使用PRESTO-Tango检测技术在全GPCR范围内并行检测β-阻遏蛋白2招募以进行配体筛选
2020年3月10日
鉴于G蛋白偶联受体（GPCRs）是极具潜力的药物靶点，因此GPCR配体筛选对于发现先导化合物以及开展孤儿受体去孤儿化研究至关重要。为此，我们介绍了PRESTO-Tango，这是一个开源资源平台，利用基于TEV的报告基因检测方法，可同时对近300种GPCR上β-阻遏蛋白2（β-arrestin2）的瞬时招募进行分析。
Presto-Tango 平台旨在对人类基因组中所有非嗅觉 G 蛋白偶联受体（GPCR）进行并行且同步的检测，包括针对孤儿受体进行配体诱导的 β-抑制蛋白 2 招募分析。Presto-Tango 平台是目前唯一一个开源资源，可采用G蛋白非依赖性的β-抑制蛋白招募检测方法，以并行方式对整个GPCR基因组进行分析。本次演示将由本实验室的研究助理 Genevieve Laroche 和博士生 Manel Zighal 完成。
开始实验前，向适当数量的384孔光学底板的每个孔中加入20微升浓度为25微克/毫升的多聚-L-赖氨酸溶液，在室温下孵育30分钟至2小时。孵育结束后，将板子在水槽上方轻轻振荡以去除多余的多聚-L-赖氨酸，然后向每孔加入40微升抗生素-抗真菌素溶液。随后，将用于接种细胞的板子置于37摄氏度孵育，其余板子则存放于4摄氏度以长期保存。
为了进行初筛，接种HTLA细胞时，先用10毫升PBS轻轻冲洗汇合的150毫米细胞培养皿，然后每皿加入6毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA进行处理。待细胞脱落后，将细胞悬液收集至含有等体积DMEM的50毫升锥形管中，并通过离心收集细胞。
将沉淀重悬于DMEM中，浓度为每毫升2.2 × 10⁵个细胞，然后在水槽上方轻敲培养板以去除抗生素-抗真菌溶液。轻拍培养板使其干燥，并向每孔接种45 µL细胞。随后将培养板置于37 °C、45% CO₂条件下过夜培养。
为转染制备384孔DNA来源板，将每种编码目标GPRC Tango构建体的质粒互补DNA以50纳克/毫升的浓度溶于0.1X Tris-EDTA缓冲液中，每孔加入96孔板的一个孔内。使用多通道移液器，按照图示，将96孔板中每个孔的10微升DNA溶液手动转移至一个384孔DNA来源板的四个重复孔中，每个条件均如此操作。接着，向DNA来源板的每孔中加入40微升0.313摩尔/升的氯化钙溶液，并轻轻混匀各孔内容物。
向384孔DNA来源板的每孔中加入50微升2x HEPES缓冲液，并轻轻混匀。一分钟后，将10微升DNA转染混合物从384孔DNA来源板转移至已接种HTLA细胞的每孔中，并将细胞在细胞培养孵育箱中过夜孵育。次日，倾去转染后的细胞培养基，缓慢向每孔加入40微升饥饿培养基，注意不要直接接触细胞。
然后向不含化合物的交替行中加入20 µL溶剂缓冲液，同时向其他交替行中加入20 µL浓度为三倍的目标化合物，加样完成后将培养板放回细胞培养箱中。转染刺激后16至24小时，倾去转染细胞的培养基，每孔加入20 µL freshly prepared glow reagent，在室温避光条件下孵育5至20分钟。随后使用微孔板化学发光检测仪进行读板，每孔积分时间为1秒。
进行二次筛选时，将HTLA细胞以每皿5 × 10⁶个细胞的总密度接种于含11 mL完全培养基的100 mm培养皿中，在37°C培养24小时。次日，将10 µg GPCR互补DNA与500 µL Tris-EDTA氯化钙溶液混合，涡旋振荡，随后加入500 µL HEPES缓冲液。剧烈振荡后，室温孵育1分钟，立即将1 mL该溶液逐滴加入细胞中。
轻轻摇动以均匀分布沉淀物，并将培养板置于 37°C 下孵育 24 小时。次日，在荧光细胞成像仪下检测转染效率。转染效率超过 50% 覆盖率者为理想结果。
用 Versene 溶液轻轻冲洗转染后的细胞，然后加入 3 毫升 0.05% 胰蛋白酶 EDTA 溶液使细胞脱离。通过离心收集解离的细胞，并将细胞沉淀重悬于饥饿培养基中，浓度为每毫升 4 × 10⁵ 个细胞。随后将 45 微升细胞悬液接种至多聚-L-赖氨酸包被的 384 孔板的每个孔中，并将该板置于细胞培养孵箱中孵育至少 4 小时。
为制备半对数剂量-反应曲线板，向96孔板除最后一行外的所有孔中加入270微升添加了HEPES及抗生素-抗真菌剂的HBSS，并向H行各孔中分别加入30微升高浓度和低浓度药物溶液。将H行各孔中的溶液经混匀后转移至G行对应孔中，并依次进行系列稀释，直至达到板的最后一行。参照示意图，将96孔板A至G行低浓度列的20微升稀释液以及96孔板B至H行高浓度列的20微升稀释液，分别加入已预先铺好的384孔板的对应孔中。随后将该板在37°C下孵育至少16小时。
刺激后16至24小时，弃去转染细胞的培养基，每孔加入20 µL荧光试剂，避光孵育5至20分钟，随后使用微孔板发光检测仪进行读数，每孔积分时间为1秒。在此项代表性实验中，在初筛阶段检测的168种G蛋白偶联受体中，仅有多巴胺受体D3和视蛋白5为潜在的活性靶点候选者。其中，多巴胺受体D3产生的log2倍数变化显著，达4.7；而视蛋白5的响应略低，为2.39。
相比之下，多巴胺受体D2作为初筛的阳性对照，其log2倍数变化为4.58。二次筛选中的这些反应曲线表明，染色质颗粒提取物在半数最大有效浓度值上产生的信号窗口与喹匹罗相似，证实其在多巴胺受体D3上具有活性，属于有效命中。然而，对于opsin 5，其剂量-反应曲线呈平坦状，与阴性对照相似，因此排除该受体作为染色质颗粒提取物的潜在靶点。Presto-Tango实验需格外谨慎，因为细胞分布、转染效率以及药物系列稀释过程中的变异性可能导致误差累积，从而影响数据的准确性。
可采用正交方法进一步验证和表征配体-受体相互作用，这些方法包括放射性配体结合实验、生物发光共振能量转移以及环磷酸腺苷、钙离子和内化功能检测。
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概述
Presto-Tango 平台是一个开源资源，旨在对人类基因组中的非嗅觉 G 蛋白偶联受体（GPCR）进行同步分析。该平台采用一种不依赖 G 蛋白的检测方法，能够评估配体诱导的 β-arrestin 2 招募作用，包括孤儿受体靶点。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 药理学
- 细胞生物学
背景
- G蛋白偶联受体（GPCRs）是药理学中重要的可成药靶点。
- 理解配体与G蛋白偶联受体（GPCRs）的相互作用对药物发现至关重要。
- β-抑制蛋白（beta-arrestin）的募集是G蛋白偶联受体（GPCR）激活的关键指标。
- Presto-Tango平台可用于G蛋白偶联受体（GPCRs）的高通量筛选。
研究目的
- 提供一种针对 G 蛋白偶联受体（GPCRs）的全面分析工具。
- 促进药物发现过程中先导化合物的鉴定。
- 支持 G 蛋白偶联受体（GPCRs）的去孤儿化研究。
使用的方法
- 基于TEV的β-抑制蛋白2（beta-arrestin 2）招募报告基因检测法。
- 并行检测约300种G蛋白偶联受体（GPCR）。
- 在实验板中使用多聚-L-赖氨酸（poly-L-lysine）促进细胞黏附。
- 培养并准备用于接种细胞的培养板。
主要结果
- 成功分析配体诱导的β-arrestin 2招募效应。
- 实验室成员展示了该平台的技术能力。
- 建立了可用于未来GPCR研究的资源库。
- 开源共享提高了研究人员的可及性。
结论
- Presto-Tango 平台是 GPCR 研究中的一个重要工具。
- 它支持高通量筛选和药物发现工作。
- 未来的研究可利用该平台开展多种与 GPCR 相关的探索。
常见问题
行业重要性概述
PRESTO-Tango 检测技术利用不依赖G蛋白的β-arrestin2招募读数方法，实现对人类非嗅觉G蛋白偶联受体组（GPCR-ome）的并行高通量功能分析，填补了功能选择性筛选领域的一项关键空白。该方法可对约300种非嗅觉G蛋白偶联受体（包括孤儿靶点）提供定量且可重复的实验数据，有助于在药物发现流程中及早降低治疗假设的风险，推动先导化合物的识别及研发管线中项目的优先排序。
生物制药研发中的策略性应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够对配体诱导的β-arrestin2募集进行功能检测，从而在不依赖G蛋白信号传导的情况下评估GPCR的激活状态。
- 操作价值：支持对孤儿和非孤儿GPCR进行并行分析，以大规模去孤儿化靶点并验证治疗假设。
- 预测价值：生成剂量-反应和log2倍数变化数据，可在下游验证前以机制层面的可信度优先筛选候选分子。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：提供基于发光的可靠检测信号，适用于针对G蛋白偶联受体（GPCR）靶点的化合物库初筛。
- 操作价值：采用多聚-L-赖氨酸包被的培养板和可控转染条件，标准化检测流程，以最小化孔间变异。
- 可扩展性：支持在384孔板上进行筛选，结合四重重复的DNA来源及连续稀释工作流程，用于阳性结果的确认。
转化与临床前研究
- 转化连续性：提供配体-受体相互作用的机制性见解，有助于指导临床前模型的选择和生物标志物的匹配。
- 风险降低：实现对筛选命中物（例如多巴胺D3受体与视蛋白5）的正交验证，以减少先导化合物优化中的假阳性结果。
- 通路解析：区分G蛋白非依赖性信号通路与经典通路，支持在早期发现阶段进行机制性风险排除。
流程与工作流整合
该检测方法适用于从靶点验证到先导化合物鉴定的整个发现过程，可在进行临床前投入之前实现基于假设的筛选和阳性结果确认。
- 发现生物学：检测配体诱导的 β-arrestin2 招募，以阐明 GPCR 功能及通路偏向性。
- 筛选：提供定量的发光读数，用于高通量化合物筛选，并包含明确的刺激和试剂孵育步骤。
- 分析：生成 log2 倍数变化和剂量-反应数据，用于比较不同靶点间配体的效能与效价。
- 转化研究：通过二次筛选和剂量曲线验证支持苗头化合物的确证，推动高置信度先导化合物的开发。
- 企业级复用：作为可重复使用、开源的平台，支持跨项目开展多次 GPCR 筛选研究。
运营与企业影响
- 科学价值：通过将 β-arrestin2 招募作为功能性检测指标，减少机制上的不确定性。
- 操作价值：通过标准化的细胞接种、转染和试剂添加流程，提高实验的可重复性。
- 战略价值：提供在整个 GPCR 组中的早期效能和选择性数据，从而优化“推进/终止”决策。
- 项目组合影响：基于定量筛选结果，实现对靶点和配体的风险调整后优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备细胞培养、转染及发光检测操作方面的专业知识。
- 依赖于支持每孔秒级积分和兼容发光试剂的384孔板读板仪。
- 需标准化DNA转染效率和化合物稀释准确性，以尽量减少实验变异性。
- 在不同G蛋白偶联受体（GPCR）间的应用可能需要优化表达载体和培养条件。
- 局限性包括因细胞分布不均或连续稀释不一致所导致的误差累积风险。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:43
Primary Screening: Poly-L-Lysine Plate Preparation
1:25
Primary Screening: Cell Culture and Plate Seeding
2:22
Primary Screening: DNA Plate Preparation and Transfections
3:35
Primary Screening: Cell Stimulation and Luminescence Reading
4:26
Secondary Screening: Cell Seeding and Transfections
5:59
Secondary Screening: Half Log Dose-Curve Drug Plate Preparation and Luminescence Reading
7:16
Results: Representative Primary Screening Hit Identification and Secondary Screening Dose-Curve Responses
8:23
Conclusion
