具有更严格特异性的限制内核内核酶的体外定向进化

我们的协议允许创建限制性酶与改变，更严格的序列特异性使用体外分体化和独特的选择策略在定向进化。它可能相当普遍，因为它应该适用于任何限制内核糖，选择可以针对原始同源序列的任何更严格的版本。如果新创建的变体通过体外转录翻译表示，该协议不仅适用于缩小特异性，而且适用于改变特异性。

要确定亚饱和突变的站点，请根据站点的假设重要性选择突变频率，同时牢记总体库复杂性的限制。要开始合成，请将装有新树脂的列插入合成器中。合成三胞胎的所有列中的寡核苷酸，紧接第二个亚饱和突变发生位点从三等结束计数之前。

合成，最后留下一个五大三甲酰组。保护组将在下一个合成周期开始时删除。打开合成柱，并短暂离心到干1.5毫升管收集树脂。

拉动CPG合成支持，通过涡流混合。将混合CPG树脂重新分区为新的合成柱。避免引入湿度，因为它会降低整体产量。

继续合成，从亚饱和突变发生位点三胞胎开始。根据所需的诱变频率，将列分配给随机的 NNS 三胞胎或野生型三胞胎。如果存在其他亚饱和站点，则仅继续执行下一个亚饱和突变发生站点之前的三胞胎。

如果下游不再存在亚饱和点，则完成合成，最后留下一个五分之一的三乙基组。使用宽孔移液器尖端，在 15 毫升锥形管中加入 225 微升 Span 80 和 25 微升 Tween 80 至 5 毫升矿物油，从而准备油表面活性剂混合物。通过轻轻反转彻底混合15次。

此步骤中的混合物应为半透明。对于每个库，将 950 微升的油表面活性剂混合物转移到两毫升圆底部低温小瓶中。用库名称标记并转移到冰上。

将一个小圆柱形搅拌棒放入每个小瓶中。根据制造商的建议准备体外转录-翻译反应混合物。用氯化镁补充混合物，最终浓度为1.5毫摩尔。

将反应混合物的50微升等分分配到1.5毫升的冰上管中。在冰面的反应混合物中加入1.7个细胞。首先将装满冰的小烧杯放在磁搅拌器上，搅拌速度设置为 1150 RPM，为每个库连续准备油中乳液。

然后将含有 950 微升油表面活性剂混合物的低温小瓶和一个小搅拌棒转移到磁搅拌器上的冰冷烧杯上。检查搅拌杆是否旋转。在两分钟内在30秒的间隔内加入5个10微升的体外库转录翻译混合物，并继续搅拌一分钟。

将装有乳液的小瓶转移到冰容器中。此时，液体应该是不透明的，而不是半透明的。然后，继续下一个库。

处理所有库后，根据套件制造商的建议开始孵化所有库。将小瓶转移到工程内核糖的最佳温度两小时，然后再将其放在冰上至少 10 分钟。将乳液从低温小瓶转移到1.5毫升管中。

添加一个 5 摩尔 EDTA 的微升。在室温下，以13，000次g离心5分钟。如果离心后无法清楚地看到水油界面，请先将混合物冷冻，然后再吸入上油相。

用移液器移动上油相并丢弃。立即进行萃取，在水相中加入150微升酚氯仿和100微升10毫摩尔三叶草-HCl。涡流，然后通过30秒离心在13，000倍g进行相分离。

收集上水相。通过加入15微升的三摩尔醋酸钠、2.5至5微克的糖原和375微升的乙醇来沉淀DNA。在零下20摄氏度下孵育样品1小时后，在13000倍、4摄氏度的温度下离心15分钟。

丢弃上清液，用一毫升冷70%乙醇短暂清洗颗粒。在速度真空或空气干燥器中干燥DNA糖原颗粒超过五分钟。然后将颗粒溶解在 50 微升 10 毫摩尔三升-HCl 中。

接下来，添加五微升的链球菌磁珠，根据制造商的说明准备。在室温下混合一小时，最好在旋转木马混合器中或通过温和的涡流混合。将管子转移到磁性支架上以分离珠子。

然后收集富含DNA的液体，无需生物素。该协议是一种工具，通过消耗非活性酶和内端糖，具有不变的野生型序列特异性，增加工程限制内端糖所需的变异的频率。成功的筛选可以识别多达 20% 的有希望的变种。

变种被标记为有希望的变种，如果他们产生一个不同于野生型酶的裂解模式。可能已更改序列首选项的变体也会被标记。此处显示的是一个不成功的筛选，大多数方差处于非活动状态，一个变体明显未改变的裂解模式。

在这种情况下，库很可能由不活动变体控制，这些变体逃脱了 streptavidin 捕获选择步骤。仔细设计选定的序列和反选定序列，并限制库的多样性，因为诱变策略只在几个选定位置生成替换。所选的最佳变体应根据初始筛选的结果，对首选序列的绑定和裂解动力学进行彻底描述。

在我们的测试用例中，根据同源模型选择突变发生点。令人惊讶的是，后来的晶体结构表明，一些改变的残留物很可能与DNA没有直接接触。