人工泪液配方对干燥暴露后人角膜上皮细胞代谢活性的影响

本实验方案的目的是在体外模型中评估人工泪液制剂是否能够保护人角膜上皮细胞免受干燥损伤。该方法可用于帮助筛选出有助于缓解干眼症状个体眼部保护的干眼治疗制剂。该检测方法通过一种高度敏感的方式检测角膜上皮细胞的代谢活性。

因此，可以检测到由于干燥引起的角膜细胞健康的微小变化。今天的实验操作将由 Parisa Mirzapour、Nijani Nagaarudkumaran 和 Adeline Suko 演示。首先，在胶原蛋白包被的培养瓶中加入 20 毫升含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素/链霉素的 DMEM/F12 培养基，于 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下培养永生化的人角膜上皮细胞，每两到三天更换一次培养基。

当细胞接近完全融合时，移除细胞培养基，并向每个培养瓶中加入4到6毫升的细胞解离液。在37摄氏度下孵育细胞，直至细胞脱落，并定期在显微镜下观察。向每个培养瓶中加入2到6毫升含10% FBS的DMEM/F12培养基，然后将内容物转移至50毫升离心管中。

以450至500 × g离心细胞5分钟。然后吸除上清液，并将细胞重悬于预热的培养基中。使用血细胞计数板测定细胞浓度，并计算含有100,000个细胞的体积。

向48孔胶原蛋白I型包被的培养板的每个孔中加入培养基以及计算好的细胞体积，确保每孔终体积为0.5毫升。随后将细胞培养24小时。在对照处理中，从孔中移除培养基，并立即用150微升的待测制剂或培养基对照溶液处理细胞。

然后将细胞孵育30分钟。移除细胞中的测试溶液，加入0.5毫升10%代谢染料溶液。再将细胞孵育4小时。

孵育结束后，从每个孔中移除 100 微升染料溶液，并转移至 96 孔板中。使用酶标仪测量各孔的荧光强度，激发波长设为 540 纳米，发射波长设为 590 纳米。为进行回收步骤，将细胞与待测溶液或对照溶液按照先前所述条件进行孵育。

然后向每个孔中加入 0.5 毫升 DMEM/F12 培养基。将细胞培养 18 小时。随后移除培养基，并检测代谢活性。

为执行对照操作，从48孔板中的细胞中移除培养基，并立即用测试制剂或培养基对照溶液处理。将培养板置于37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育30分钟。孵育结束后，从细胞中移除测试溶液，并将培养板置于37摄氏度、45%湿度的环境中5分钟以进行干燥。

接下来，加入 0.5 毫升 10% 代谢染料溶液，在 37°C 和 5% 二氧化碳条件下孵育细胞 4 小时。孵育结束后，将每个孔中的 100 微升代谢染料溶液转移至 96 孔板中，并检测荧光信号。为执行恢复程序，重复前述实验步骤，并在干燥步骤后加入 18 小时的 DMEM/F12 培养基孵育过程。

然后按照文稿中所述方法对数据进行统计学分析。本研究比较了三种干眼症制剂对人角膜上皮细胞存活率的影响。溶液一和溶液二在干燥处理前对细胞的代谢活性具有显著影响。

暴露于溶液一的细胞在18小时恢复后，细胞代谢活性进一步下降，表明细胞最初受到损伤且损伤未得到修复。相比之下，溶液三对上皮细胞的代谢活性仅产生轻微影响。在比较这些含脂质的干眼症制剂对细胞的保护能力时，发现溶液一和溶液二均无法保护细胞免受干燥应激损伤。

然而，溶液三提供了一定的保护作用。将细胞接种到胶原蛋白包被的培养板时，需确保细胞悬液中的细胞均匀混合，从而使每个孔接种的细胞数量相等。与其他两种含脂产品相比，溶液三在细胞存活率及抗干燥应激保护方面表现出统计学上显著的改善。

矿物油与磷脂、HP-瓜尔胶以及丙二醇可能共同作用，使溶液三能够在干燥条件下为角膜细胞提供保湿保护并减少蒸发。