使用免疫荧光对患有TNBS诱导克罗恩病的小鼠结肠雌激素受体的可视化

越来越多的证据表明雌激素信号对生理学的结肠部分的影响，免疫理论化学是一种有希望的技术，用于识别结肠中的雌激素受体，并演变为结肠炎。我们提出了一个完整的和经过验证的协议，用于使用免疫荧光对结肠中雌激素受体进行免疫石质化学可视化。我们将与洛兹大学显微成像实验室的Sylwia Michlewska博士一起演示该程序。

将结肠放在培养皿中。将结肠切成一到两厘米的碎片。将每个碎片放在海绵上，放在标记适当的组织学盒中。

将含有结肠片段的盒式磁带放在4%的甲醛中。在4摄氏度下孵育至少24小时。准备和编程组织处理器一小时的孵育在50%70%95%和100%乙醇，二甲苯100%乙醇，和二甲苯只，以及至少三个小时的孵化在液体石蜡。

将结肠片段转移到组织框。将盒子放在预编程的组织处理器中并运行处理器。在组织处理器中孵育后，从组织盒中取出结肠，将结肠片段放在金属模具中，使结肠的两端处于直立位置。

用液体石蜡填充模具的三分之一。将模具在零下 5 摄氏度的冷却区域放置几秒钟，然后将模具移动到 70 摄氏度的加热区域。然后将模具放在组织学盒的底部，用液体石蜡覆盖整个结肠片段。

将含有结肠碎片和石蜡的金属模具放在冷却区域几分钟。然后从结肠和石蜡块中取出金属模具。在4摄氏度下孵育结肠和石蜡块至少24小时。

孵育后，从块中去除多余的石蜡。将结肠和石蜡块插入全自动旋转显微原子中。将结肠碎片切成五微米。

将一个结肠部分转移到水浴，预热至40摄氏度。使用贴有标签的玻璃滑梯从水浴中去除结肠部分，并在室温下孵育玻璃滑梯 24 小时。首先，将玻璃滑梯在二甲苯中孵育五分钟，去除石蜡。

重复此步骤三次。然后将玻璃滑梯放入二甲苯和 100%乙醇的一对一混合物中，进行五分钟。重复此步骤三次。

使用一系列降低的乙醇浓度来补充结肠部分的水分。将幻灯片浸入乙醇中五分钟。在每个浓度下重复三次，然后继续下一个浓度。

在自来水下冲洗玻璃滑梯五分钟。将抗原检索缓冲液重新加热至 95 至 98 摄氏度。然后在沸腾的抗原检索溶液中加热玻璃滑梯10分钟。

为防止试剂浪费，请使用疏水笔在结肠截面周围画一个圆圈。然后，在过氧化氢和水的3%溶液中孵育滑梯10分钟。在洗涤液中清洗幻灯片五分钟。

然后在室温下孵育阻断溶液中的幻灯片一小时。去除阻断溶液，添加20至50微升原抗体对E-R alpha、E-Rβ或G-P-E-R稀释。在黑暗中4摄氏度下孵育原抗体过夜。

取出抗体溶液。在洗涤液中清洗幻灯片三次，每次五分钟。接下来，加入稀释的二级抗体。

在黑暗中，用与染料结合的二次抗体孵育幻灯片一小时。从幻灯片上去除二次抗体溶液。在洗涤液中清洗幻灯片三次，每次五分钟。

加入稀释的氟色素，用于膜可视化，在黑暗中室温下孵育10分钟。拆下溶液，每次在洗涤溶液中清洗幻灯片三次，每次洗涤五分钟。直接在结肠部分添加几滴甘油液体DAPI，用于细胞核可视化的氟色素。

用盖板幻灯片小心地盖住它。在4摄氏度下孵育结肠部分至少24小时。在具有 20 倍或 63 倍目标且油浸的共体显微镜下分析结肠部分。

利用MCF-7细胞验证了研究中使用的抗体的特异性。雌激素受体抗体能够检测核雌激素受体E-Rα和E-Rβ以及膜结合雌激素受体G-P-E-R。还进行了阴性控制，其中MCF-7细胞只与氟铬和甘油液体与DAPI结合的二级抗体进行染色。

在从对照小鼠和患有TNBS诱发克罗恩病的小鼠获得的结肠部分发现了E-R alpha的强烈细胞质信号。然而，只有从对照小鼠获得的结肠在杯状细胞细胞质中具有E-Rα局部化。共生显微镜还显示，在控制小鼠和TNBS治疗小鼠的结肠部分，E-Rβ的细胞质定位。

同样，从对照小鼠和TNBS治疗小鼠获得的结肠部分记录了G-P-E-R的细胞质定位。在模具中正确定位结肠对于生成正确的横截面至关重要。荧光色素应该由它自己的激发和发射光谱选择。

此方法也可以应用于可能参与结肠炎发展的其他蛋白质。免疫荧光的免疫化学检测可以扩展至在蛋白质-蛋白质方向状态下染色其他蛋白质。