在可能影响DNA结合的位点引入变异。ESC的一侧包含所需限制性酶切位点序列及生物素标签，另一侧包含非期望活性的限制性酶切位点以及引物退火位点。ESC在油包水乳液中进行转录和翻译，实验条件确保每个液滴中包含多个DNA分子的可能性极低。因此，每个ESC分子中的DNA仅受到其所编码表达的酶的作用。具有所需特异性的REase变体会切除生物素标签，但不会切除引物退火位点。乳液破乳后，对DNA分子进行生物素下拉富集，仅保留上清液中的DNA分子。此步骤确保仅保留未丧失所需活性的变体对应的ESC。随后对这些DNA分子进行第一轮PCR扩增。非期望序列的切割会移除其中一个引物的结合位点，因此PCR仅扩增来自无非期望活性液滴的ESC。接着进行第二轮PCR，以重新引入所需特异性的限制性酶切位点和生物素标签，从而使选择步骤可重复进行。所筛选出的开放阅读框可在细菌细胞中过表达，这些细胞同时表达亲本REase对应的甲基转移酶，因为新进化出的REase仅靶向甲基转移酶靶位点的一个子集。

本方案仅是一种通过减少（但不完全消除）两类不需要的酶——无活性的酶和保持原有野生型序列特异性的内切核酸酶——来提高目标工程化限制性内切酶（REase）变体出现频率的工具。另一方面，由于改变限制性内切酶特异性极为困难，因此在一次仅筛选24个克隆的实验中，若能发现一个其切割模式与野生型酶不同的变体，即应视为成功。在我们的实验中，最佳筛选结果可鉴定出高达20%的有前景变体（图8A）。
阳性结果在很大程度上依赖于文库的质量（即突变频率较低且分布随机）以及对生物素化文库成员的有效捕获（步骤 3.6–3.7）。这两个问题均可被检测。应在筛选前通过测序尽可能多的克隆（>15 个）或通过高通量测序对文库进行直接测序（步骤 3.10，表 3）来检查文库质量。如果大多数被选中的克隆均无活性，则明确表明链霉亲和素捕获筛选失败。在经历多次筛选循环的文库中也会观察到类似现象，因为此类文库很可能被那些逃逸了链霉亲和素捕获筛选步骤的无活性变体所主导（图 8B）。因此，建议在每次筛选循环后进行筛选，并进一步手动挑选有前景的变体进行开发，而不是依赖于连续的筛选迭代。
<img alt="体外转录-翻译示意图；基因筛选，PCR过程；链霉亲和素捕获。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：基于NlaIV工程化改造的新型序列特异性体外筛选。（A）表达/筛选盒（ESC）的结构包含两种限制性内切酶（REase）识别位点：1）靠近右端的筛选序列（GGATCC）和2）靠近左端的反向筛选序列（GGSSCC），以及T7p和T7t——分别为T7启动子和T7终止子。引物结合位点如图下方所示。野生型和筛选获得的NlaIV变体的切割位点分别用红色和绿色三角形表示。（B）筛选循环步骤：I）将体外转录-翻译-切割反应混合物与ESC文库进行乳化；II）所有生物素标记的DNA通过链霉亲和素包被的磁性颗粒被捕获并去除，从而消除编码无活性变体的DNA；III）编码具有野生型活性的REase（即能够切割GGSSCC序列）的ESC因该序列被切割而使正向和反向引物结合位点分离，无法进行扩增，从而被剔除；IV）通过在右端重新添加生物素，并在左端重新引入反向筛选序列的变异，生成下一轮筛选的输入文库。转载自Czapinska等8，经Elsevier许可授权。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="包含限制性酶切位点、酶（NlaIV, EcoRI）和方向性箭头的遗传图谱示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：ESC的制备。 来源于表达载体中原有构建体的片段，该载体包含在T7启动子控制下的NlaIV ORF，经修饰后适用于表达/筛选。在NlaIV ORF下游的NlaIV位点被去除，并在NlaIV ORF中引入了用于定点诱变的唯一酶切位点（SalI、EcoRI和Eco52I），这些突变为同义突变。最终构建体通过引入两个侧翼NlaIV位点的引物进行扩增：左侧为反向筛选序列（GGSSCC），右侧为筛选序列（GGATCC）。反向引物还引入了生物素。用于构建突变型ECS的引物以蓝色箭头表示，并在下方标注（见表1B,C）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看本图的放大版本。</a>
<img alt="基因合成与诱变过程；DNA序列突变；实验设计示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：分割与混合合成示意图。 本示例涉及MutB引物的合成，其中在四个位点以0.8的频率引入了NNS序列（另见表3）。请注意，化学合成是从3'到5'方向进行的，但所有序列均以标准的5'-3'方向表示（即在本图中从右向左进行）。突变位点上的野生型序列以绿色显示，而NNS诱变序列以红色显示。用于后续在ESC中引入突变的SalI识别位点以下划线标出。混合与分割步骤的位置（步骤2和4）已标明。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因编辑示意图，显示 NlaIV.R 酶、SalI 消化及 DNA 连接过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：在寡核苷酸靶向诱变中利用独特的限制性酶切位点。 以构建文库 A-C 的示例（见步骤 3.1–3.7）展示引入突变的策略。经 Elsevier 授权转载自 Czapinska 等8。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示DNA分离、条带及用于遗传分析的1-4泳道的凝胶电泳图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 5"> 
图5：体外转录-翻译系统中的内切核酸酶切割。（A）在最佳限制性内切酶缓冲液中对测试底物的切割：1）底物，含单个NlaIV识别位点的612 bp PCR产物；2）切割产物，分别为355 bp和257 bp。（B）在体外转录-翻译反应（含0.5 µg ESC）中的切割：1–2）不含底物的15 µL体外转录-翻译反应等分试样（第2行：反应中添加1.5 mM MgCl2）；3–4）含1 µg测试底物的15 µL体外转录-翻译反应等分试样（第4行：反应中添加1.5 mM MgCl2）。S-DNA分子量标记物（pBR322经MspI消化）。样品在6%非变性PAGE中电泳分离。DNA用溴化乙锭染色。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电泳凝胶、DNA分离、实验装置、右侧为大小标记、分析结果" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：筛选循环中第一轮PCR的产物。 参见图1B，步骤III；实验方案步骤5.10。第1组和第2组为两个不同文库的等分试样，均以三份上样。S-DNA大小标准（经HindIII和EcoRI消化的lambda DNA）。箭头指示全长ESC（1,050 bp）的位置。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示蛋白质分离的电泳图；分子量分布分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 7"> 
图7：NlaIV 变体经纯化后用于小规模进一步筛选。 参见步骤 6.3.11。每条泳道含有 10 µL 不同变体的等分试样。S-蛋白质分子量标准。NaIV 限制性内切酶亚基的分子质量为 29.9 kDa。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示DNA分离及用于分析和比较的条带模式的凝胶电泳图" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 8"> 
图8：NlaIV变体在序列特异性改变方面的筛选示例。 参见步骤6.4.2。(A) 成功筛选，具有较高频率的有前景变体。S = DNA分子量标记物，经HindIII和EcoRI酶切的λDNA；野生型（wt）= 经野生型NlaIV酶切的λDNA；λ = λDNA底物，未被酶切；其他列 = 活性极低的变体。变体标注如下：! = 产生与野生型酶不同的酶切图谱的有前景变体；? = 可能具有改变的序列偏好的变体。(B) 筛选失败，大多数变体无活性，且有一个变体显示出明显未改变的酶切图谱。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="基因编辑过程；DNA序列切割、接头连接、选择性PCR示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60807/60807fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图9"> 
图9：通过连接进行的替代筛选。 此替代方法可用于所有产生黏性末端的限制性内切酶（REases）。此处我们展示了一个针对MwoI酶的筛选方案示例（未发表）。I) 选定序列（位于ESC的右端），其中红色显示为定义的残基，蓝色显示为对应序列的选定变异；括号中为位于ESC左端的反向筛选序列；II) MwoI切割产物；III) 体外转录/翻译终止后，对产物进行纯化，并使用过量接头进行连接反应。只有在选定序列处被切割的产物才能参与连接，因此无活性的变异体被消除，无需进行下拉步骤。反向筛选序列中的切割产物（位于ESC左端，图中未显示）无法参与此连接反应，因为接头突出端与反向筛选序列不互补；IV) 选择性PCR采用与主方案相同的策略，使用F1引物（结合位点远离反向筛选位点）以消除具有野生型简并序列特异性的变异体，而无活性变异体则通过选择性反向引物被消除，该引物无法结合未切割（因而未被接头连接修饰）的右端。在下一个循环中，可使用与前一步骤切割产物相同的接头（即，图III中的“已切割盒式结构”）以及合适的选择性反向引物重复该过程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/60807fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
表1：NlaIV基因工程中使用的引物。 注释中提到的限制性酶切位点序列已加下划线。小写字母表示在DNA模板中没有互补序列的区域。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table1.xlsx" target="_blank">请点击此处查看该表格（右键单击可下载）。</a>
表2：本实验方案中使用的PCR反应条件。 Tm = 引物熔解温度（若引物的Tm不同，应使用较低的Tm值）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table2.xlsx" target="_blank">请点击此处查看该表格（右键单击可下载）。</a>
表3：采用分割混合策略合成的两条诱变引物的质量检测结果。 发生诱变的密码子以 [XXX] 标注。下标数字表示编码氨基酸的位置。改编自 Czapinska 等人8，经 Elsevier 许可。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table3.xlsx" target="_blank">请点击此处查看该表格（右键点击可下载）。</a>
表4：EP-PCR结果。 通过ECS的22个克隆序列分析得出的主要参数。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60807/table4.xlsx" target="_blank">请点击此处查看该表格（右键点击可下载）。</a>

可以从识别部分简并序列的酶出发，开发出具有新序列特异性的限制性内切酶。本文提供了我们成功用于改变NlaIV酶序列特异性的详细实验方案。该方案的关键要素包括转录/翻译反应的体外区室化，以及具有新序列特异性的变体筛选。

限制性内切酶（REase）特异性改造极为困难。本文介绍了一种多步骤实验方案，有助于获得REase……

本实验方案利用体外区室化技术及一种独特的定向进化筛选策略，可构建出具有改变且更严格序列特异性的限制性内切酶。该方法具有潜在的普适性，因其可适用于任何限制性内切酶，并且筛选可针对原始识别序列的任何更严格变体进行。若新构建的变体通过体外转录-翻译系统表达，则该方案不仅适用于缩小酶的特异性范围，还可用于改变其特异性。确定亚饱和突变的位点时，应根据这些位点假设的重要性选择相应的突变频率，同时需考虑整个文库复杂性的限制。开始合成时，将装有新树脂的柱子插入合成仪中。在所有柱子中合成寡核苷酸，直至从三端开始计数的第二个亚饱和突变位点之前的三联体。合成时在5'端保留三苯甲基保护基。该保护基将在下一个合成周期开始时被去除。打开合成柱，短暂离心至干燥的1.5毫升离心管中以收集树脂。取出CPG合成载体，并通过涡旋振荡混匀。将混合后的CPG树脂重新分装至新的合成柱中。避免引入湿气，因为湿气会降低总产率。从亚饱和突变位点的三联体开始继续合成。根据所需的突变频率，将列分配给随机化的 NNS 三联体或野生型三联体。如果存在其他亚饱和位点，则仅进行到下一个亚饱和突变位点之前的三联体为止。如果下游不再有亚饱和位点，则完成合成，末端保留5'三苯甲基基团。使用宽口吸头，在15毫升锥形管中，将225 µL Span 80和25 µL Tween 80加入5毫升矿物油中，配制油相表面活性剂混合液。轻轻倒置混匀15次，确保充分混合。此步骤中的混合物应呈半透明状。对于每个文库，将950微升油性表面活性剂混合物转移至一个2毫升圆底冷冻管中。用文库名称标记，并置于冰上。在每个小瓶中放入一个小型圆柱形搅拌子。根据生产商的建议配制体外转录-翻译反应混合液。向该混合液中添加氯化镁，使其终浓度为 1.5 毫摩尔。将反应混合物分装至预冷的1.5毫升离心管中，每管50微升，置于冰上。在冰上向反应混合物中加入1.7飞摩尔的文库。通过将装有冰的小烧杯放置在磁力搅拌器上，并将搅拌速度设定为1150转/分钟，依次为每个文库制备水包油乳液。然后将装有950微升油-表面活性剂混合物和一根小型搅拌子的冷冻管转移至磁力搅拌器上的冰浴烧杯中。检查搅拌子是否正常旋转。在两分钟内，每隔30秒加入一次体外文库转录-翻译混合物，共加入五份，每份10微升，之后继续搅拌1分钟。将装有乳液的小瓶转移至冰容器中。此时，液体应呈不透明状，而非半透明状。随后，继续进行下一个文库的操作。在处理完所有文库后，根据试剂盒制造商的建议开始对所有文库进行孵育。将小瓶转移至工程核酸内切酶的最适反应温度下继续孵育额外两小时，随后置于冰上至少10分钟。将乳液从冷冻小瓶转移至1.5毫升离心管中。加入1 µL 5摩尔的EDTA。在室温下以13,000 ×g离心5分钟。如果离心后无法清晰看到水-油界面，可在吸除上层油相前将混合物冷冻。用移液器移除上层油相并弃去。立即向水相中加入150微升苯酚-氯仿和100微升10毫摩尔/升Tris-HCl，进行提取。涡旋混匀后，在13,000 × g条件下离心30秒以实现相分离。收集上层水相。加入15微升3摩尔的醋酸钠、2.5至5微克糖原和375微升乙醇，沉淀DNA。将样品在-20摄氏度孵育1小时后，在4摄氏度下以13,000 ×g离心15分钟。弃去上清液，用1毫升冰冷的70%乙醇短暂洗涤沉淀。将DNA糖原沉淀在真空浓缩仪或空气干燥器中干燥超过五分钟。然后将沉淀溶解于50微升10毫摩尔/升Tris-HCl中。接下来，加入5 µL链霉亲和素磁珠（按制造商说明书预先配制），在室温下混匀1小时，建议使用旋转混匀仪或轻轻涡旋混合。将离心管转移至磁力架上，使磁珠分离。 然后收集富含DNA但不含生物素的液体。该方案是一种通过去除无活性的酶以及具有未改变的野生型序列特异性的内切酶，来提高工程化限制性内切酶中目标变体出现频率的工具。成功的筛选可鉴定出高达20%的有前景变体。如果突变体产生的切割模式与野生型酶不同，则将其标记为有前景的突变体。那些可能具有改变的序列偏好的突变体也会被标记。此处展示的是一次不成功的筛选，其中大多数突变体无活性，且有一个突变体的切割模式明显未发生改变。在这种情况下，文库很可能主要包含未激活的变异体，这些变异体逃逸了链霉亲和素捕获筛选步骤。必须精心设计筛选和反向筛选的序列，并通过诱变策略限制文库的多样性，该策略仅在少数选定位置引入替换。应根据初始筛选结果，对所选出的最佳变异体在优选序列和非切割序列上的结合与切割动力学进行充分表征。在我们的测试案例中，突变位点是基于同源建模来选择的。令人惊讶的是，后续的晶体结构显示，一些被改变的残基最可能并未直接与DNA接触。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

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体外定向进化具有更高特异性的限制性内切酶

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