Name: 产后神经球的分离和扩张 （P1+3） 小鼠神经原性球 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 学习从产后小鼠脑室下区和齿状回分离神经干细胞并培养神经球的方法。该技术可用于研究神经发生、细胞命运决定及神经系统疾病的细胞机制。

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本工作由 IF/01227/2015 和 UID/BIM/50005/2019 项目资助，该项目由科学技术基金会（FCT）/科学、技术和高等教育部（MCTES）通过国家预算资金提供支持。R.S.（SFRH/BD/128280/2017）、F.F.R.（IMM/CT/35-2018）、D.M.L.（PD/BD/141784/2018）和 R.S.R.（SFRH/BD/129710/2017）获得了 FCT 提供的博士奖学金。作者谨此感谢约翰·洛博·安东尼奥分子医学研究所生物成像平台成员在显微镜技术方面的协助。

所有实验均按照欧洲共同体（86/609/EEC；2010/63/EU；2012/707/EU）以及葡萄牙（DL 113/2013）关于用于科学目的动物保护的法律法规进行。该实验方案已获&#34;iMM机构动物福利委员会—ORBEA-iMM及国家主管机构—DGAV（Direcção Geral de Alimentação e Veterinária）&#34;批准。
1. 培养基的基本配制与准备
<ol>
	<li>解剖当天，配制适量的生长培养基，对应无血清培养基（SFM），其成分为添加了L-谷氨酰胺的杜尔贝科改良伊格尔培养基[(DMEM)/F12]（材料表），并补充100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素（青/链霉素），1% B27，以及10 ng/mL EGF和5 ng/mL bFGF。将培养基在水浴中预热至37 °C。 
	注意：生长培养基的体积取决于仔鼠数量，对于5只仔鼠，准备约100 mL（侧脑室下区SVZ和齿状回DG各50 mL）；但在完成细胞计数后（步骤5.1），需进一步精确调整体积。</li>
	<li>用于SVZ和DG显微解剖的培养基，需配制不含钙和镁的汉克斯平衡盐溶液（HBSS），并补充100 U/mL青/链霉素。 
	注意：准备50−100 mL解剖用培养基。</li>
	<li>设置好解剖显微镜，并准备好取脑所需的工具（剪刀和小刮勺），以及用于SVZ和DG显微解剖的工具（Dumont小型剪刀、#7镊子、#5镊子、#5S镊子），将这些工具浸泡于70%乙醇中备用。</li>
</ol>
2. 收集出生后（P1−3）小鼠脑组织及侧脑室下区/齿状回显微解剖
<ol>
	<li>准备60 mm的培养皿（生长面积为21 cm2），内含添加青霉素/链霉素的HBSS，并准备2个样本管（一个用于SVZ，一个用于DG），每管加入500 µL含补充物的HBSS。</li>
	<li>根据机构动物护理设施/指南批准的方案处死出生后1–3天（P1−3）的小鼠幼崽。在脑干基部用锋利的剪刀进行单次切割，实施断头术。</li>
	<li>用小尖头剪刀夹住头部基部的腹侧身体部位，在整个头部长度上沿中线切开皮肤，从而暴露颅骨表面。</li>
	<li>在颅骨基部做一纵向切口，并沿矢状缝继续用小剪刀尽可能以浅角度剪开，以避免损伤脑组织结构。</li>
	<li>使用弯头镊子将颅骨向两侧剥离，暴露脑组织。 
	注意：确保解剖器械在接触脑组织前不含乙醇。</li>
	<li>使用小刮勺从颅骨中分离脑组织，将其滑入脑基底部切断连接的脑神经和血管，然后将脑组织转移至含有冷的含补充物HBSS溶液的培养皿中。</li>
	<li>将盛有脑组织的培养皿置于解剖显微镜下，使用低倍镜观察，并将脑组织背侧朝上放置。</li>
	<li>用精细镊子夹住小脑固定脑组织，从脑腹侧去除脑膜和嗅球。将脑组织翻转至腹面朝上，剥除其余脑膜。 
	注意：去除背侧脑膜是确保正确切片的关键步骤。</li>
	<li>用镊子切除小脑。将孔径为11 µm的滤纸放置于组织切片机（材料表）上，用弯头尖镊将脑组织置于滤纸上。将脑组织切成450 µm厚的冠状切片，并用湿润的剥离刀将切好的脑组织收集到盛有冷的含补充物HBSS的新培养皿中。</li>
	<li>为分离侧脑室下区（SVZ），在解剖显微镜下用镊子从前向后方向分离冠状切片，直至找到含有侧脑室的切片。</li>
	<li>用精细镊子切下围绕侧脑室侧壁的薄层组织（即SVZ），排除纹状体实质和胼胝体。将镊子尖端插入侧脑室的外侧角：一个位于胼胝体正下方，另一个位于侧脑室腹侧区域相邻的组织中，然后围绕侧脑室切下一小条组织，以分离SVZ。</li>
	<li>将分离的组织收集到预先标记为SVZ、含有补充HBSS溶液的样本管中。 
	注意：在侧脑室和海马结构开始同时出现的切片中，应排除SVZ组织。</li>
	<li>在完成SVZ显微解剖后，继续从前向后检查所有切片，直至到达海马结构。用镊子丢弃第一个海马切片（此时齿状回DG尚不可辨认）。</li>
	<li>为分离齿状回（DG），首先从切片中分离出海马。重新对焦显微镜，以清晰观察DG周围的边界。</li>
	<li>用镊子在DG与CA1区之间进行切割，随后在DG与CA3区之间做垂直切割，分离出DG部分。去除穹窿及其周围任何邻近组织。 
	注意：在P1−3的小鼠中，DG与阿蒙氏角几乎难以区分，但会显示出一个小尖端。</li>
	<li>将分离的组织收集到预先标记为DG、含有补充HBSS溶液的样本管中。 
	注意：海马或其周围区域的整体损伤将增加DG分离的难度。当操作者不熟悉从冠状切片中分离SVZ&#160;和DG组织时，使用新生小鼠脑图谱至关重要。</li>
</ol>
3. 组织解离
<ol>
	<li>为了分离各自试管中的SVZ和DG组织，加入0.05%的胰蛋白酶-EDTA，使HBSS中的胰蛋白酶-EDTA 0.05%终浓度为5−10%。在37 °C下孵育约15分钟，直至组织聚集成团。</li>
	<li>通过移除培养基并加入1 mL新鲜的HBSS补充溶液，连续洗涤组织4次，以去除胰蛋白酶。</li>
	<li>移除HBSS，将消化后的组织重悬于1 mL添加了10 ng/mL EGF和5 ng/mL bFGF的SFM中。使用P1000移液器轻轻吹打沉淀物约7−10次，直至获得均一的细胞悬液。 
	注意：过度的机械解离可能导致细胞死亡增加，从而对后续细胞生长产生不利影响。</li>
</ol>
4. 研究细胞命运的细胞对实验
<ol>
	<li>实验前，根据第8-10节制备包被的24孔板，用于贴壁单层培养。</li>
	<li>为计数待接种的SVZ或DG细胞（见第3节），使用含0.2%台盼蓝的溶液，并用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	<li>将解离后的细胞悬液用添加了5 ng/mL EGF和2.5 ng/mL bFGF（低浓度EGF/bFGF）的无血清培养基（SFM）稀释至密度为11,300个细胞/cm2，接种于包被的玻璃盖玻片上。</li>
	<li>24小时后，对细胞进行固定，用于针对神经干细胞标志物（如性别决定区Y框蛋白2（Sox2）和巢蛋白）以及神经元谱系标志物（即双皮质素[DCX]，用于标记未成熟神经元）的免疫细胞化学染色（见第14节）。 
	注意：Sox2是经历有丝分裂的神经干细胞的标志物。由单个前体细胞分裂产生的Sox2+/+成对细胞反映了干细胞的扩增7。</li>
</ol>
5. 作为神经球扩增产后神经干细胞
<ol>
	<li>为确定第3节中获得的SVZ&#160;或DG细胞悬液的密度，使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	<li>将SVZ和DG单细胞悬液用添加了10 ng/mL EGF和5 ng/mL bFGF的无血清培养基（SFM）稀释至密度为2 × 104 cells/mL。将SVZ和DG细胞接种于未包被的60 mm培养皿中，每培养皿终体积为5 mL。</li>
	<li>将SVZ和DG细胞分别在37 °C、5% CO2条件下孵育6−8天和10−12天，以形成初级神经球。 
	注意：孵育时间超过上述范围可能导致神经球聚集，并增加神经球中心区域的细胞死亡。</li>
	<li>当大多数神经球直径达到150−200 µm时，进行神经球传代。 
	注意：若神经球未达到适当直径即进行传代，将影响后续所有步骤。</li>
</ol>
6. 神经球的传代
注意：以下方案可用于扩增SVZ和DG神经球。
<ol>
	<li>传代神经球时，从60 mm培养皿中收集含有生长因子的无血清培养基（SFM）及神经球，于300 × g 离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，根据试剂盒说明书（小鼠用化学解离试剂盒）重悬神经球沉淀（材料表）。 
	注意：请严格遵守孵育时间，因其对实验效果至关重要。</li>
	<li>于300 × g 离心5分钟，弃去上清液后加入1 mL添加了10 ng/mL EGF和5 ng/mL bFGF的SFM培养基。</li>
	<li>使用P1000移液器反复吹打约10次，以解离神经球。</li>
	<li>用含0.2%台盼蓝的溶液结合血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
	<li>以2 × 104 个细胞/mL的密度将细胞重新接种至未包被的60 mm培养皿中。</li>
	<li>将侧脑室下区（SVZ）和齿状回（DG）来源的细胞分别在37 °C、5% CO2 条件下培养6–8天和10–12天，以获得次级神经球。 
	注意：可通过执行第5和第6部分的实验步骤评估SVZ和DG来源的神经干细胞/前体细胞（NSPCs）的自我更新能力。具体操作为：将SVZ和DG细胞以1.0 × 104 个细胞/mL的密度接种于含有5 ng/mL EGF和2.5 ng/mL bFGF（低浓度EGF/bFGF）的生长型SFM培养基中的未包被24孔板中，随后计数形成的初级和次级神经球数量。</li>
</ol>
7. 神经球的保存
<ol>
	<li>从60 mm培养皿中收集含有神经球的培养基（来自步骤5.3和6.7）。</li>
	<li>在300 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>用1 mL HBSS洗涤细胞2次（每次在300 × g 条件下离心5分钟）。</li>
	<li>在300 × g 条件下离心5分钟，弃去上清液，将神经球沉淀物于-20 °C保存，用于分子生物学分析。</li>
</ol>
8. PDL 包被板操作步骤
<ol>
	<li>配制溶液1（0.1 M 硼酸盐缓冲液）：称取3.92 g硼酸，溶于400 mL高纯水中。调节pH至8.2，再用高纯水定容至500 mL。</li>
	<li>配制溶液2（0.167 M 硼酸盐缓冲液）：称取10.3 g硼酸，溶于900 mL高纯水中。调节pH至8.2，再用高纯水定容至1,000 mL。</li>
	<li>重悬聚-D-赖氨酸（PDL）（在0.1 M 硼酸盐缓冲液中配制成1 mg/mL）：将100 mg PDL溶于100 mL溶液1中。</li>
	<li>分装成每份10 mL，可立即使用或于-20 °C冷冻保存。</li>
	<li>在超净工作台内，每孔加入一个盖玻片，并用紫外光照射15分钟进行灭菌。</li>
	<li>使用重悬后的PDL，或解冻已冷冻保存的重悬PDL。</li>
	<li>将10 mL重悬PDL加入90 mL溶液2中，制备终浓度为100 µg/mL的PDL（溶于0.167 M 硼酸盐缓冲液）的最终溶液。</li>
	<li>将最终溶液加入各孔中，于37 °C孵育至少2小时至过夜。 
	注意：对于24孔板，每孔加入500 µL。</li>
	<li>吸除溶液，并用高纯水洗涤3次。</li>
	<li>将盖玻片置于超净工作台内自然干燥。</li>
	<li>将多孔培养板存放于4 °C环境中。</li>
</ol>
9. PDL/层粘连蛋白包被板操作步骤
<ol>
	<li>第1天，按照第8节所述方法用PDL包被培养板。</li>
	<li>第2天，移除PDL溶液，并用高纯度水洗涤3次。静置晾干。</li>
	<li>在不含生长因子的冷SF培养基中配制5 µg/mL的层粘连蛋白溶液。</li>
	<li>将溶解的层粘连蛋白加入盖玻片，并于37 °C孵育过夜。 
	注意：对于24孔板，每孔加入500 µL体积。</li>
	<li>用移液器移除层粘连蛋白。 
	注意：不要用水或缓冲液洗涤盖玻片上的层粘连蛋白。</li>
	<li>立即使用或于-20 °C保存。</li>
</ol>
10. 多聚-L-鸟氨酸（PLO）/层粘连蛋白包被步骤
<ol>
	<li>在超净工作台内，每孔加入一个盖玻片，并用紫外光照射15分钟进行灭菌。</li>
	<li>在室温（RT）下，向每孔加入0.01%多聚赖氨酸（PLO）溶液，孵育20分钟。 
	注意：对于24孔板，每孔加入500 µL溶液。</li>
	<li>移除溶液，用无菌1×PBS洗涤3次，然后晾干。</li>
	<li>用无菌1×PBS配制5 µg/mL的层粘连蛋白溶液。</li>
	<li>在37 °C下孵育2小时。</li>
	<li>移除层粘连蛋白溶液。 
	注意：不要用水洗涤去除盖玻片上的层粘连蛋白。</li>
	<li>立即使用。 
	注意：用移液器枪头轻轻敲击盖玻片，确保盖玻片表面完全被PLO溶液覆盖。轻轻晃动多孔板时应无声响。</li>
</ol>
11. 通过生成分化的单层细胞评估神经突起形成
<ol>
	<li>从60 mm培养皿（来自第5节）中收集含有神经球的培养基，在室温下以300 × g 离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，并将神经球沉淀物在1 mL解离PBS（即不含Mg2+/Ca2+、含EDTA的PBS [2.7 mM KCl、1.5 mM KH2PO4、137 mM NaCl、8.1 mM Na2HPO4 和 0.5 mM EDTA 4Na，pH = 7.40]）中孵育15分钟，随后进行机械解离。或者，使用小鼠专用的化学解离试剂盒进行神经球解离（材料表）。</li>
	<li>在室温下以300 × g 离心5分钟，弃去上清液。</li>
	<li>将细胞沉淀物重悬于1 mL不含生长因子的无血清培养基（SFM）中。</li>
	<li>使用血细胞计数板测定细胞密度。</li>
	<li>将解离后的细胞悬液用不含生长因子的SFM稀释至密度为3,766个细胞/cm2，接种于24孔板中包被过的玻璃盖玻片上&#160;。</li>
	<li>培养1−3天后，对细胞进行固定，用于针对细胞骨架蛋白的免疫细胞化学染色（参见第14节）。</li>
</ol>
12. 神经球培养物的分化
注意：从细胞扩增获得的神经球，无论是来自原代神经球还是传代神经球（在第5或第6部分中获得），均可分化为不同神经谱系的细胞。
<ol>
	<li>当神经球直径达到 150−200 µm 时，吸取 25 µL 神经球悬浮液，并&#160;接种至包被的玻璃盖玻片上，置于 24 孔板中。 
	注意：为收集更多神经球，可轻轻旋转培养皿使神经球集中于中央，随后从中部吸取悬浮液。</li>
	<li>将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育 15 分钟，使神经球贴附于基质，随后加入 500 µL 不含生长因子的无血清培养基（分化条件）。</li>
	<li>24 小时后，更换为新鲜的不含生长因子的无血清培养基。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO2 和 95% 大气空气条件下培养不同时间点（例如体外培养 2 天和 7 天，分别记为 DIV2 和 DIV7）。 
	注意：可采用不同的细胞检测方法分析细胞存活、增殖和分化情况。</li>
</ol>
13. 细胞生物学实验
<ol>
	<li>细胞存活率检测
	<ol>
		<li>在37 °C培养箱中固定细胞前，将已贴壁的神经球暴露于3 µg/mL碘化丙啶（PI）中30分钟。 
		注：PI是一种自发荧光试剂，仅能进入细胞膜完整性受损的细胞8。也可采用其他方法分析细胞存活情况，例如caspase 3染色或末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞增殖检测
	<ol>
		<li>在37 °C培养箱中固定前，将已贴壁的神经球暴露于10 µM 5-溴-2'-脱氧尿苷（BrdU）中4小时。 
		注：BrdU是一种合成的胸苷类似物，可在增殖细胞DNA合成过程中被整合入DNA9。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞分化检测
	<ol>
		<li>将培养7天的贴壁神经球在37 °C培养箱中，于前24小时暴露于10 µM BrdU中。</li>
		<li>更换不含生长因子的无血清培养基（促分化条件），在无BrdU条件下继续培养6天，直至固定。 
		注：此类脉冲-追踪实验通过与成熟神经细胞标志物共标记，可评估在本实验流程中分化为成熟细胞的前体细胞。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
14. 神经球培养物的免疫染色
<ol>
	<li>细胞固定
	<ol>
		<li>在1× PBS中配制4%多聚甲醛（PFA），于4 °C或-20 °C保存。</li>
		<li>移除不含生长因子的无血清培养基（SFM），每孔加入500 µL 4% PFA（4 °C），室温孵育20分钟。</li>
		<li>用1× PBS洗涤含分化神经球的盖玻片，每次5分钟，共洗3次。</li>
		<li>将盖玻片保存于4 °C、500 µL 1× PBS中，直至使用。 
		注意：若实验未使用BrdU，则跳至步骤14.3。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>变性处理（仅适用于BrdU实验）
	<ol>
		<li>将1 M HCl预热至37 °C。</li>
		<li>用1× PBS冲洗盖玻片3次。</li>
		<li>在含1%非离子型表面活性剂（如Triton X-100）的PBS中孵育30分钟，以通透细胞。</li>
		<li>加入预热至37 °C的1 M HCl，于37 °C孵育30–40分钟，使双链DNA变性（每孔约300 µL）。</li>
		<li>用1× PBS洗涤孔板4次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通透与封闭
	<ol>
		<li>用1× PBS冲洗盖玻片5分钟。</li>
		<li>在含0.5%非离子型表面活性剂和3%牛血清白蛋白（BSA）的1× PBS中孵育1.5小时（每孔约300 µL）。 
		注意：若检测NeuN，应使用含6% BSA的1× PBS。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育与封片
	<ol>
		<li>第1天，无需洗涤，直接在孵育盒中加入一抗（见材料表），溶于含0.1%非离子型表面活性剂和0.3% BSA的1× PBS中（24孔板每孔20 µL）。若一抗偶联荧光染料，则于4 °C避光孵育过夜。</li>
		<li>第2天，将盖玻片放回对应孔中，用1× PBS冲洗3次，每次5分钟。</li>
		<li>在孵育盒中，加入适当荧光标记的二抗（稀释比1:200）和12 µg/mL Hoechst 33342，溶于1× PBS中，室温避光孵育2小时（每张盖玻片20 µL）。</li>
		<li>用1× PBS洗涤盖玻片3次，每次5分钟。</li>
		<li>使用5 µL/盖玻片的荧光封片剂，将盖玻片封固于载玻片上。</li>
		<li>室温避光自然干燥1天。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>显微成像
	<ol>
		<li>使用荧光显微镜观察并采集图像。</li>
		<li>每种实验条件设三个重复；每张盖玻片选取五个独立视野，使用40倍物镜进行细胞计数（每个视野约100个细胞）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
15. EGF 和 bFGF 储存液的配制
<ol>
	<li>EGF 储存液
	<ol>
		<li>为溶解冻干的 EGF，将产品用高纯度水稀释至终浓度为 20 µg/mL。</li>
		<li>分装后置于微量离心管中，于 -5 至 -20 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>bFGF 储存液 
	注意：bFGF 必须使用 10 mM Tris（pH 7.6）溶液进行重悬。
	<ol>
		<li>打开前短暂离心管体，使内容物沉降至管底。</li>
		<li>配制 50 mL 的 10 mM Tris（pH 7.6）溶液：称取 60.57 mg Tris（(HOCH2)3CNH2)，溶于 40 mL 高纯度水中，调节 pH 至 7.6，再用高纯度水定容至 50 mL。</li>
		<li>配制 10 mL 的含 0.1% BSA 的 10 mM Tris 溶液（pH 7.6）：称取 10 mg BSA，溶于 10 mL 的 10 mM Tris 溶液中。</li>
		<li>在超净工作台中，使用 0.22 µm 滤器过滤步骤 15.2.2 和 15.2.3 中配制的溶液。</li>
		<li>将 10 µg bFGF 溶于 1,000 µL 含 0.1% BSA 的 10 mM Tris 溶液（pH 7.6）中，使其终浓度为 10 µg/mL。分装至微量离心管中，于 -20 °C 保存，最长可保存 6 个月。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Reynolds, B., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+the+adult+mouse+neural+stem+cells+using+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (45), e2393(2010).</li>
<li>Vescovi, A. L., Reynolds, B. A., Fraser, D. D., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((bFGF+regulates+the+proliferative+fate+of+unipotent+%28neuronal%29+and+bipotent+%28neuronal%2Fastroglial%29+EGF-generated+CNS+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">bFGF regulates the proliferative fate of unipotent (neuronal) and bipotent (neuronal/astroglial) EGF-generated CNS progenitor cells.</a> Neuron. 11 (5), 951-966 (1993).</li>
<li>Rietze, R. L., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+Stem+Cell+Isolation+and+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Neural Stem Cell Isolation and Characterization.</a> Methods in Enzymology. 419, 3-23 (2006).</li>
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作者无任何利益冲突需要披露。

NSPCs 的体外系统有助于更好地理解细胞和分子机制，并可在体内进一步验证。由于具有三维结构，神经球分析法（NSA）是一种模拟生理条件的强有力方法。此外，与其他体外系统（如单层培养系统）相比，该培养系统在技术上也更易于操作10。事实上，在细胞发育过程中，无论是扩增阶段还是分化阶段，通过向培养基中添加精确且可变浓度的兴趣因子，或通过将神经球与其他细胞类型共培养，均可在 NSA 中轻松控制外界刺激信号6。此外，与单层培养相比，NSA 能够利用少量组织或少量细胞获得更高的细胞密度，从而可进行平行研究，减少实验动物的使用数量1。
NSA 是分离和扩增 NSCs 最常用的方法11,12,13可用于估算给定组织样本中前体细胞的数量5 以及不同条件下前体细胞的频率。然而，神经球和单层培养均未考虑静息态神经干细胞（NSCs）14此外，NSA 存在一些局限性11,12,13 神经球的形成频率取决于多种因素，包括培养基成分、解剖操作以及解离过程11,12,13，以及神经球聚集5事实上，在高密度培养中，神经球 tends to 发生聚集。因此，在估算样本中前体细胞数量时需格外谨慎。为了克服上述局限性，分离的NSPCs也可在单层培养条件下进行扩增和传代。5,15重要的是，使用NSA来比较不同条件下前体细胞频率非常有用且准确，因为所有这些局限性在同一次实验的不同条件下都是隐含且相似的。
神经球培养过程中存在一些需要特别注意的关键步骤。在脑组织采集步骤中，必须完全去除脑膜并良好分离神经发生微环境，这是最大化神经干细胞前体细胞（NSPCs）纯度和产量的关键。在组织解离过程中，由于胰蛋白酶具有蛋白水解活性，过量使用胰蛋白酶或过长的孵育时间可能导致细胞裂解。此外，传代时间点对于获得健康的神经球群体至关重要。当神经球直径超过200 µm时进行传代，会显著影响NSPCs的存活率、增殖能力及分化能力。值得注意的是，过长的传代周期（超过10代）可能增加遗传不稳定性6。此外，分别对侧脑室下区（SVZ）细胞和齿状回（DG）细胞使用多聚赖氨酸（PDL）以及PDL/层粘连蛋白（laminin）包被培养表面，对于确保神经球细胞良好迁移、同时不干扰分化过程至关重要。在免疫细胞化学分析方面，使用多聚甲醛（PFA）孵育时间过长可能因遮蔽抗原表位并增加背景信号而影响染色效果。
美国国家安全局（NSA）是&#160;一种强大的工具，可为神经发育与分化体外研究以及治疗应用提供持续且无限的神经干细胞前体细胞来源16,17事实上，该检测方法可应用于遗传学和行为学模型，以进一步理解神经干细胞前体细胞增殖与分化过程中涉及的分子和细胞机制18,19该检测方法还可用于测试不同的药物和化合物20,21,22 以及进行遗传操作19,23 以调控NSC特性。除了免疫细胞化学外，还可进行逆转录聚合酶链式反应和蛋白质印迹分析以检测RNA和蛋白质表达水平，而电生理学研究和钙成像则可用于评估新生神经元的功能。21.

神经球实验（NSA）最早于1992年被描述1,2，至今仍是神经干细胞（NSC）研究中一种独特而强大的工具。由于目前对在生理条件下维持这些细胞所需条件的理解仍不充分，从主要的神经发生区域分离NSCs仍面临诸多挑战。在NSA中，细胞被培养在化学成分明确且无血清的培养基中，并添加包括表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）在内的生长因子1,2,3。通过使用这些有丝分裂原可选择性地富集神经前体细胞（干细胞和祖细胞），因为这些细胞对EGF和FGF有响应，进入活跃增殖阶段，而其他细胞（即已分化的细胞）则会死亡4。神经前体细胞以神经球的形式生长，随后可通过传代进一步扩增这些细胞的数量5。重要的是，由于这些神经干细胞/祖细胞（NSPCs）具有多向分化潜能，它们能够分化为中枢神经系统（CNS）的三种主要细胞类型：神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞5。
神经球培养体系（NSA）提供了一种可再生的未分化中枢神经系统前体细胞来源，可用于在生理和疾病背景下研究多种过程，包括神经干细胞（NSC）的增殖与自我更新，以及神经元和胶质细胞的分化。此外，体外研究可用于评估发育过程中神经前体细胞内在特化程度，同时通过去除其正常微环境中的外在信号，来探究这些细胞的全部潜能6。神经球模型对于评估潜在调控因子具有重要价值，因为通过在无血清培养基中维持细胞生长，环境信号仅来源于周围细胞6。此外，在神经球培养体系中，神经干细胞/前体细胞（NSPCs）易于在体外扩增，单位面积细胞密度高，且神经球的异质性组成在一定程度上模拟了体内微环境6。正是由于这些已被广泛证实的优势，该方法已被众多研究人员广泛采用。
以下方案详细描述了从出生后神经干细胞/前体细胞（NSPC）群体的分离开始，到其作为神经球扩增，以及分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的全部过程。这些NSPC来源于两个主要的神经发生区域：脑室下区（SVZ）和海马齿状回（DG）。最后，还介绍了多种检测方法，用于评估源自SVZ和DG的NSPC的干性及多向分化潜能。

<table><tbody><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>12 mm 玻璃盖玻片</td><td>VWR</td><td>631-1577</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>5-溴-2'-脱氧尿苷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9285-1G</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>70% 乙醇</td><td>Manuel Vieira &amp;amp; C&amp;ordf; (Irm&amp;atilde;o) Sucrs, Lda</td><td>UN1170</td><td></td></tr><tr><td>黏附载玻片，Menzel Gl&amp;auml;ser，SuperFrost Plus</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗鸡 IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗兔 IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 驴抗大鼠 IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 驴抗小鼠 IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 驴抗兔 IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 山羊抗小鼠 IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A21235</td><td></td></tr><tr><td>抗5-溴-2-脱氧尿苷抗体</td><td>Dako</td><td>M0744</td><td></td></tr><tr><td>抗CD140a (PDGFR&amp;alpha;) (大鼠)</td><td>BD Biosciences</td><td>558774</td><td>按1:500比例稀释。</td></tr><tr><td>抗硫酸软骨素蛋白聚糖NG2 (兔)</td><td>Merck Milipore</td><td>AB5320</td><td>按1:200比例稀释。</td></tr><tr><td>抗双皮质素 (兔)</td><td>Abcam</td><td>ab18723</td><td>按1:200比例稀释。</td></tr><tr><td>抗双皮质素 (鸡)</td><td>Synaptic Systems</td><td>326006</td><td>按1:500比例稀释。</td></tr><tr><td>抗胶质纤维酸性蛋白 (兔)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9269-.2ML</td><td>按1:1000比例稀释。</td></tr><tr><td>抗髓鞘碱性蛋白 (兔)</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>78896S</td><td>按1:200比例稀释。</td></tr><tr><td>抗巢蛋白 (小鼠)</td><td>Merck Milipore</td><td>MAB353</td><td>按1:200比例稀释。</td></tr><tr><td>抗神经元核抗原 (小鼠)</td><td>Merck Milipore</td><td>MAB377</td><td>使用含6% BSA的1X PBS缓冲液。按1:400比例稀释。</td></tr><tr><td>抗SOX2 (兔)</td><td>Abcam</td><td>ab97959</td><td>按1:500比例稀释。</td></tr><tr><td>抗微管蛋白 &amp;beta;3 (兔)</td><td>BioLegend</td><td>802001</td><td>按1:200比例稀释。</td></tr><tr><td>Axiovert 200 宽场显微镜</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-27 补充剂 (50X)，无血清</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>硼酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-500g</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>NZYTech</td><td>MB04602</td><td></td></tr><tr><td>细胞计数板，Neubauer型</td><td>Hirschmann</td><td>8100104</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>ESCO</td><td>CCL-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar TC处理24孔板</td><td>Corning</td><td>CLS3524-100EA</td><td></td></tr><tr><td>二水合磷酸氢二钠</td><td>Merck Milipore</td><td>1.06580.1000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12，含GlutaMAX补充剂</td><td>ThermoFisher</td><td>31331028</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 精细镊子</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5S 镊子</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 镊子</td><td>FST</td><td>11272-30</td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子</td><td>ThermoFisher</td><td>53003018</td><td></td></tr><tr><td>成纤维细胞生长因子</td><td>ThermoFisher</td><td>13256029</td><td></td></tr><tr><td>滤纸</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀 - 锐利型</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Gillette Platinum 5刀片剃须刀</td><td>Gillette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无钙无镁HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>14175053</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>1399</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Merck Milipore</td><td>1.09057.1000 (1L)</td><td></td></tr><tr><td>Labculture II级生物安全柜</td><td>ESCO</td><td>2012-65727</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>McILWAIN 组织切片机</td><td>The Mickle Laboratory Engineering CO. LTD.</td><td>MTC/2</td><td>设定为450 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>微型刮勺 - 12 cm</td><td>FST</td><td>10091-12</td><td></td></tr><tr><td>0.5 mL 微量离心管</td><td>SARSTEDT</td><td>72.699</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>SARSTEDT</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL 微量离心管</td><td>SARSTEDT</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>NeuroCult 化学解离试剂盒 (小鼠)</td><td>Stem Cell</td><td>5707</td><td></td></tr><tr><td>Olympus SZ51 体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛，粉末</td><td>VWR</td><td>28794.295</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>Corning</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐标准溶液，PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;3- 水溶液</td><td>BDH ARISTAR</td><td>452232C</td><td></td></tr><tr><td>聚-D-赖氨酸 100 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7886</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-鸟氨酸溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405-250g</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170-25MG</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>VWR</td><td>27800.360.5K</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Merck Milipore</td><td>535C549998</td><td></td></tr><tr><td>吐温X-100</td><td>BDH</td><td>14630</td><td></td></tr><tr><td>VWR INCU-Line IL10</td><td>VWR</td><td>390-0384</td><td></td></tr></tbody></table>

从出生后（p1–3）小鼠神经发生微环境中分离与扩增神经球

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

神经球实验是一种非常有用的体外技术，用于研究神经干细胞/前体细胞（NSPCs）的固有特性，包括增殖、自我更新和多向分化潜能。在出生后及成年大脑中，NSPCs主要存在于两个神经发生微环境：侧脑室壁的室下区（SVZ）以及海马齿状回的颗粒下区（DG）。从出生后脑组织中分离这些神经发生微环境，可在体外培养中获得更大量的NSPCs，从而显著提高产量。每个神经球内细胞间的紧密接触形成了一种可能类似于神经发生微环境的局部微环境。本文详细描述了如何从出生后1−3天（P1−3）的小鼠中分离SVZ和DG来源的神经球并建立培养体系，以及神经球传代扩增的方法。该方法具有显著优势，因为神经球实验可在较短时间内获得NSPC克隆（6−12天），并显著减少实验动物的使用数量。通过将神经球接种于诱导分化条件下，可获得由NSPCs及不同神经谱系的分化细胞（包括神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞）组成的拟单层细胞结构，从而可用于研究内在或外在因素对NSPC增殖、分化、细胞存活及神经突起形成的调控作用。

通过神经球培养法（NSA）获得的侧脑室下区（SVZ）和齿状回（DG）神经球由未分化细胞组成，这些细胞表达Sox2（一种与自我更新能力相关的转录因子）和巢蛋白（nestin，一种在神经干细胞/前体细胞NSPCs中表达的中间丝蛋白）（图1A）。此外，SVZ来源的神经球尺寸大于DG来源的神经球（图1A）。重要的是，在诱导分化条件下，SVZ和DG来源的NSPCs会从神经球中迁移出来，形成假单层细胞结构（图1B）。
为了评估细胞的自我更新能力，基于Sox2和nestin的表达情况进行细胞对检测，这两种标志物在启动分化过程的分裂细胞中趋于消失，同时结合神经元谱系标志物DCX进行分析。在两个神经发生区域中，均可观察到Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/-的对称分裂（自我更新）（图2A1,B1）、Sox2-/+/nestin-/+/DCX+/-的不对称分裂（图2A1,B2）以及Sox2-/-/nestin-/-/DCX+/+的对称分裂（分化）（图2A2,B1）。
传代神经球可增加神经干细胞/前体细胞（NSPCs）的产量；然而，随着传代次数的增加，体外培养第2天（DIV2）的细胞死亡率发生变化。事实上，SVZ来源的细胞中PI阳性细胞百分比随传代次数增加而升高（P0：15.6% ± 1.2% vs P1：19.2% ± 2.7% vs P2：32.35% ± 0.14% vs P3：39.6% ± 4.0%），DG来源的细胞也呈现类似趋势（P0：16.31% ± 0.95% vs P1：32.1% ± 1.7% vs P2：27.42% vs P3：32.2% ± 3.1%）（图3）。
神经突起的形成可在SVZ和DG神经干细胞/前体细胞分化初期进行评估：分化第1天（DIV1）（图4A,D）、分化第2天（DIV2）（图4B,E）和分化第3天（DIV3）（图4C,F）。事实上，如图4所示，随着分化过程的进行，神经突的长度和分支数量逐渐增加。
可通过侧脑室下区（SVZ）和齿状回（DG）来源的神经球评估细胞增殖。比较SVZ（图5A1）和DG（图5A2）在体外培养第1天（DIV1）的原代分化神经球，SVZ中BrdU阳性细胞的比例高于DG（SVZ：6.15% ± 0.64% vs DG：3.27% ± 0.13%；p &lt; 0.05；n = 4；图5A3）。此外，还可通过将BrdU染色与成熟标志物（如神经元核抗原NeuN）结合，来评估细胞分化，后者用于鉴定成熟神经元（图5B1,B2）。图5B3显示，SVZ和DG中增殖前体细胞分化为成熟神经元的比例相似（SVZ：12.04% ± 1.58% vs DG：13.56% ± 0.48%；p &gt; 0.05；n = 4）。
可通过神经球分析法（NSA）评估不同分化天数（DIV2 和 DIV7）时多种标志物的表达情况，从而检测源自侧脑室下区（SVZ）和齿状回（DG）的神经干细胞/前体细胞（NSPCs）的干性和多能性。事实上，两种神经发生区域均存在神经干细胞（NSCs，即巢蛋白（nestin）与胶质纤维酸性蛋白[GFAP]双阳性细胞）（图6A,G）。这些细胞能够分化为未成熟神经元（DCX阳性细胞）（图6B,H）、成熟神经元（NeuN阳性细胞）（图6F,L）、少突胶质前体细胞（神经胶质抗原2[NG2]与血小板源性生长因子受体α[PDGFRα]阳性细胞）（图6C,I）、成熟少突胶质细胞（髓鞘碱性蛋白[MBP]阳性细胞）（图6E,K）以及星形胶质细胞（GFAP阳性细胞）（图6D,J）。
在不同分化条件下，可使用不同的基质材料包被盖玻片，以形成细胞的假单层。如补充图1所示，当盖玻片额外包被层粘连蛋白（laminin）与多聚赖氨酸（PLO）或聚-D-赖氨酸（PDL）联合使用时，齿状回（DG）细胞的迁移程度高于仅使用PDL的情况（补充图1B−H）。事实上，当PDL与层粘连蛋白共同作为基质材料时（补充图1C,G），DG细胞形成的假单层融合性优于仅使用PDL的侧脑室下区（SVZ）细胞（补充图1A,E）。
重要的是，这些结果证明了神经球分析法（NSA）在评估源自两个主要神经发生微环境的神经干细胞（NSC）的干性和多能性特性方面的潜力。
<img alt="SVZ 和 DG 细胞培养物经 Hoechst/SOX2/Nestin 染色；显微观察，神经发生研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：源自侧脑室下区和齿状回的神经前体细胞在神经球或拟单层形式下的培养。 （A）SVZ 和 DG 来源的神经球的代表性明场（A1, A3）和荧光图像（A2, A4），其中细胞核用 Hoechst 33342（蓝色）染色，神经干细胞标记物 Sox2（绿色）和 nestin（红色）进行免疫荧光染色。 （B）在诱导分化条件下，由 SVZ 和 DG 来源的神经球形成的拟单层细胞的代表性明场图像。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜，神经分化，Sox2 DCX，免疫荧光分析，SVZ，DG细胞。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：细胞对检测。源自前体细胞分裂的细胞对的代表性荧光图像。 SVZ和DG细胞核用Hoechst 33342染色（蓝色），Sox2（红色）和nestin（白色）标记类干细胞，DCX（绿色）标记未成熟神经元。图A1和B1中的箭头指示Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/-对称性自我更新分裂，图A1和B2中的箭头指示Sox2+/-/nestin+/-/DCX-/+不对称分裂，图A2和B1中的虚线箭头显示Sox2-/-/nestin-/-/DCX+/+对称性分化分裂。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="显示 SVZ 和 DG 在 P0-P3 阶段 PI 阳性细胞百分比的柱状图，表示细胞存活率。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 3"> 
图 3：细胞传代过程中的细胞存活分析。 对 SVZ 和 DG 来源的分化神经球培养物在 DIV2 阶段经 0、1、2 和 3 次传代（P0−P3）后 PI 阳性细胞的定量分析。数据以均值 ± 标准误表示，n = 1−8。PI = 碘化丙啶。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经元发育显微观察，Hoechst Tuj1染色，DIV1-3，SVZ DG区域，细胞荧光。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4：DIV 1、2和3时的神经突起形成分析。 通过βIII-微管蛋白信号鉴定的SVZ和DG神经元在(A,D) DIV1、(B,E) DIV2和(C,F) DIV3时的代表性共聚焦荧光图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞免疫荧光显微镜；BrdU标记；SVZ与DG比较；神经元细胞分析；柱状图结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：细胞增殖检测。 DIV1时SVZ（A1）和DG（A2）中BrdU阳性细胞的代表性共聚焦图像。（A3）DG和SVZ来源的分化神经球培养物在DIV1时BrdU阳性细胞的定量分析。数据以均值±标准误表示，n = 4。*p &lt; 0.05，经t检验。DIV7时SVZ（B1）和DG（B2）中BrdU和NeuN双阳性细胞的代表性荧光图像。箭头指示BrdU阴性/NeuN阳性的细胞。（B3）两种微环境中DIV7时BrdU阴性/NeuN阳性细胞的定量分析。数据以均值±标准误表示，n = 4。BrdU：5-溴-2'-脱氧尿苷，一种合成的胸苷类似物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经细胞免疫荧光，DIV2 与 DIV7，Hoechst 染色，GFAP、Nestin、DCX 标记物，共聚焦显微镜。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 6"> 
图6：SVZ和DG来源的分化神经球培养物中存在的神经细胞类型。 SVZ和DG来源的细胞在神经球分化2天和7天后（DIV2和DIV7）的代表性荧光图像，细胞核用Hoechst 33342染色（蓝色），并分别标记：（A,G）神经干细胞的GFAP（绿色）和nestin（红色），（B,H）未成熟神经元的DCX（绿色），（C,I）少突胶质前体细胞的PDGFRα（绿色）和NG2（红色），（D,J）星形胶质细胞的GFAP（绿色），（E,K）成熟少突胶质细胞的MBP（绿色），以及（F,L）成熟神经元的NeuN（红色）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Hoechst 染色细胞的显微分析；10倍/40倍放大；不同基质的影响。" src="/files/ftp_upload/60822/60822suppfig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Supplementary Figure 1"> 
补充图1：测试不同基质对神经球黏附和迁移形成假单层的影响。 分别使用聚-D-赖氨酸作为基质的SVZ来源假单层（A,E）、使用聚-D-赖氨酸作为基质的DG来源假单层（B,F）、使用聚-D-赖氨酸联合层粘连蛋白作为基质的DG来源假单层（C,G），以及使用聚-D-赖氨酸联合聚-L-鸟氨酸作为基质的DG来源假单层（D,H）的代表性荧光图像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822suppfig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文详细描述了一种从出生后小鼠主要神经发生微环境来源的神经干细胞建立神经球培养物的实验方案。神经球可用于鉴定脑组织中的神经干细胞，从而估算前体细胞的数量。此外，这些三维结构可在诱导分化条件下接种，分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞，进而用于细胞命运的研究。

从出生后（P1–3）小鼠神经发生微环境中分离与扩增神经球

神经球实验是一种极为有用的体外技术，用于研究神经干细胞/祖细胞（NSPCs）的内在特性，包括……

神经球实验是一种有用的体外技术，可用于研究神经干细胞/前体细胞的内在特性，包括在生理和病理条件下的增殖能力、自我更新能力和多向分化潜能。由于其三维结构，该技术是研究成年神经发生的有力工具，同时也适用于培养并获得更高产量的神经干细胞/前体细胞。该神经球实验可用于研究阿尔茨海默病、帕金森病或多发性硬化症等脑部疾病。神经球也可从其他脑区或系统（如脂肪组织或肠道）中获得。我团队中的博士生 Rita Soares 将与 Filipa Ribeiro 一同演示该实验操作。为获取出生后第一天至第三天的小鼠脑组织，应握住小鼠头部基部的腹侧身体部位，使用尖头小剪刀在头部全长的皮肤正中线上做一纵行切口，以暴露颅骨。在颅骨基部做一纵向切口，并沿矢状缝以尽可能浅的角度继续剪开，避免损伤脑组织。用弯头镊子将颅骨向两侧剥离以暴露脑组织，然后将小刮匙滑入脑组织下方，切断连接在脑基底部的脑神经和血管。将脑组织放入含有抗生素的冷HBSS溶液的培养皿中，并将培养皿置于解剖显微镜下，调节至低倍镜视野。将脑组织背侧朝上放置。用镊子夹住小脑部位固定脑组织，同时用精细镊子从脑腹侧和嗅球部位去除脑膜。将脑组织翻转至腹面，剥离剩余的脑膜。然后用镊子去除小脑，并使用弯头尖镊将脑组织转移至组织切片机上的一张滤纸上，滤纸孔径为11微米。对于SVZ和DG的显微解剖，首先将脑组织切成450微米厚的冠状切片。在解剖显微镜下，使用湿的切片板将切好的脑组织收集到一个新的、盛有冷的含抗生素的HBSS的培养皿中，并用镊子从前向后分离冠状切片，直至获得含有侧脑室的切片。用精细镊子剪除侧脑室侧壁周围的一层薄组织，避免损伤纹状体实质和胼胝体；将镊子的一端置于胼胝体正下方，另一端插入侧脑室腹侧区域紧邻的组织中，以分离室下区（SVZ）。在侧脑室周围剪取一小条组织，将分离的组织收集至含有添加物的HBSS溶液的样品管中。当所有切片均用镊子完成显微解剖并到达海马结构时，弃去第一张其中齿状回（DG）仍无法辨认的含海马切片。为分离齿状回，首先将海马从切片中分离出来，并重新对焦显微镜以观察齿状回周围的边界。为收获齿状回，使用镊子在齿状回与CA1区之间进行切割，随后在齿状回与CA3区之间做垂直切割。然后去除穹窿及任何邻近组织，将收获的组织放入另一管含有抗生素的HBSS溶液中。为了分离SVZ和DG样本，向每管中加入0.05%胰蛋白酶-EDTA，使其在HBSS中的终浓度为5-10%，于37°C孵育约50分钟。使用过多胰蛋白酶或孵育时间过长可能导致细胞死亡增加，对细胞生长产生负面影响。当组织发生聚集时，用1毫升新鲜添加的HBSS进行连续四次洗涤，每次更换酶溶液。最后一次洗涤后，将消化后的组织重悬于1毫升无血清培养基中，每管加入终浓度为10纳克/毫升的表皮生长因子和5纳克/毫升的基础成纤维细胞生长因子。然后使用P1000移液器轻柔吹打7至10次，机械性解离组织，直至获得均一的细胞悬液。为确定解离后的DG或SVG细胞密度，使用血细胞计数板对每份细胞悬液进行细胞计数。为了将细胞扩增为神经球，需将单细胞悬液以每毫升2×10⁴个细胞的密度接种于添加了生长因子的无血清培养基中，并将5毫升细胞悬液接种至未包被的直径60毫米的培养皿中。随后，将侧脑室下区（SVZ）细胞在37°C培养6至8天，齿状回（DG）细胞在37°C培养10至12天，以形成初级神经球。当大多数神经球直径达到150至200 µm时，收集培养物中的细胞悬液，并通过离心法收集神经球。根据制造商说明书，使用小鼠化学解离试剂盒重悬神经球沉淀，然后通过另一次离心收集细胞。弃去上清液，加入1毫升添加生长因子的无血清培养基，轻柔吹打沉淀约10次。按照示范方法计数解离后的神经细胞，并将细胞以每毫升2×10⁴个细胞的密度重新接种至含有生长因子的无血清培养基中，置于新的60毫米培养皿中。然后将细胞放回细胞培养孵育箱中，继续培养六至八天或十至十二天，具体时间根据需要而定，以获得次级神经球。通过神经球实验获得的侧脑室下区（SVG）和齿状回（DG）神经球由未分化的Sox2阳性、巢蛋白（nestin）阳性细胞组成。值得注意的是，源自侧脑室下区（SVG）的神经球尺寸大于齿状回（DG）来源的神经球。重要的是，在分化条件下，来自侧脑室下区（SVG）和齿状回（DG）的神经干细胞/前体细胞会从神经球中迁移出来，形成一层假单层细胞。在两个神经发生区域中，均可观察到Sox2双阳性、nestin双阳性以及doublecortin双阴性的成对细胞，这些成对细胞对应于提示自我更新的对称性分裂。还可见一种成对细胞，其中一个细胞为Sox2阳性、nestin阳性且doublecortin阴性，而另一个细胞为Sox2阴性、nestin阴性且doublecortin阳性，代表不对称分裂。而Sox2双阴性、nestin双阴性以及doublecortin双阳性细胞对，对应于提示分化的对称性分裂。总体而言，传代改变了体外培养第二天的细胞死亡率。在SVG和DG神经干细胞/前体细胞分化初期获得的神经元中，可评估其神经突起的形成。如所观察到的，随着分化过程的进行，神经突的长度和分支程度均有所增加。与齿状回（DG）相比，侧脑室下区（SVG）中增殖细胞的比例较高。尽管在这两个神经发生微环境中，分化为成熟神经元的增殖前体细胞比例相似。这两种细胞类型均能够分化为未成熟神经元、成熟神经元、少突胶质细胞前体细胞、成熟少突胶质细胞以及星形胶质细胞。获得神经球后，可采用多种方法（包括免疫细胞化学、钙成像、蛋白质印迹和逆转录聚合酶链式反应）来研究神经干细胞/前体细胞的干性及其多向分化潜能。神经球实验可用于基因和疾病模型，以进一步评估参与神经干细胞/前体细胞增殖与分化过程的分子和细胞机制。

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