Name: 生产自体富血小板血浆以促进体外人成纤维细胞扩增 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: 了解利用自体富血小板血浆体外扩增人成纤维细胞的标准化方法。该技术可在五分钟内完成PRP制备，实现细胞高效增殖，适用于再生医学领域的自体细胞治疗研究。

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感谢 Grégory Schneiter 先生在流式细胞术数据分析方面的技术支持；感谢 Muriel Cuendet 教授（日内瓦大学药学院生药学实验室）允许使用 Attune 流式细胞仪和 Cytation 3 高通量显微镜；感谢 Brigitte Pittet 教授提供的科学建议。

本研究方案遵循《赫尔辛基宣言》的原则，所有患者在参与研究前均签署了书面知情同意书。皮肤样本取自在瑞士日内瓦大学医院（日内瓦，瑞士）整形、重建与美容外科接受腹部成形术的健康女性。该研究程序符合《赫尔辛基宣言》的原则，并已获得当地机构伦理委员会的批准（方案编号 #3126）。
1. PRP 的制备
注意：CuteCell-PRP 采血管（材料表）专为在封闭系统中从小体积患者血液快速制备富血小板血浆（PRP）而设计。
<ol>
	<li>全血采集 
	注意：根据医疗机构的采血规程，使用与PRP管直接连接的蝶形针从手臂的外周静脉采集自体血。如果患者处于麻醉状态，可通过静脉留置针直接抽取血液。
	<ol>
		<li>打开PRP管的泡罩包装。进行静脉穿刺，并用全血填充所需数量的PRP管。管内的负压将自动采集所需的血量（约10 mL）。</li>
		<li>轻柔地将管子上下颠倒数次，使血液与抗凝剂充分混合。</li>
		<li>在生物安全柜（II级）内，使用1 mL注射器吸取100 µL全血，用于后续血细胞计数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>离心 
	注意：启动离心机前，确保其已正确配平。
	<ol>
		<li>采集完血液后，如有需要，可另取一个配平管（单独提供），加入与PRP管中血液等量的水作为平衡对照。将装有血液的管子与配平管对称放置于离心机中，确保机器处于平衡状态。</li>
		<li>以1,500 × g 离心5分钟。 
		注意：根据离心机制造商的说明设置相应的转速（rpm）。离心后，血液将分层：红细胞和白细胞被截留在凝胶下方，血小板则沉积在凝胶表面（图1）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>轻柔地将PRP管倒置20次，使血小板沉积物重新悬浮于血浆上清液中。 
	注意：确保血小板已完全从凝胶上脱离。血浆应由澄清透明变为浑浊。若存在血小板聚集体，应随血浆一同收集。</li>
	<li>为收集PRP，使用连接10 mL注射器的转移装置从管中吸取血浆溶液。 
	注意：每根PRP管可获得约5 mL PRP。所得PRP溶液现已可用于最终培养基的配制。该溶液可在安全柜内室温（RT）保存，直至后续进行血液分析仪检测及使用。</li>
	<li>使用PRP前，需使用全自动血液分析仪（材料表）测定血小板浓度、平均血小板体积以及红细胞和白细胞数量。操作时，小心吸取100 µL溶液并转移至1.5 mL离心管中。 
	注意：PRP作为自体培养添加剂使用时，终浓度为5–20%（v/v）。不同细胞系所需的最佳PRP浓度需单独确定。为防止纤维蛋白凝块形成，最终培养基中应添加2 U/mL肝素。</li>
</ol>
2. 自体成纤维细胞的分离及在含胎牛血清或富血小板血浆补充剂的培养基中的培养
<ol>
	<li>在50 mL聚丙烯管中，用磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻振荡清洗皮肤样本。</li>
	<li>如果皮肤样本相对较大（&#62;10 cm2），将样本放置于150 cm2组织培养皿的盖子上（表皮面朝下）。使用镊子和剪刀去除皮下脂肪组织。为防止组织干燥，每隔几分钟用PBS冲洗一次。 
	注意：较小的样本使用较小的组织培养皿。</li>
	<li>脂肪组织修剪完成后，用无菌手术刀将组织切成约0.5 cm × 1.5 cm的条状。</li>
	<li>向无菌15 mL离心管中加入5 mL胶原酶-分散酶混合液（材料表；14 Wünsch单位/mL）。</li>
	<li>将切好的组织转移至该离心管中，确保组织块完全浸没在溶液中。盖紧管盖。</li>
	<li>将离心管置于37 °C培养箱中，以轨道振荡方式孵育150分钟。孵育结束后，将含有组织的离心管转移至生物安全柜中。</li>
	<li>在生物安全柜内，将无菌100 mm培养皿的盖子倒置放置。将消化后的组织溶液转移至100 mm培养皿底部，避免飞溅。若离心管中仍有残留组织块，使用无菌1 mL移液器或无菌镊子将其转移至100 mm培养皿底部。</li>
	<li>将表皮条朝上，使用两对镊子分离完整的表皮层与真皮层。用一对镊子夹住组织条的真皮部分，另一对镊子夹住表皮边缘。将真皮与表皮从两端轻轻剥离，使分离后的组织片保留在同一盖子上。尽量快速完成此操作，并对每一块组织重复该步骤。</li>
	<li>将真皮组织片转移至另一含有PBS的100 mm培养皿中。</li>
	<li>使用实验室镊子，将真皮组织片放入含有3 mL 0.3%胰蛋白酶/PBS的15 mL聚丙烯管中。在37 °C水浴中孵育10–20分钟，每隔2–3分钟轻轻倒置混匀数次。</li>
	<li>为终止酶反应，加入3–5 mL冰冷新鲜完全培养基（含10% FBS的Dulbecco改良Eagle培养基[DMEM]或RPMI）。剧烈涡旋混匀数次。将成纤维细胞悬液通过85 μm尼龙滤网（置于50 mL离心管顶部）过滤，以去除真皮碎片。</li>
	<li>在4 °C条件下，以150 × g离心10分钟。吸除上清液，将沉淀重悬于100–1,000 μL完全培养基中。</li>
	<li>取细胞悬液与台盼蓝（稀释倍数为2倍）混合，填充血细胞计数室，计数总细胞数和活细胞数。 
	注意：细胞活力取决于酶消化条件。为提高细胞回收率和活力，可将皮肤样本切成更小的片段。</li>
	<li>在25 cm2组织培养瓶中，加入5 mL完全FBS培养基（DMEM，含10%经56 °C加热灭活60分钟的FBS，1% 1 M HEPES缓冲液，1% 100×非必需氨基酸混合液，1% 100× L-谷氨酰胺，1% 100×青霉素/链霉素，1% 100×丙酮酸钠），接种3–10 × 104个细胞。在37 °C培养箱中孵育。 
	注意：活的成纤维细胞将在24小时内贴壁，并在2–3天内开始呈现纺锤形。</li>
	<li>第2天，吸除含有非贴壁细胞的培养基，更换新鲜培养基。 
	注意：由于培养基中的死细胞会影响活的成纤维细胞生长，必须去除非贴壁的死细胞。</li>
	<li>每3–4天更换一次培养基，直至细胞达到70–80%融合度。</li>
	<li>收获成纤维细胞时，先用PBS洗涤，然后在37 °C培养箱中用胰蛋白酶/EDTA溶液孵育3分钟。</li>
	<li>为终止反应，加入3–5 mL预热的完全培养基（含10% FBS的DMEM或RPMI）。取部分细胞悬液，用血细胞计数板计数。以200 × g离心5分钟，吸除上清液。</li>
	<li>在培养箱中，以37 °C培养成纤维细胞于PRP培养基（DMEM，20% PRP，1% 1 M HEPES缓冲液，1% 100×非必需氨基酸混合液，1% 100× L-谷氨酰胺，1% 100×青霉素/链霉素，1% 100×丙酮酸钠，2 U/mL肝素）中。 
	注意：推荐的最低细胞密度为4,000个活细胞/cm2。</li>
	<li>为评估PRP对成纤维细胞增殖的影响，将第2代成纤维细胞以每孔8 × 103个细胞的密度接种于24孔板中，分别在含不同PRP浓度（1%、5%、10%、20%、30%、40%和50%）并添加2 U/mL肝素的PRP培养基，或经典培养条件（10% FBS）下培养。培养7天后，向细胞中加入活细胞染料（细胞增殖紫染料），通过流式细胞术评估增殖情况。</li>
	<li>为研究细胞骨架重排，将细胞以1 × 105个细胞/mL的浓度接种于96孔黑/透明平底板中，使用补充0.5% FBS的完全FBS生长DMEM（见步骤2.14）培养24小时。随后用10% FBS或不同浓度PRP（1%、5%、10%、20%、30%、40%和50%）处理细胞，持续7天。&#160;
	<ol>
		<li>用4%多聚甲醛固定成纤维细胞10分钟，室温下用0.1% Triton X-100透化5分钟。用50 mL浓度为5 U/mL的鬼笔环肽染色，PBS洗涤两次，再用50 mL浓度为1 mg/mL的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）标记5分钟。&#160;使用Cytation 3细胞成像多功能读板仪（BioTek）观察鬼笔环肽染色结果。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

本项目由 Regen Lab SA 资助。Sarah Berndt 担任 Regen Lab 的细胞治疗项目负责人，并受雇于 Regen Lab SA。Antoine Turzi 是 RegenLab 的首席执行官。

与用于创面细胞治疗的其他填充材料相比，使用自体成纤维细胞作为天然替代物的优势包括良好的生物相容性、极少的副作用，以及取材和使用的便捷性。然而，在将这些治疗方法应用于日常临床实践之前，必须进行适当的临床前研究，以明确其生长特性，并评估分离得到的成纤维细胞在移植前后生物学功能和安全性。因此，在完成分离操作后，必须迅速进行细胞的体外扩增，以限制细胞分裂次数。培养条件必须严格控制，以确保最终自体生物制品的安全性和有效性。
在已发表的临床前研究中，通常选择第3至第4代的细胞进行注射，因为这些代次的细胞在细胞数量、增殖活性和分泌活性方面最为适宜15。大多数临床前研究均使用以胎牛血清（FBS）作为营养物质和生长因子来源的培养基16。然而，这种异种来源的生长添加剂存在引发感染和免疫反应的潜在风险。由于全球范围内牛群中曾出现牛海绵状脑病（BSE），监管机构对在细胞培养中使用FBS作为补充物存在较大担忧，主要原因是其可能将异种物质引入细胞治疗培养体系10。</...

再生医学旨在修复或替换因年龄、疾病或创伤而受损的组织和器官，并纠正先天性缺陷。在自体治疗中，从患者体内取出细胞或组织，经扩增或修饰后，再重新引入供体体内。这种治疗方法在皮肤科领域具有广阔的应用前景1。在自体成纤维细胞治疗中，培养患者的成纤维细胞并重新注射，以治疗皱纹、褶皱或痤疮瘢痕。由于成纤维细胞是真皮中的主要功能细胞，注射自体成纤维细胞在面部年轻化方面可能比其他疗法更具优势2。
在皮肤中，成纤维细胞负责合成和分泌细胞外蛋白（如胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸和糖胺聚糖）。它们还释放生长因子，以调节正常皮肤稳态和伤口愈合过程中的细胞功能、细胞迁移以及细胞-基质/细胞-细胞相互作用3。真皮成纤维细胞已被提出作为皮肤伤口愈合4、组织再生5或在美容和整形外科手术中作为真皮填充剂的一种潜在临床细胞疗法6。一些研究甚至表明，在再生医学背景下，成纤维细胞可能比间充质干细胞更实用且更有效的细胞治疗选择7。
为了获得足够数量的成纤维细胞用于临床应用，通常必须进行细胞扩增。体外细胞培养需要在基础培养基中添加生长因子、蛋白质和酶，以支持细胞的黏附和增殖。胎牛血清（FBS）是细胞培养基中常用的添加剂，因为胎儿血液与成人血液相比：1）含有更丰富的生长因子；2）抗体含量较低8。随着细胞治疗的发展，人们对在培养基中添加FBS的传统细胞培养条件的安全性产生了担忧。此外，目前已有趋势使用替代物取代FBS9。多种FBS替代品已显示出良好的应用前景10。
此处选择的血小板富集血浆（PRP）替代方案为CuteCell-PRP，我们已开发出一种用于制备标准化PRP的医疗器械。该设备的预期用途是在GMP条件下，制备自体PRP，作为自体细胞体外扩增时的培养基补充物。
PRP 被定义为血小板在血浆中的浓缩悬液。由于存在多种制备方案，这些方案在 1）所需血液量、2）所用设备类型以及 3）离心程序方面各不相同，因此最终获得的血小板浓度从略高于到超过血液基础值 10 倍不等。此外，PRP 制剂中红细胞和白细胞的污染程度也各不相同。因此，“PRP”这一术语被用于描述在生物学组成和潜在治疗效果上差异显著的一类产品。
在大多数研究中，通过使用不同浓度的富血小板血浆（PRP）并加以激活（通过凝血酶或钙离子）来替代胎牛血清（FBS）。这种人工激活会引发血小板生长因子的迅速且显著释放，持续时间从15分钟至24小时11。因此，人们认为在细胞培养应用中，血小板的激活是不利的，因为此类应用需要生长因子通过血小板逐渐脱颗粒实现缓慢释放。
PRP 治疗涉及制备浓缩血小板血浆中的自体血小板12。最佳血小板浓度尚不明确，且市面上有多种商用设备可用于制备 PRP13。由于不同研究之间缺乏一致性，导致该领域缺乏标准化，进而使得注射剂量与时机成为一个“黑箱”问题。本方案描述了一种使用专用 PRP 设备获取自体 PRP 的操作流程，用于在完全自体的体外培养模型中扩增皮肤成纤维细胞。

<table><tbody><tr><td>96 孔黑色透明平底板</td><td>BD Falcon</td><td>353219</td><td>每箱 32 块</td></tr><tr><td>Cell trace Violet 染料</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>C34557</td><td>180 次检测</td></tr><tr><td>CuteCell PRP</td><td>Regen Lab SA</td><td>CC-PRP-3T</td><td>每包 3 支管</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>52400-025</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>谷氨酰胺 200 mM</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>血液学计数仪</td><td>Sysmex</td><td>KK-21N</td><td></td></tr><tr><td>肝素 5000U Liquemine</td><td>Drossapharm AG</td><td></td><td>0.5 mL</td></tr><tr><td>HEPES 缓冲液 1M</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Liberase DH</td><td>Roche</td><td>5401054001</td><td>每包 2 × 5 mg</td></tr><tr><td>MEM NEAA 100x</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>丙酮酸钠 1 mg/mL</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>鬼笔环肽 Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A12379</td><td>300 次使用</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>胰蛋白酶 1x 0.25%</td><td>Gibco</td><td>25050-014</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 0.25%</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>100 mL</td></tr></tbody></table>

自体富血小板血浆的制备及其在体外人成纤维细胞扩增中的促进作用

Production of Autologous Platelet-Rich Plasma for Boosting In Vitro Human Fibroblast Expansion

目前，自体成纤维细胞在皮肤修复中的临床应用受到广泛关注。大多数情况下，需要在体外培养皮肤细胞。然而，使用异种或同种异体培养基进行细胞培养存在一些缺点（例如，传染性病原体传播的风险或细胞扩增速度较慢）。本文建立了一种自体培养系统，利用患者自身的富血小板血浆（PRP）在体外扩增人皮肤成纤维细胞。在患者接受腹部成形术的同时，分离其真皮成纤维细胞。使用添加胎牛血清（FBS）或PRP的培养基对细胞培养过程进行为期最长7天的观察。评估PRP制备物中的血细胞含量、细胞增殖能力以及成纤维细胞的分化情况。本方案描述了使用专用医疗器械制备标准化、未激活状态PRP的方法。该制备过程仅需一种医疗器械（CuteCell-PRP）和离心机。在具备充分医疗操作条件的情况下，该装置构成一个一步式、无热原、无菌的封闭系统，仅需一次温和离心（1,500 × g，5分钟）。离心后，血液成分分层，富血小板血浆可被轻松收集。该装置可快速、稳定且标准化地制备PRP，适用于作为体外人细胞扩增的培养补充剂。所获得的PRP中血小板浓度较全血提高1.5倍，同时优先去除了红细胞和白细胞。结果表明，与FBS相比，PRP对细胞增殖具有显著促进作用（达7.7倍），且成纤维细胞在PRP处理后被有效激活。

这项专利技术是一种简单、快速且可重复的医疗器械，用于制备标准化的富血小板血浆（PRP）。该系统为一步法全封闭系统，仅需将静脉全血在1,500 × g 条件下离心5分钟（得益于分离胶技术），即可完成PRP的制备。离心后获得的PRP已去除位于分离胶下方的红细胞和白细胞。经过数次颠倒混匀，位于分离胶上方的血小板重新悬浮于血浆中，此时PRP即可使用（图1）。
为评估制备过程中血细胞成分的可重复性，使用血液分析仪对10名不同患者的全血和富血小板血浆（PRP）样本进行了分析。经过设备处理后，大部分红细胞（RBCs）和白细胞（WBCs）被去除。与全血中的生理浓度相比，血小板平均浓度增加了1.5倍（图2）。
在自体培养体系中，将患者分离的成纤维细胞在不同浓度血小板富集血浆（PRP）（1−50%）条件下进行培养，并与经典培养基条件（10% FBS）进行比较。在不更换培养基的情况下培养7天后，20% PRP预处...

本方案介绍了一种可制备富血小板血浆（PRP）的装置，用于在100%自体成纤维细胞培养系统中促进细胞的体外扩增。

目前，自体成纤维细胞在皮肤修复中的临床应用受到广泛关注。在大多数情况下，皮肤细胞的体外培养是……

本方案采用患者自体富血小板血浆（PRP）作为人成纤维细胞培养的自体系统，并经过五分钟的标准化制备。PRP可显著促进培养中成纤维细胞的扩增。当需要为自体细胞治疗实现大规模且安全的细胞扩增时，我推荐您使用PRP作为细胞补充剂的这一方法。进行该方案时，我建议您检查PRP的完整性。您的血浆必须非常纯净，不得含有红细胞。在转移过程中，操作务必小心谨慎。关于组织的消化，在进行下一步之前，必须确保组织非常洁净。首先，小心地将盛有血液的富血小板血浆（PRP）试管倒置三次，以使血液与抗凝剂充分混合。将血液样本置于固定角度为45度的转子中，在1500g条件下离心5分钟，并确保试管平衡。离心后，分离胶下方滞留有红细胞和白细胞，而血小板则位于胶的表面。轻轻倒置富血小板血浆（PRP）管20次，使血小板沉淀重新悬浮于血浆上清液中。确保血小板完全从胶上脱离，血浆应由清澈透明变为浑浊。 使用连接至10毫升注射器的转移装置从试管中收集血浆溶液。将皮肤样本放入含有PBS的50毫升聚丙烯管中，轻轻振荡管子。如果皮肤样本相对较大，将其表皮面朝下放置于150平方厘米组织培养皿的盖子上。使用镊子和剪刀去除皮下脂肪组织。为防止组织干燥，每隔几分钟用 PBS 冲洗组织一次。脂肪组织去除完成后，使用手术刀将皮肤样本切成约 0.5 × 1.5 厘米的条状。接下来，将5毫升胶原酶/分散酶混合液加入无菌的15毫升离心管中。将剪碎的组织转移至该管中。确保组织块完全浸没于溶液中，并牢固盖紧管盖。将试管放入37摄氏度的摇床培养箱中，以150分钟的时间进行振荡培养。培养结束后，将含有组织的试管转移至生物安全柜中。在生物安全柜内，将一个无菌100毫米培养皿的皿盖倒扣放置。将组织悬液转移至100毫米培养皿底部，避免溅出。若试管中仍有残留的组织块，使用无菌1毫升移液器或无菌镊子将组织块转移至培养皿底部。将真皮层用镊子夹住，并使表皮朝上。用另一把镊子夹住表皮边缘，将真皮与表皮剥离分开。将分离后的组织块保持在同一培养皿盖上，随后将真皮组织块放入一个新的含有 PBS 的 100 毫米培养皿中。接着，使用实验室镊子将真皮组织块转移至一个含有 3 毫升 0.3% 胰蛋白酶 PBS 的 15 毫升聚丙烯离心管中。将试管置于37°C水浴中孵育，每隔两到三分钟通过反复倒置试管混匀内容物。10至20分钟后，加入三到五毫升冰冻的完全培养基以终止反应。剧烈涡旋振荡试管数次。将含有成纤维细胞的悬液通过85微米尼龙筛网过滤至50毫升离心管中。在150g条件下离心成纤维细胞悬液10分钟。吸除上清液，并用100至200微升完全培养基重悬细胞沉淀，用于细胞计数。将细胞接种于25平方厘米的组织培养瓶中，随后在37摄氏度条件下孵育。次日更换含有非贴壁细胞的培养基，之后每三至四天更换一次。当成纤维细胞达到70%至80%融合度时，用PBS洗涤细胞，并加入胰蛋白酶-EDTA溶液。在37摄氏度孵育3分钟后，加入3至5毫升预热的完全培养基以终止反应。随后，将细胞悬液在200g下离心5分钟。用吸液法去除上清液。将成纤维细胞在PRP培养基中培养，并于37°C条件下孵育。建议的最低细胞密度为每平方厘米4,000个活细胞。采用一种专用的医疗器械，通过处理来自10位不同患者的全血来制备富血小板血浆（PRP）。该器械去除了大部分红细胞和白细胞。PRP中的平均血小板浓度比全血中的血小板浓度高出约50%。自体成纤维细胞在含10% FBS的培养基或含1%至50% PRP浓度的培养基中培养。培养七天后（未更换培养基），经20% PRP预处理的培养物中存活的成纤维细胞数量更高。与FBS相比，PRP作为增殖促进剂具有显著作用，增殖效果最高可达7.7倍。鬼笔环肽染色显示，PRP激活后观察到的形态学变化与F-actin的重组有关，这是成纤维细胞活化的特征性表现。快速细胞扩增的一个主要问题是基因组修饰的风险。为了评估这一点，可以进行比较基因组杂交实验以评估细胞的基因组稳定性。该技术的主要优势在于用PRP替代FBS，而PRP是一种更有效的自体生物补充剂。通过这种方法，研究人员可以在不添加任何异源性物质的情况下更快地大量培养细胞。该技术还可用于其他在临床应用前需要体外扩增的细胞类型，例如角质形成细胞或间充质干细胞。

production-autologous-platelet-rich-plasma-for-boosting-vitro-human

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

生产自体富血小板血浆以促进体外人成纤维细胞扩增

人血小板裂解液是生长因子的丰富来源，也是细胞培养中一种高效的补充剂。本方案介绍了从富血小板血浆开始，通过多次冻融循环并去除血小板碎片，制备大量人血小板裂解液的过程。...

制备人血小板裂解液（pHPL）作为无动物血清人干细胞培养的高效补充剂

本视频展示了一种巨核细胞分化及血小板形成的实验技术。从人脐带血中分离的造血干祖细胞在血小板生成素存在条件下，可分化为成熟的巨核细胞。成熟的巨核细胞产生称为前血小板的胞质突起，进而形成单个血小板。...

一种体外分化巨核细胞及形成血小板的方法

来源：Sathish Muthu1,2,31印度哥印拜陀骨科研究组。2卡帕甘高等教育学院工程学院生物技术系。3政府医学院骨科系。本视频演示了通过检测血小板计数、采集血液并离心分离血小板，制备高质量富血小板血浆（PRP）的方法。该 PRP...

从人外周血制备富血小板血浆

白细胞-血小板富集纤维蛋白（L-PRF）是一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的自体血小板浓缩制剂，具有独特的纤维蛋白结构、富集的血小板以及丰富的生长因子。本文介绍一种在临床椅旁制备L-PRF的实验方案，并评估其机械性能，包括单轴拉伸测试和缝线保持强度测试。...

富含白细胞和血小板的纤维蛋白的表征：一种新型生物材料

本文介绍了一种用于在具有双极的多孔板中平行培养48个组织的工程化结缔组织的制备方案，适用于机制研究、疾病建模和筛选应用。该方案适用于来自不同器官和物种的成纤维细胞，并以人原代心肌成纤维细胞为例进行了演示。...

用于筛选应用的成纤维细胞来源人源化工程化结缔组织

富血小板血浆（PRP）用于治疗马匹肌肉骨骼系统疾病。不同的制备技术所获得的PRP中血小板和白细胞浓度各不相同。本文介绍一种从马血液中获取PRP的方法。...

一种通过简易双离心管法从马血中获取富血小板血浆的方法

为将来作为修复前交叉韧带（ACL）部分撕裂的补片应用，从重建手术中获取的组织分离出人源ACL细胞，并进行扩增 体外...

手术获取、分离与 体外 用于组织工程应用的人前交叉韧带来源细胞的扩增

本手稿描述了一种由正常原代人食管成纤维细胞和鳞状上皮细胞在脱细胞猪源支架内接种培养而构建的组织工程三维食管结构，介绍了其制备方法、表征结果及潜在应用。研究结果表明，该结构可形成成熟的复层上皮，类似于正常人食管组织。...

三维组织工程人食管黏膜模型的制备、表征及其潜在应用

介绍了一种生成高容量腺病毒载体的方案，该载体缺失所有病毒编码序列。载体基因组中转基因的克隆基于归巢核酸内切酶技术。病毒在贴壁生长或悬浮培养的生产细胞中的扩增依赖于提供病毒基因反式表达的辅助病毒。...

基于人5型腺病毒的高容量腺病毒载体的克隆与大规模生产

我们开发了一种眼刺激性测试方法，该方法采用三维重建的人角膜样上皮（RhCE）组织模型。该测试能够区分具有眼刺激性或腐蚀性的物质（GHS 第1类和第2类合并）与无需标注分类的物质（GHS...

使用重建人角膜样上皮（RhCE）组织模型进行化学品眼刺激性危害识别的刺激性眼试验（EIT）

了解利用自体富血小板血浆体外扩增人成纤维细胞的标准化方法。该技术可在五分钟内完成PRP制备，实现细胞高效增殖，适用于再生医学领域的自体细胞治疗研究。

自体富血小板血浆的制备及其在体外人成纤维细胞扩增中的促进作用

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