产后神经球的分离和扩张 （P1+3） 小鼠神经原性球
May 23rd, 2020
在本文中，我们详细描述了从主要小鼠神经原性利基中提取的产后小鼠神经干细胞生成神经球培养的一个协议。神经球用于识别脑组织的神经干细胞，从而估计前体细胞数。此外，这些3D结构可以在不同的条件下镀，产生神经元，寡核细胞和星形细胞，允许细胞命运的研究。
神经球测定是有用的体外技术，用于研究神经干细胞/祖细胞的固有特性，包括在生理和病理环境中的增殖、自我更新和多能性。由于其三维结构，该技术是研究成人神经生成的有力工具。它也可用于培养和获得更高的神经干/祖细胞的产量。
这种神经球测定可以应用于研究脑部疾病，如阿尔茨海默氏症和帕金森氏症或多发性硬化症。神经球也可以从其他大脑区域或系统获得，如脂肪组织或肠道。与菲利帕·里贝罗一起演示这个程序的将是丽塔·苏亚雷斯，我小组中的博士生。
要收获产后一到三只老鼠的大脑，将身体的腹室部分放在头部底部，用小尖剪刀在头部的整个长度的皮肤上做中线切口，以暴露头骨。在头骨底部进行纵向切口，并继续沿着下垂缝合线尽可能浅的角度切割，以避免损害大脑结构。使用弯曲的钳子将头骨剥到两侧，露出大脑，在大脑下面滑动一把小铲子，切开与大脑底部相连的颅神经和血管。
将大脑放入用抗生素补充的冷HSS培养皿中，并在低放大率下将该盘置于解剖显微镜下。将大脑放在其后面上。在用小脑握住大脑时，使用细钳从大脑的腹侧和嗅觉球中去除脑膜。
将大脑旋转到腹边，剥离其余的脑筋。然后使用钳子去除小脑，并使用弯曲的尖钳将大脑转移到一块过滤纸上，在组织切碎器上带有 11 微米的孔隙。对于 SVZ 和 DG 微切除，首先将大脑切成 450 微米的冠状部分。
使用湿的层状将分段的大脑收集到新的培养皿中，在解剖显微镜下充满感冒抗生素补充的HPSS，并使用钳子以前至后的方式分离日冕切片，直到达到侧心室切片。使用细钳切割心室横向壁周围的组织的薄层，不包括石柱和组体乳浆，并立即将钳子的一端放在组体称物下，另一个尖端直接放在与横向心室相邻的组织中，以隔离 SVZ。切开一小排围绕横向心室的组织，将解剖组织收集到含有补充的HSS溶液的样品管中。
当所有切片都用钳子微分，海马形成已经达到时，丢弃第一片带海马的切片，其中DG仍然无法辨认。要去除 DG，请首先将海马体从切片中分离，然后重新聚焦显微镜，以可视化 DG 周围的边框。要收获 DG，请使用钳子在 DG 和 CA1 区域之间进行切割，然后在 DG 和 CA3 区域之间进行垂直切割。然后取出纤维和任何相邻组织，将收获的组织放入单独的抗生素补充HSS溶液管中。
要分离SVZ和DG样品，将 Trypsin-EDTA 0.05%添加到 HBSS 中 5-10% 的最终浓度中，每个管在 37 摄氏度下孵育约 50 分钟。整个使用三头肌或太长的潜伏时间可导致细胞死亡增加，对细胞生长产生负面影响。当组织聚集在一起时，将酶溶液连续四次洗涤，每次洗涤用一毫升新鲜补充的HSSS。
上次洗涤后，将消化的组织重新用一毫升无血清介质中重新填充，每毫升表皮生长因子补充 10 毫微克，每毫升每管基本成纤维细胞生长因子 5 毫微克。然后用P1000移液器用轻轻移液7至10次机械分离组织，直到获得均匀细胞溶液。要确定分离的 DG 或 SVG 细胞的密度，请计算血细胞计上每个悬浮液中的细胞。
为了将细胞扩展到神经球中，在无血清介质中以每毫升密度2倍至第4个细胞稀释单个细胞群，并辅以生长因子，将细胞悬浮液的五毫升种子播种成未涂覆的60毫米直径的培养皿。然后在37摄氏度下孵育SVZ细胞6至8天，DG细胞孵育10至12天，形成原发性神经球。当大多数神经球的直径为 150 到 200 微米时，从培养物中收集细胞悬浮液，通过离心收集神经球。
在收集另一个离心细胞之前，根据制造商的说明，使用小鼠化学分离套件重新暂停神经球托盘。用一毫升无血清介质代替上流剂，并辅以生长因子，并轻轻尝试对颗粒进行约10次的速率。计算分离的神经细胞作为证明，并在无血清介质中以每毫升密度的2倍10至第四细胞重新播种，并辅以生长因子，进入新的60毫升培养皿中。
然后将细胞返回到细胞培养箱，酌情增加6至8天或10至12天，以获得继发性神经球。使用神经球测定获得的SVG和DG神经球由未分化的Sox2阳性、巢内阳性细胞组成。值得注意的是，SVG衍生神经球的尺寸比DG的尺寸更大。
重要的是，在分化条件下，SVG和DG衍生神经干细胞/祖细胞从神经球中迁移出来，形成细胞的伪单层。在这两个神经原产区，可以观察到Sox2双阳性、巢状双阳性、双皮质双负细胞对的存在，这些细胞对对应于指示自我更新的对称分裂。细胞对中，一个Sox2的细胞为阳性，巢状阳性，双皮质为阴性，另一个细胞Sox2为阴性，内斯汀阴性，双皮质蛋白为阳性，表现出不对称的分裂。
和Sox2双负，巢双负，双皮质双正细胞对对应对称分裂指示分化。总体而言，传世在体外第二天改变细胞死亡率。在分化开始时，从SVG和DG神经干/祖细胞的分化中获得的神经元中可以评估中性生成。
正如所观察到的，中性细胞的长度和漫压随分化而增加。与DG相比，在SVG中观察到高比例的增殖细胞。虽然增殖的祖源的百分比，区分成成熟的神经元是相似的两个神经源利基。这两种细胞类型也能够分化成不成熟的神经元、成熟的中子、橄榄细胞前体细胞、成熟的寡头细胞和星状细胞。
获得神经球后，可以执行多种方法，包括免疫细胞化学、钙成像、西印和RT-PCR，以研究神经干细胞/祖细胞的茎和多能性。神经球测定可以应用于遗传和疾病模型，以进一步评估分子和细胞过程涉及神经干细胞/祖细胞的增殖和分化。
概览
本研究详细描述了一种从新生小鼠神经干细胞生成神经球培养物的协议，这些神经干细胞来源于主要的神经发生部位。它探讨了使用神经球来识别和估计神经干细胞种群，同时促进其分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞以进行细胞命运研究。
研究的关键组成部分
科学领域
- 神经科学
- 干细胞生物学
- 细胞培养技术
背景
- 神经球检测允许对神经干/前体细胞进行体外检查。
- 它是研究成年神经发生和识别细胞类型的一个强大模型。
- 这种技术可以产生更多的神经干/前体细胞。
- 应用扩展到研究阿尔茨海默病和帕金森病等神经系统疾病。
研究目的
- 建立一个详细的神经球生成协议。
- 表征3D培养系统中神经干细胞的特性。
- 促进分化为分析的关键神经细胞类型。
使用的方法
- 本研究主要利用神经球检测进行细胞培养。
- 生物模型涉及从新生小鼠大脑中分离神经干细胞。
- 关键程序步骤包括解剖、酶解和培养条件。
- 神经球的形成在6-12天的时间内发生，取决于细胞类型。
- 细胞被扩增并基于标记如Sox2和nestin进行表征。
主要结果
- 在特定的培养条件下，神经球显示未分化、多能的特性。
- 来自脑室下区（SVZ）的神经球比来自齿状回（DG）的神经球更大。
- 细胞活力和生长受处理程序和解离时间的影响。
- 该研究为未来关于神经干细胞的分化研究奠定了基础。
结论
- 这种方法增强了对神经干细胞行为和分化的理解。
- 获得的见解可以帮助我们理解神经发生过程和潜在的治疗应用。
- 它为研究导致神经系统疾病的机制提供了宝贵的启示。
常见问题
Executive Industry Relevance
The neurosphere assay enables scalable in vitro modeling of neural stem/progenitor cell (NSPC) behavior, supporting target validation in neurodegenerative disease research. By providing a renewable source of multipotent cells from defined neurogenic niches, the method reduces reliance on primary tissue and enhances reproducibility in early discovery workflows. This positions the assay as a mechanistic de-risking tool for evaluating intrinsic and extrinsic factors influencing NSPC proliferation, differentiation, and lineage commitment in preclinical target assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by assessing NSPC self-renewal and multipotency under controlled conditions.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantifiable readouts of proliferation and differentiation potential.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by generating dose-response data on intrinsic or extrinsic modulators of stem cell fate.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, suspension-based NSPC cultures suitable for high-content imaging and biomarker screening.
- Operational Value: Enables assay standardization via defined growth factor conditions and passaging protocols.
- Scalability: Supports expansion of SVZ- and DG-derived neurospheres for reproducible compound testing across wells and plates.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Differentiated neurosphere-derived pseudomonolayers allow study of neuritogenesis and lineage-specific maturation relevant to disease models.
- Mechanistic De-risking: Enables evaluation of symmetrical and asymmetrical division patterns as indicators of stem cell fate decisions.
- Disease Model Compatibility: Compatible with genetic and disease models to assess molecular pathways in NSPC proliferation and differentiation.
Pipeline & Workflow Integration
The neurosphere assay fits within the discovery continuum from target validation to preclinical evaluation, enabling iterative assessment of NSPC behavior before lead optimization.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional validation of targets regulating stem cell maintenance and differentiation.
- Screening: Delivers quantitative, suspension-based cultures amenable to automated imaging and multiparametric readouts.
- Analytics: Generates measurable outputs including sphere diameter, marker expression (Sox2, nestin, doublecortin), and differentiation efficiency.
- Translational Research: Connects in vitro stem cell behavior to preclinical continuity through lineage-specific differentiation into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for NSPC expansion and characterization across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in stem cell regulation.
- Operational Value: Delivers standardization, reproducibility, and scalability in NSPC culture and passaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of target effects on stem cell proliferation and differentiation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization through quantifiable, lineage-resolved stem cell phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neural tissue microdissection and aseptic cell culture techniques.
- Depends on access to dissection microscopes, tissue choppers, and CO2 incubators with precise temperature control.
- Necessitates standardized enzymatic dissociation protocols to minimize variability and cell death.
- Requires adaptation of growth factor concentrations and culture duration based on regional NSPC source (SVZ vs DG).
- Limited by the need for careful monitoring of neurosphere size and passaging timing to avoid spontaneous differentiation or overgrowth.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:59
Postnatal Day 1-3 (P1-3) Mouse Brain Harvest
2:28
Subventricular Zone (SVZ)/Dentate Gyrus (DG) Microdissections
4:22
Tissue Dissociation
5:27
Postnatal Neural Stem Cell Expansion
6:09
Neurosphere Passaging
7:10
Results: Representative Neurosphere Expansion and Characterization
9:21
Conclusion
