Name: 研究对牙髓寄生虫信号反应的神经质生长的共同培养方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 了解牙髓细胞与三叉神经节神经元的共培养方法，用于研究牙齿神经支配机制。该方案利用Transwell系统实现细胞间信号交流，支持基因操作和神经突生长成像，为神经修复研究提供可靠平台。

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本工作获得了以下资助：a) 美国国立卫生研究院/国家关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIH/NIAMS）（资助号 R01 AR062507 和 R01 AR053860，授予 RS）；b) 美国国立牙科与颅面研究所/国立卫生研究院（NIDCR/NIH）向 SBP 提供的阿拉巴马大学伯明翰分校牙科学术研究培训（DART）资助（资助号 T90DE022736，项目负责人 MacDougall）；c) 阿拉巴马大学伯明翰分校颅面、口腔与牙科疾病全球中心（GC-CODED）向 SBP 提供的试点与可行性资助；d) 美国国立牙科与颅面研究所/国立卫生研究院（NIDCR/NIH）向 SBP 提供的 K99 DE024406 资助。

所有涉及小鼠的实验均经阿拉巴马大学伯明翰分校机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准。
1. 培养板制备
注意：可在实验结束时使用盖玻片对毛乳头细胞进行成像。在无菌细胞培养操作台外进行所有孵育和洗涤步骤时，务必盖上培养板盖子，以防止样品处理过程中发生污染。
<ol>
	<li>盖玻片准备
	<ol>
		<li>将圆形盖玻片进行高压灭菌。</li>
		<li>在生物安全柜中过滤超纯水。</li>
		<li>将盖玻片转移至24孔板中，每孔加入400 μL 0.1 mg/mL 多聚-D-赖氨酸覆盖盖玻片。</li>
		<li>将盖玻片置于摇床（12 rpm）或轨道摇床（40–50 rpm）上，浸没浸泡5分钟。确保盖上孔板盖以防止污染。</li>
		<li>用过滤后的超纯水在摇床（12 rpm）或振荡器（50 rpm）上冲洗盖玻片约5分钟，重复一次。</li>
		<li>将盖玻片置于生物安全柜中，打开孔板盖，使其干燥至少2小时，以促进蒸发。制备好的盖玻片应在48小时内使用。</li>
		<li>将DP细胞接种于盖玻片表面，并在实验结束时进行免疫荧光检测（第3.3节）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>滤膜包被
	<ol>
		<li>将层粘连蛋白稀释至10 μg/mL，并在生物安全柜中过滤稀释后的溶液。</li>
		<li>用移液器将450–500 μL 10 μg/mL 层粘连蛋白加入24孔板的每个孔中。</li>
		<li>将孔径为3 μm的Transwell滤膜放入孔中，使其接触层粘连蛋白溶液，并置于37 °C培养箱中孵育2小时或过夜。滤膜孔隙应允许部分溶液扩散，从而包被滤膜的上下面。包被后的滤膜应在48小时内使用，或于4 °C冰箱中保存不超过1周。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞铺板及可选的基因操作
<ol>
	<li>小鼠：可（非必需）对毛乳头细胞进行遗传学改造，以研究间充质-神经元相互作用。有关建议的遗传学变异方案，请参见第2.3和2.4节。</li>
	<li>DP分离、分散与接种图1) 
	注意：进行牙髓（DP）分离时，应使用超细直头镊子。超细的镊尖可使操作者将镊子边缘插入矿化结构与牙髓组织之间。
	<ol>
		<li>收获 P5-P8 小鼠。在此阶段，牙齿应处于矿化过程中，且牙根处于开放状态。</li>
		<li>通过将新生小鼠置于培养皿中进行低温处理，以低温麻醉法使其麻醉 4 °C 将幼崽置于冰箱中直至其不再移动或对触碰无反应。在指定设施中，按照IACUC规程通过断头法处死新生幼崽。</li>
		<li>在50 mL锥形管中准备3–5 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，用于收集每只小鼠的牙髓组织。这有助于消化新生小鼠的牙髓组织。若消化来自10只以上新生小鼠的组织，则使用超过3 mL的溶液。</li>
		<li>将头部置于一次性垫巾上，使口部朝向天花板，颈部基部平放于操作台面。使用剃须刀片以锯切动作分离下颌骨与上颌骨。</li>
		<li>可选择使用剪刀或镊子移除舌头，以便更方便地接触到磨牙。</li>
		<li>将打开的头部置于铺有无菌纱布垫的培养皿中，并将样本放置在解剖显微镜下图1D).</li>
		<li>去除第一磨牙周围的牙槽骨组织。此时下颌牙齿尚未完全萌出。将牙钳插入牙槽开口，将组织从牙齿表面向颊侧（脸颊）或舌侧（舌头）方向剥离。上颌牙齿则需要完全去除牙齿周围的裂隙组织，以暴露并拔除牙齿。</li>
		<li>将下颌和上颌第一磨牙（M1）轻柔转移至另一含有1×磷酸盐缓冲液（PBS）的细胞培养皿中。</li>
		<li>重复步骤2.2.4–2.2.8，直至收集完所有M1。在收获过程中，将含有M1的培养皿置于冰上。</li>
		<li>去除围绕每个第一磨牙（M1）外部的釉质上皮器官（EOE）。此步骤也可在2.2.11步骤之后进行。</li>
		<li>用镊子将M1磨牙旋转，使牙尖朝下，暴露敞开的牙根。牙齿底部可见一个椭圆形开口，其内有不透明的牙髓组织，外包一层薄薄的牙本质和釉质。</li>
		<li>使用镊子的尖端，将镊子的一侧轻轻沿矿化组织内缘环绕，以松解牙乳头（DP）。将DP组织从矿化结构中取出，转移至第三个培养皿中，该培养皿含有1x PBS。若口外上皮（EOE）尚未分离，则将其移除。图1E).</li>
		<li>将所有DP组织转移至含有0.25%胰蛋白酶-EDTA的50 mL锥形管中。涡旋混匀后置于 37 °C 37°C水浴10分钟。可使用同一把镊子或长柄小瓶镊子操作。组织较难分散，需每隔3-4分钟涡旋振荡一次。胰蛋白酶消化时间不得超过10分钟，以免胰蛋白酶损伤细胞膜。</li>
		<li>在无菌操作台中，加入预热的共培养培养基（表1) 至少按1:1的培养基与胰蛋白酶比例加入，以灭活酶活性。若需更强的组织分散效果，可使用更大的比例。</li>
		<li>用10 mL移液器将培养基上下吹打数次，以进一步分散组织块中的DP。注意避免产生大气泡。由于组织具有黏性，完全分散几乎不可能，但亦无此必要，因为细胞在接种后会从组织块向外迁移。</li>
		<li>将1 mL分散的DP转移至24孔组织培养板的每个孔中（图1F).</li>
		<li>将培养皿置于培养箱中，在 37 °C 让细胞贴壁并从未分散的组织中迁移出来，持续48小时后再更换培养基。原代细胞需要以相对较高的浓度接种，以便在1周内达到85–90%的融合度。若1周后未达到该标准，则弃用该培养板。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可选的毛乳头细胞遗传操作
	<ol>
		<li>为了改变细胞信号通路，从基因敲除小鼠或目的基因两侧带有 loxP 位点的小鼠中分离DP细胞。在后一种情况下，可使用腺病毒-Cre-GFP（Ad-Cre-GFP）重组酶切除被loxP位点包围的目的基因，具体方法如下所述。使用腺病毒-eGFP（Ad-eGFP）作为对照病毒，以确保病毒感染本身不会引发细胞反应。 
		注意：Ad-eGFP 由 CMV 启动子增强子驱动，该启动子活性很强；而 Ad-Cre-GFP 中的 GFP 由 IRES（内部核糖体进入位点）调控，位于 Cre 与 GFP 之间的内部调控区域，其表达强度较弱。因此，Ad-eGFP 感染细胞的荧光强度高于 Ad-Cre-GFP 感染细胞。应根据荧光细胞的总数来确认感染水平是否相当。 不 细胞荧光水平。</li>
		<li>准备 500 μL 含病毒的培养基 10 μg/mL 每孔加入聚凝胺。聚凝胺有助于接近汇合度的细胞进行病毒感染10该方案基于腺病毒-eGFP（Ad-eGFP）的感染复数（MOI）为100，腺病毒-Cre-GFP（Ad-Cre-GFP）的MOI为200，以实现高效的基因感染，同时对细胞活力影响极小或无影响。预估细胞数量为4 × 104 24孔板每孔的细胞数： 
		<img alt="用于培养基制备的病毒稀释公式，以细胞培养应用中的方程形式表示。" src="/files/ftp_upload/60809/60809equ01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"></li>
		<li>混匀培养基，可短暂涡旋或用移液器吹打，并添加 500 μL 向每个孔中加入。</li>
		<li>24小时后，加入额外的 500 μL 共培养基的 不 含有额外的聚凝胺或病毒。</li>
		<li>在总共48小时后，吸除含病毒的培养基，并更换为新鲜的共培养培养基。此时，可将TG神经元接种于Transwell滤膜上方。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>三叉神经元的分离、分散与接种 
	注意：本方案中，使用青春期（6周龄）B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J 小鼠。Thy1-YFP 小鼠的中枢和周围神经系统具有黄色荧光蛋白（YFP）标签，该标签在神经元中的表达始于出生后第6至第10天（P6-P10），并在出生后及成年期间在整个神经系统中呈指数级增加11,12YFP 和 GFP 具有保守序列，可使这些神经元被抗-GFP 抗体染色，从而实现全神经元标记。最终，这些小鼠有助于更清晰地观察和定量用于细胞培养及在培养中生长的神经元。
	<ol>
		<li>用二氧化碳安乐死 adolescent 小鼠，随后进行颈椎脱位。</li>
		<li>处死小鼠并剥离颅骨上的皮肤。确保雄性和雌性小鼠数量相等。</li>
		<li>将显微解剖剪的尖端插入颅底。沿颅骨的矢状缝剪开图1A).</li>
		<li>在颅骨两侧耳部附近的冠状缝处，以及颅底的人字缝处，各做两个小的水平切口，共四个。这样应形成两块骨瓣。</li>
		<li>使用镊子掀开两片骨瓣，暴露脑组织。</li>
		<li>取出脑组织。将头部转移至含有1x PBS的组织培养皿中，并置于显微镜下。</li>
		<li>定位三叉神经节，该结构在啮齿类动物中易于观察13，位于上颌突的脑部与骨之间的硬脑膜内（图1B).</li>
		<li>用直头精细镊子剪断通向眼睛、上颌和下颌的三条分支，将神经节转移至冰冷的1×PBS中。采集过程中，将盛有三叉神经节（TG）的培养皿置于冰上。</li>
		<li>待所有三叉神经节束收获后，使用瓶钳将神经节转移至含有5 mg/mL经无菌过滤的II型胶原酶的50 mL锥形管中。</li>
		<li>涡旋振荡胶原酶与TG束，并将试管置于 37 °C 水浴 25-30 分钟。在此期间，每隔 5-10 分钟将锥形管从水浴中取出，涡旋混匀后放回水浴。</li>
		<li>将胶原酶-TG神经元溶液在643 x g下离心2分钟 g.</li>
		<li>在组织培养罩内，用微量移液器轻柔地吸出胶原酶。</li>
		<li>加入5 mL 1%无菌过滤的胰蛋白酶II型，涡旋混匀。将锥形管置于 37 °C 水浴 5 分钟。</li>
		<li>将胰蛋白酶-TG 混合物在 643 x g 条件下离心 5 分钟 g用移液枪吸除胰蛋白酶的上清液，注意不要吸走TG神经元。此时离心管中仍会有液体残留。</li>
		<li>加入足量培养基以灭活残留的胰蛋白酶（胰蛋白酶与培养基的比例为1:1或更低）。</li>
		<li>计数细胞数量，并将溶液稀释至200,000个细胞/mL（250 μL 含细胞的50,000个细胞。</li>
		<li>将第1.2节中包被的Transwell滤膜放入含有DP的孔中。</li>
		<li>将含细胞的溶液稀释至细胞浓度为 200,000 个细胞/mL。用移液器吸取 250 μL Transwell 小室上，并在 37 °C 过夜（图1F).</li>
		<li>第二天，将培养基更换为 1 mL 含有共培养基的培养液 1 μM 尿苷和 15 μM 5'-氟-2'-脱氧尿苷用于抑制间充质细胞过度增殖，从而防止其阻碍神经突生长。可选：若需进一步干预，可在该培养基中添加生长因子或抑制剂。</li>
		<li>将细胞继续培养至所需的各个时间点。本实验方案优化为总共培养5天，仅在第2天更换培养基以添加有丝分裂抑制剂。若培养时间更长，则需进行额外的培养基更换。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 样品采集与处理
<ol>
	<li>三叉神经染色
	<ol>
		<li>在组织培养罩内，为每个待处理的Transwell小室向24孔板中加入1 mL无菌1×PBS。</li>
		<li>使用200–1,000 μL移液器小心移除滤膜表面的液体，注意保持细胞层完整。贴壁细胞应保留，未贴壁细胞将在轻柔吹打过程中脱落。使用真空抽滤可能损伤细胞层，不推荐用于吸液。</li>
		<li>将滤膜转移至含1×PBS的孔板中，确保如上一步所述去除上层培养基。</li>
		<li>将所有Transwell滤膜连同盖子置于摇床，以12 rpm或轨道摇床40–50 rpm振荡10分钟。</li>
		<li>吸除PBS（包括上述步骤中描述的上层液体），加入500 μL 1×PBS，并在摇床或轨道摇床上继续振荡5–10分钟进行额外冲洗。</li>
		<li>再次吸除1×PBS，替换为4%多聚甲醛（PFA）。使用至少500 μL，确保整个滤膜表面完全浸没。将板置于摇床（12 rpm）或轨道摇床（40–50 rpm）上，室温固定1小时。</li>
		<li>移除PFA，用500 μL 1×PBS在摇床上清洗两次，每次5–10分钟。</li>
		<li>使用含10%牛血清白蛋白（BSA）和5%山羊/驴血清（根据二抗宿主动物选择）的0.05%吐温-1×PBS（PBST）溶液进行封闭。加入450–500 μL封闭液，确保滤膜完全浸没。 
		注：在此阶段，若用封口膜密封以防止蒸发，并定期检查确保滤膜表面始终浸没，这些板可在4 °C保存数月，以便后续处理。</li>
		<li>移除封闭液，直接加入450–500 μL用1% BSA-PBST稀释的一抗，无需额外洗涤。4 °C轻柔振荡过夜孵育。</li>
		<li>移除一抗溶液，在摇床上用500 μL 1×PBST于室温洗涤三次。</li>
		<li>移除PBST，加入二抗，用铝箔包裹避光，4 °C摇床过夜孵育，以防止荧光染料降解。再次在摇床上用1×PBST室温洗涤三次。最后替换为1×PBS。 
		注：此时若用铝箔包裹避光，并用封口膜密封防止蒸发，定期检查确保滤膜表面始终浸没，板可在4 °C保存数月。建议在一个月内完成成像。</li>
		<li>为获得最佳成像效果，建议使用Thy1-YFP小鼠神经元结合抗GFP抗体，使神经传入纤维的染色信号显著高于背景水平。若无Thy1-YFP小鼠，可使用抗神经丝蛋白200（Anti-Neurofilament 200）抗体精确标记轴突结构。</li>
		<li>按需进行成像。滤膜无需另行铺板，可直接置于盖玻片或载玻片上，使用倒置显微镜成像。 
		注：滤膜部分区域可能不含传入结构。应采集多个z轴层扫描图像以完整捕获所有传入结构。建议使用图像拼接软件观察大范围或（更优）全滤膜区域的神经突生长情况。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>RNA、蛋白质及培养基收集
	<ol>
		<li>在处理Transwell滤膜的同时，将培养基收集至无RNase/DNase的离心管中，冷冻保存以备后续检测（如ELISA、蛋白质组学等）。</li>
		<li>收集培养基后立即向各孔中加入含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液或放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液。本方案在24孔板中每孔使用100 μL已优化。</li>
		<li>孵育5分钟使细胞裂解，然后用新的移液枪头刮取每个滤膜，将细胞样本收集至无RNase/DNase的离心管中。冷冻裂解液以备后续分析（半定量和/或定量PCR、Western blot等）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>牙髓细胞的可选免疫荧光染色：
	<ol>
		<li>用镊子轻轻从第1.1节中取出盖玻片，转移至含4% PFA的不同孔中，振荡固定1小时。</li>
		<li>吸除PFA，用1×PBS清洗盖玻片两次。随后按照标准免疫荧光技术流程进行通透、封闭，并针对目标标志物进行免疫荧光染色。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+tooth+pulp+cells+elicit+neurite+growth+from+trigeminal+neurones+and+express+mRNAs+for+neurotrophic+factors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).</li>
<li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tooth+pulp+tissue+promotes+neurite+outgrowth+from+rat+trigeminal+ganglia+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurocytology%22%5BJournal%5D)">Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro.</a> Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).</li>
<li>Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+Growth+Factor+Secretion+From+Pulp+Fibroblasts+is+Modulated+by+Complement+C5a+Receptor+and+Implied+in+Neurite+Outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth.</a> Scientific reports. 6, 31799(2016).</li>
<li>Pagella, P., Neto, E., JimÃ©nez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+co-culture+systems+for+studying+tooth+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation.</a> Frontiers in Physiology. 5, 326(2014).</li>
<li>Miura, T., Yokokawa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+culture+on+a+chip%3A+Developmental+biology+applications+of+self-organized+capillary+networks+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices.</a> Development, Growth & Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

口腔的日常活动需要牙齿感知外部刺激和内部炎症，以实现正常的使用和维护。然而，目前关于驱动牙齿神经支配发育过程的信号机制的信息仍然有限。本实验方案提供了一种分离并共培养原代牙髓细胞与三叉神经节神经元的方法，用于研究这两类细胞群体之间的相互通讯。多个实验变量已得到优化，为进一步的研究提供了可能的方向，如下所述。
在本实验的每个步骤中，对照组都至关重要。每次实验均应包含一个仅含有三叉神经节（TG）神经元而无下方真皮乳头（DP）细胞的Transwell滤膜，以提供TG神经元生长的基线水平。当使用Ad-Cre-GFP重组酶删除目的基因时，应使用仅表达荧光标记的对照病毒，以确认感染的细胞数量相当。尽管本文已证明，在MOI为100和200时，Ad-eGFP和Ad-Cre-GFP分别可实现高水平感染且细胞死亡极少，但各实验室仍应对此步骤进行优化。由于荧光蛋白可能连接于不同的启动子，从而导致表达水平差异，因此应计数表达荧光的感染细胞数量，以确保感染细胞数相等。荧光的整体强度无关紧要，因其并不能准确反映感染状态。必须通过实验验证目标基因的删除效果，如本方案中采用半定量PCR所示（<strong cla...

牙齿的神经支配使牙齿能够感知压力、温度和炎症，这些感觉对于牙齿器官的使用和维护至关重要。当龋齿和外伤引起的牙痛无法被感知时，会导致疾病进展。因此，正常的神经支配是牙齿正常生长、功能发挥和维护的必要条件。
尽管大多数器官在出生时已完全具备功能并受到神经支配，但牙齿的发育过程会延续至成年期，且牙齿的神经支配与矿化过程在出生后的各个阶段协同进行1,2。有趣的是，在胚胎发育早期，牙髓（DP）间充质会分泌排斥性信号，以阻止轴突进入正在发育的牙齿器官；而随着牙齿接近萌出阶段，这种信号随后转变为分泌吸引性因子3,4。在出生后的发育阶段，三叉神经（TG）的感觉轴突在牙本质开始沉积前后侵入并贯穿整个牙齿（详见 Pagella, P. 等人5的综述）。已有多种体内研究表明，神经元-间充质相互作用可引导小鼠牙齿的神经支配过程（详见 Luukko, K. 等人6的综述），但关于其分子机制的具体细节仍知之甚少。
细胞共培养提供了可控的环境，使研究人员能够调控神经元与间充质细胞群体之间的相互作用。共培养实验有助于深入探究指导牙齿神经支配和发育的信号通路。然而，目前用于研究共培养细胞的传统方法存在一些技术挑战。例如，在三叉神经节（TG）组织块分散液中包含的施万细胞可能非特异性地被结晶紫染色，从而干扰轴突生长的观察，且颜色强度峰值可能在反应较小时即出现7。微流控小室是一种有吸引力的选择，但其成本显著高于Transwell滤膜系统8,9，且仅能用于研究神经元对牙乳头（DP）分泌物的反应。为解决上述问题，我们开发了一种实验方案，可实现以下目标：a）精确染色并成像牙乳头分泌物诱导的三叉神经节轴突生长；b）对牙乳头细胞和/或三叉神经节神经元进行遗传学修饰，以研究特定信号通路；c）研究牙乳头细胞对三叉神经节神经元所分泌因子的反应。该方案能够在体外共培养体系的可控环境中，精确探究牙齿神经支配的多个特征。

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<table><tbody><tr><td>5-氟-2'-脱氧尿苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td>在共培养培养基中用作有丝分裂抑制剂，第2天浓度为 15 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>24孔细胞培养板</td><td>Corning</td><td>3524</td><td>共培养板</td></tr><tr><td>Alexa-546 抗鸡抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A-11040</td><td>用于标记抗GFP抗体标记的神经突起生长的二抗，稀释比例为1:500</td></tr><tr><td>抗GFP抗体</td><td>Aves Lab, Inc</td><td>GFP-1010</td><td>用于标记Thy1-YFP神经元的一抗，稀释比例为1:200</td></tr><tr><td>抗神经丝蛋白200抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NO142</td><td>用于标记神经元的单克隆一抗，稀释比例为1:1000；若无YFP小鼠，可作为替代方案</td></tr><tr><td>B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>12603</td><td>在优化方案中用于牙髓细胞的 Tgfbr2&lt;sup&gt;f/f&lt;/sup&gt; 小鼠模型</td></tr><tr><td>B6.Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>3709</td><td>用于三叉神经元的 Thy1-YFP 小鼠模型基因型</td></tr><tr><td>II型胶原酶</td><td>Millipore</td><td>234155-100MG</td><td>用于分散三叉神经元</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10437</td><td>共培养培养基的添加成分</td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11413-11</td><td>用于三叉神经节解剖的精细镊子</td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>用于包被Transwell小室插入膜，终浓度为 10 &amp;mu;g/ml，储存液浓度假设为 1.5 mg/ml</td></tr><tr><td>裂解缓冲液（Buffer RLT）</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>用于共培养后提取牙髓细胞的RNA</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>共培养培养基的添加成分</td></tr><tr><td>显微解剖剪刀</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3146-1EA</td><td>用于打开颅骨的解剖剪刀</td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-81</td><td>圆形盖玻片，用于可选的细胞培养和免疫荧光处理</td></tr><tr><td>最低必需培养基a</td><td>Gibco</td><td>12571063</td><td>共培养培养基基础成分</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td>共培养培养基中的抗生素添加成分</td></tr><tr><td>磷酸酶抑制剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04 906 837 001</td><td>用于RIPA缓冲液中，以提取共培养后牙髓细胞的蛋白质</td></tr><tr><td>聚凝胺</td><td>Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td>用于辅助牙髓细胞转染</td></tr><tr><td>多聚-D-赖氨酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td>用于盖玻片包被，以促进牙髓细胞的黏附</td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂</td><td>Millipore</td><td>05 892 791 001</td><td>用于RIPA缓冲液中，以提取共培养后牙髓细胞的蛋白质</td></tr><tr><td>无RNA酶/DNA酶的Eppendorf管</td><td>Denville</td><td>C-2172</td><td>预灭菌的1.7 ml离心管，用于实验结束时收集RNA、DNA或蛋白质</td></tr><tr><td>ThinCert细胞培养插入膜</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662631</td><td>用于共培养实验中三叉神经元的Transwell插入膜</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.25%）</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>用于分散牙髓细胞</td></tr><tr><td>II型胰蛋白酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-7409</td><td>用于分散三叉神经元</td></tr><tr><td>超细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-40</td><td>用于解剖的超细镊子</td></tr><tr><td>尿苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750</td><td>在共培养培养基中用作有丝分裂抑制剂，第2天浓度为 1 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>真空过滤系统</td><td>Millipore</td><td>SCNY00060</td><td>Steriflip一次性滤器，50 &amp;mu;m尼龙网滤膜</td></tr><tr><td>瓶用镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>110006-15</td><td>用于将组织转移至离心管的长镊子</td></tr></tbody></table>

一种共培养方法用于研究神经突起对牙髓旁分泌信号的反应性生长

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

牙体的神经支配使牙齿能够感知压力、温度和炎症，这些功能对于牙齿器官的使用和维护至关重要。若缺乏感觉神经支配，日常口腔活动将导致不可逆的损伤。尽管其重要性显著，但神经支配在牙齿发育和维持过程中的作用长期以来未受到足够重视。已有研究表明，牙髓（DP）细胞可分泌细胞外基质蛋白和旁分泌信号分子，以吸引并引导三叉神经节（TG）轴突进入牙齿并在其中延伸。然而，关于DP间充质与感觉神经传入纤维之间相互作用的研究仍较为有限。为填补这一知识空白，研究人员已开始采用共培养系统及多种技术手段来探究这些相互作用。本文展示了将原代DP细胞与TG神经元进行共培养的多个步骤：TG神经元被接种于上层Transwell小室的滤膜上，该滤膜具有较大直径的孔径，允许轴突穿过孔洞生长。实验中使用了目的基因两侧带有loxP位点的原代DP细胞，以便通过腺病毒介导的Cre-GFP重组酶系统实现基因敲除。利用Thy1-YFP转基因小鼠来源的TG神经元，可在共聚焦显微镜下实现清晰的传入神经成像，其荧光信号远高于背景水平。可通过收集和分析蛋白质或RNA，或对种植在可移除玻璃盖玻片上的DP细胞进行免疫荧光染色，来检测DP细胞的响应。培养基可采用蛋白质组学等方法进行分析，但由于培养基中含有胎牛血清，分析前需进行白蛋白去除处理。本实验方案提供了一种简便的方法，可通过调控共培养环境，研究TG神经元和DP细胞在形态学、遗传学及细胞骨架方面的响应。

这些结果表明，与三叉神经节（TG）神经突单层培养的对照组相比，当底层小室中存在原代真皮乳头（DP）细胞时，TG神经突的生长显著增加（图2A,C）。神经突生长在不同实验之间存在一定变异性。因此，每次实验均应包含TG神经元单层培养作为对照，以检测神经突生长的基础水平。本方案中使用了来自Tgfbr2f/f小鼠的原代细胞，在确认Ad-Cre-GFP和Ad-eGFP感染的细胞数量相当后进行实验（图2D）。其中Ad-eGFP作为对照病毒载体。Ad-Cre-GFP可删除两侧带有loxP位点的Tgfbr2基因，半定量PCR结果证实了该效应（图2E）。在转化生长因子β受体2（Tgfbr2）基因敲除的培养体系中，神经突生长减少（图2A-C）。
<p clas...

我们描述了牙髓（DP）原代细胞的分离、分散和接种，并在上层的transwell小室滤膜上共培养三叉神经节（TG）神经元。可通过免疫荧光或RNA/蛋白质分析来检测DP细胞的细胞反应。利用共聚焦显微镜进行神经元标志物的免疫荧光染色，可分析神经突的生长反应。

牙齿的神经支配使牙齿能够感知压力、温度和炎症，这些功能对于牙齿器官的使用和维护至关重要。

本方案详细阐述了牙髓干细胞与三叉神经元共培养的方法。通过该技术，我们可以研究由这两种细胞相互作用所引发的多种反应。该技术的主要优势在于能够对其中一种或两种细胞群体进行研究和调控，并精确测量其结果。该方法对神经科学研究具有直接相关性，可为研究牙髓干细胞如何修复因创伤事件或神经退行性疾病而受损的神经组织提供见解。该技术包含多个需要学习的阶段，可能难以全面掌握。本方案详细描述了每个阶段，以帮助解决这一问题。牙髓和神经节难以分散，需要进行多次涡旋振荡和移液操作。即便如此，仍可能无法完全分散，因此需要优化条件并设置重复实验。在小鼠安乐死后，将其头部置于一次性垫上，使口部朝向天花板，颈部基部平贴于工作台面。使用刀片并以锯切动作将下颌骨与上颌骨分离。用剪刀或镊子移除舌头，以便更方便地接触到磨牙。将张开的头颅置于培养皿中，下面垫上无菌纱布，并将标本放置在解剖显微镜下。 去除第一磨牙周围牙槽骨组织。将镊子插入牙槽开口，从牙齿向口腔的颊侧或舌侧方向分离组织。收集所有上颌第一磨牙，并将下颌和上颌第一磨牙轻柔转移至另一含有冰上预冷的1×PBS的细胞培养皿中。去除上颌第一磨牙外部周围的釉质外层组织。用镊子旋转磨牙，使牙尖朝下，暴露开放的牙根。牙齿底部有一个椭圆形开口，其内含有被一层薄薄的牙本质和釉质包裹的不透明牙髓组织。用镊子的尖端轻轻松动牙髓组织，将镊子的一臂沿矿化组织的内周移动。将牙髓组织从矿化结构中取出，并转移至第三个含有1×PBS的培养皿中。如果外层釉质器官尚未分离，则将其去除。将所有牙髓组织转移至含有0.25%胰蛋白酶-EDTA的50毫升锥形管中。涡旋混匀后，置于37摄氏度水浴中孵育10分钟。在无菌操作台内，加入预热的共培养培养基，使培养基与胰蛋白酶的最终体积比至少为1:1，以灭活酶活性。用10毫升移液器将培养基中的牙髓组织反复吹打数次，以进一步分散牙髓组织，注意避免产生大气泡。将1毫升分散后的牙髓组织转移至24孔组织培养板的每孔中。将培养板置于37°C培养箱中孵育。在更换培养基前，让细胞贴壁并从未分散的组织中迁移出来，持续培养48小时。安乐死后去除皮肤，将显微解剖剪的尖端插入颅底，沿颅骨的矢状缝剪开。在耳侧沿冠状缝向颅底枕骨缝方向做四个小的水平切口，形成两块骨瓣。用镊子掀开这两块骨瓣，以暴露脑组织。在上颌突的脑与骨之间的硬脑膜内找到三叉神经节。剪断通往眼睛、上颌和下颌的三个分支。使用直头精细镊子将神经节转移至冰上培养皿中的冷1×PBS溶液中。待所有三叉神经束采集完毕后，使用镊子将神经节转移至含有5 mg/mL无菌过滤的II型胶原酶的50 mL锥形管中。涡旋混匀后，将管子置于37 °C水浴中消化25至30分钟。每隔5至10分钟，将管子从水浴中取出，涡旋振荡后再放回水浴。将胶原酶消化后的三叉神经元溶液在643×g条件下离心2分钟。在组织培养罩内，用微量移液器轻轻吸出胶原酶，并

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

研究对牙髓寄生虫信号反应的神经质生长的共同培养方法

我们演示了如何分离和培养鸡胚第4天的前庭耳蜗神经节以及第6天的脊髓外植体。外植体在无血清条件下于三维胶原凝胶中培养24小时。通过添加生长因子的培养基以及包被蛋白质的微珠来检测神经突的反应性。...

鸡胚前庭耳蜗神经节和脊髓组织块在胶原凝胶中的分离培养及其用于神经突起生长实验

所述方法通过使用以下任一方式分离和表征人牙髓干细胞（hDPSCs） 牙髓组织的酶解离（DPSC-ED） 或 牙髓组织外植体中干细胞的直接迁出（DPSC-OG）。随后 体外...

利用两种不同方法分离、鉴定及比较源自恒牙的人牙髓干细胞的分化特性

本视频展示了一种利用Transwell小室建立三叉神经元与原代牙髓细胞共培养的技术。在这种物理分离的条件下，从牙髓组织中获得的间充质细胞会分泌旁分泌信号分子，这些分子可通过小室的孔隙穿过，促进神经元向间充质细胞方向分化和迁移，从而建立共培养系统。...

建立牙髓细胞与三叉神经元的共培养体系以实现交互通讯

本视频展示了利用微流控装置研究牙胚牙髓与三叉神经节之间相互作用的方法。视频中演示了将组织放置于微流控装置内的操作过程，并详细呈现了三叉神经突通过装置中的微通道向牙胚生长的可视化过程。此外，视频还强调了牙源性分子因子在促进或抑制神经突延伸进入牙胚牙髓中的作用，这对于确保出生后牙齿有效神经支配至关重要。...

使用微流控共培养系统分析牙胚与三叉神经节的相互作用

背根神经节（DRG）是包含周围神经系统感觉神经元的结构。经分离后，可与类似施万细胞的脂肪源性干细胞（ASC）进行共培养，从而为研究提供有价值的模型 体外 神经再生与髓鞘化，模拟 体内...

背根神经节神经元与分化后的脂肪源性干细胞：一种 体外 共培养模型用于研究周围神经再生

共培养是研究神经与靶组织及器官之间相互作用的重要方法。微流控系统可在不同的培养基中实现神经节与完整发育中的器官或组织的共培养，因此成为一种研究该领域的有力工具。 体外...

利用微流控共培养装置分析发育中牙胚的神经支配

我们提供了基于直接和间接共培养方法评估牙髓来源间充质干细胞与前列腺癌细胞相互作用的实验方案。使用条件培养基和Transwell小室膜适用于分析间接的旁分泌作用。将不同染色的细胞共同接种是研究直接细胞间相互作用的合适模型。...

从牙髓组织中分离间充质干细胞并与癌细胞共培养以研究其相互作用

本文介绍了一种人牙髓干细胞的分离与扩增方案，旨在评估朊蛋白在神经元分化过程中的表达情况。...

人牙髓干细胞的分离、扩增及神经元分化过程中朊蛋白表达

本文提供了一种在三维基质中分析生长轴突行为的方法，以模拟其自然发育过程。...

生成基于三维胶原的水凝胶以分析神经系统发育过程中的轴突生长与行为

本文提供了利用组织块培养法建立牙髓干细胞原代培养的逐步操作指南，并依据ICSCRT指南对这些细胞进行表征。通过本方案分离获得的细胞可被视为间充质干细胞，用于后续应用。...

牙髓干细胞的原代培养

本方案描述了建立小鼠背根神经节（DRG）全组织培养和分散培养的方法，以及利用这些培养系统评估肿瘤-神经相互作用的应用。...

建立 体外 背根神经节培养模型：探究癌症-神经相互作用的互补方法

了解牙髓细胞与三叉神经节神经元的共培养方法，用于研究牙齿神经支配机制。该方案利用Transwell系统实现细胞间信号交流，支持基因操作和神经突生长成像，为神经修复研究提供可靠平台。

一种共培养方法用于研究神经突起对牙髓旁分泌信号的反应性生长

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