Name: 使用小毛针（sh）RNA在C2C12霉细胞细胞系中编码细胞外基质蛋白的基因稳定击倒 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 学习使用shRNA在C2C12肌母细胞中稳定敲低编码细胞外基质蛋白的基因，以ADAMTSL2为案例研究，验证mRNA、蛋白及细胞水平的敲低效率，助力肌肉分化与再生研究。

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D.H. 获得美国国立卫生研究院（关节炎与肌肉骨骼和皮肤病研究所，NIAMS，资助号 AR070748）以及西奈山医学院 Leni &amp;#38; Peter W. May 骨科系种子基金的资助。

1. 准备shRNA质粒DNA 大肠杆菌
<ol>
	<li>生成携带 shRNA 质粒的克隆细菌菌落
	<ol>
		<li>从商业来源获取携带靶向特异性 shRNA 质粒及对照质粒的 E. coli 甘油菌种（材料表）。 
		注：使用了三种不同的 shRNA 质粒，分别靶向小鼠 Adamtsl2 mRNA 的不同区域。其中一种 shRNA 被设计用于靶向 Adamtsl2 的 3'-非翻译区（3'UTR），以便利用编码重组全长 ADAMTSL2 或单个 ADAMTSL2 蛋白结构域的表达质粒进行挽救实验。此外，还包含一个随机序列 shRNA 质粒作为阴性对照。shRNA 序列的详细信息见图 1A。</li>
		<li>在室温（RT）下解冻 shRNA 细菌甘油菌种。取 10 µL 甘油菌液转移至添加了 100 µg/mL 氨苄青霉素的 Luria-Bertani（LB）琼脂平板（LB-Amp）上。 
		注：LB-Amp 平板的制备方法为：将 1 L LB 培养基（每升含 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物、10 g NaCl，调节 pH 至 7.0）与 12 g 琼脂一同高压灭菌。待培养基冷却至约 50 °C 时，加入氨苄青霉素（储存液：50 mg/mL 溶于无菌水），使其终浓度为 100 µg/mL（LB-Amp 琼脂）。立即向每个 10 cm 培养皿中倒入约 20 mL LB-Amp 琼脂，待其凝固后使用。1 L LB-Amp 琼脂通常可制备约 40 个 10 cm 培养皿。若将含 LB-Amp 琼脂的培养皿密封后避光保存于 4 °C，可稳定至少一个月。</li>
		<li>使用无菌 Drygalski 涂布棒或其他适当方法将菌液均匀涂布，以获得单个细菌菌落。将平板倒置，在 37 °C 下过夜培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>质粒制备
	<ol>
		<li>次日早晨，取出带有单个细菌菌落的培养皿，并置于 4 °C 保存，以防止细菌菌落过度生长及卫星菌落形成。若需过夜或更长时间保存，应密封培养皿。</li>
		<li>下午时，向聚丙烯细菌培养管中加入 5 mL LB-Amp 培养基。用移液器吸头从过夜培养的培养皿中挑取单个细菌菌落，并将其接种至含有 LB-Amp 培养基的细菌培养管中，通过弹出吸头完成接种。</li>
		<li>将细菌培养物置于摇床中，在 37 °C、250 rpm 条件下过夜培养，管盖松开以保证通气。</li>
		<li>次日早晨取出细菌培养管，置于 4 °C 保存以避免细菌过度生长。下午时，通过涡旋重悬细菌，取 1 mL 过夜培养物转移至含 50 mL LB-Amp 培养基的 250 mL 锥形瓶中。继续在 37 °C、250 rpm 摇床中过夜培养。</li>
		<li>次日早晨，将细菌转移至 50 mL 一次性离心管中，在室温下以 6,000 x g 离心 15 分钟。弃去上清液，继续进行步骤 1.2.6。 
		注：若无法立即提取质粒 DNA，可在离心后弃去 LB-Amp 培养基，将细菌沉淀保存于 -20 °C。</li>
		<li>按照质粒提取试剂盒（中量级）说明书操作，从细菌中提取质粒 DNA。使用分光光度计测定 A260/A280 比值以评估质粒 DNA 的质量。 
		注：理想的 A260/A280 比值应&#62;1.8，表明质粒 DNA 提取物纯度较高。较低的 A260/A280 比值提示可能存在蛋白质污染或提取试剂去除不充分，可能需要额外的质粒纯化步骤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. C2C12 细胞的培养与转染及嘌呤霉素筛选
<ol>
	<li>C2C12 细胞培养
	<ol>
		<li>在 37 °C 水浴中快速解冻 C2C12 细胞（材料表），并将细胞倒入无菌一次性 15 mL 离心管中，管内预先加入 8 mL 含 100 单位青霉素和链霉素抗生素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）（无血清 DMEM），操作在细胞培养超净台中进行。在室温下以 160 × g 离心 3 分钟。</li>
		<li>吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 10 mL 含 10% 胎牛血清（FBS）的完全 DMEM 培养基中。将细胞转移至 10 cm 组织培养处理的塑料培养皿中。将细胞置于 37 °C、5% CO2 气氛的加湿培养箱中孵育。</li>
		<li>次日，更换为新鲜的完全 DMEM 培养基。</li>
		<li>在 3−4 个 10 cm 培养皿中扩增低代次 C2C12 细胞。当 C2C12 细胞达到 50−60% 汇合度时，吸除培养基，并用 10 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞。</li>
		<li>加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA，室温孵育 2 分钟。在显微镜下观察细胞脱落情况，必要时延长孵育时间，直至大多数细胞脱落。 
		注：轻轻敲击培养皿有助于细胞脱落。</li>
		<li>当大多数细胞脱落后，向培养皿中加入 10 mL 完全 DMEM，用移液器反复吹打数次，将细胞悬液转移至无菌一次性 15 mL 离心管中。在室温下以 160 × g 离心 3 分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 2 mL 冻存液（10% 二甲基亚砜 [DMSO]/90% FBS）中。</li>
		<li>每 10 cm 培养皿分装两份 1 mL 细胞悬液至冻存管中。将冻存管置于装有室温异丙醇的细胞冻存盒中，在 -80 °C 冰箱中至少放置 24 小时，使冷冻速率达到约 -1 °C/分钟，以避免冰晶形成。长期保存时应将细胞储存在液氮的气相中。 
		注：供应商建议 C2C12 细胞使用代次不超过 15 代。作者经验表明，较低代次的细胞向肌管分化更为一致且迅速。必须保持 C2C12 细胞在低密度（&#60;50% 汇合度）下培养，以防止过早启动分化。已分化或正在分化的 C2C12 细胞无法逆转为原始成肌细胞状态，必须弃用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>转染前 C2C12 细胞的准备
	<ol>
		<li>将未分化的 C2C12 细胞在 10 cm 培养皿中培养至 50−60% 汇合度。吸除培养基，用 10 mL PBS 冲洗细胞，加入 1 mL 0.25% 胰蛋白酶-EDTA。室温孵育 2 分钟，在显微镜下观察细胞脱落情况，必要时延长孵育时间，直至大多数细胞脱落。 
		注：轻轻敲击培养皿有助于细胞脱落。</li>
		<li>当大多数细胞脱落后，向培养皿中加入 10 mL 完全 DMEM，将细胞悬液转移至无菌一次性 15 mL 离心管中。在室温下以 160 × g 离心 3 分钟。吸除上清液，将细胞沉淀重悬于 4 mL 完全 DMEM 中。</li>
		<li>取 10 µL 细胞悬液与 10 µL 台盼蓝混合于 1.5 mL 反应管中，通过反复吹打并轻弹反应管混匀，将混合液转移至细胞计数板。使用自动细胞计数仪测定每毫升细胞数量。</li>
		<li>将 C2C12 细胞稀释至 50,000 个细胞/mL，在 6 孔板中每孔接种 100,000 个细胞（2 mL），使细胞在过夜培养后达到约 40−50% 汇合度。将细胞置于 37 °C、5% CO2 气氛的加湿培养箱中孵育。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用聚乙烯亚胺（PEI）对 C2C12 细胞进行 shRNA 质粒转染及嘌呤霉素筛选
	<ol>
		<li>PEI 储存液的配制
		<ol>
			<li>在 50 mL 带螺口盖的玻璃培养瓶中，将 16 mg PEI 溶解于 50 mL 无菌蒸馏水中（储存液浓度：0.32 mg/mL）。将溶液在 65 °C 孵育 1 小时，孵育期间多次剧烈涡旋，以确保 PEI 完全溶解。</li>
			<li>每 50 mL 溶液加入 15 µL 1N HCl，调节 pH 至 8。 
			警告：盐酸具有腐蚀性。浓盐酸应在通风橱中操作，操作人员应佩戴适当的个人防护装备。</li>
			<li>将 PEI 溶液在 -80 °C 冷冻 1 小时（瓶盖松动），然后在 37 °C 水浴中快速解冻，以进一步提高溶解度。重复冻融循环 3 次。</li>
			<li>将 PEI 储存液分装为 0.5 mL 每份，用于单次使用，并于 -20 °C 保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>C2C12 细胞的转染
		<ol>
			<li>在 1.5 mL 反应管中，将 25.5 µL PEI 储存液（8.5 µL/µg 质粒 DNA）与 100 µL 25 mM NaCl 混合，37 °C 孵育 5 分钟。另取 3 µg 质粒 DNA 与 100 µL 25 mM NaCl 混合，同样在 37 °C 孵育 5 分钟。</li>
			<li>将稀释后的 PEI 试剂全部加入稀释后的质粒溶液中，轻轻吹打混匀。37 °C 孵育 25 分钟。</li>
			<li>孵育期间，将拟转染的 C2C12 细胞培养基更换为不含 FBS 和抗生素的 DMEM。</li>
			<li>将 PEI/DNA 转染混合物逐滴加入 C2C12 细胞中，并通过轻轻移动培养皿使混合均匀。将细胞置于 37 °C、5% CO2 气氛的加湿培养箱中孵育。6 小时后，更换为完全 DMEM 培养基。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>嘌呤霉素筛选
		<ol>
			<li>转染 24 小时后，更换为筛选培养基（完全 DMEM 加 5 µg/mL 嘌呤霉素）。持续进行嘌呤霉素筛选，直至获得嘌呤霉素抗性 C2C12 细胞，通常需要 10−14 天。</li>
			<li>在低细胞密度（&#60;50−60% 汇合度）下扩增嘌呤霉素抗性 C2C12 细胞，以维持其未分化状态，并按照步骤 2.1.4−2.1.7 所述方法冻存 6−10 管用于后续实验。 
			注：常规细胞培养和扩增过程中应持续在培养基中添加 5 µg/mL 嘌呤霉素。但在分化实验中应去除嘌呤霉素。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. C2C12 分化表型分析
注意：通过调整蛋白质印迹实验中所用的特异性抗体或定量聚合酶链式反应（qPCR）分析中所用的基因特异性引物，下述方法可轻松适用于C2C12成肌细胞向肌管分化的一般表型分析。
<ol>
	<li>C2C12 细胞分化方案与明场显微镜观察
	<ol>
		<li>在12孔板中每孔接种150,000个细胞。将嘌呤霉素抗性的C2C12稳定细胞在含筛选培养基的12孔板中，于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养。使用完全DMEM培养基培养C2C12细胞，直至细胞融合度达到约95%。</li>
		<li>为诱导C2C12细胞分化，将完全DMEM更换为无血清DMEM（定义为分化的第0天）。每两天更换一次培养基，并使用带相机的倒置明场显微镜观察C2C12成肌管的形成。 
		注：许多实验方案使用含2%马血清的培养基来诱导C2C12细胞分化为成肌管。在作者的操作中，完全去除血清可达到类似效果。胰岛素被描述为可加速C2C12分化的培养基添加剂。然而，在本方案中，C2C12细胞在撤除血清后3–5天内即可稳定分化为成肌管，因此认为添加胰岛素并非必要。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肌球蛋白重链（MyHC）免疫荧光染色以可视化成肌管
	<ol>
		<li>在8孔细胞培养板中，每孔加入500 µL完全DMEM，接种50,000个嘌呤霉素抗性的C2C12细胞。在完全DMEM中培养细胞，直至融合度达到95%（约24小时）。</li>
		<li>为诱导分化，将完全DMEM更换为500 µL无血清DMEM（定义为分化的第0天）。在所需时间点，吸除培养基，并用0.5 mL PBS清洗细胞3次。 
		注：以下所有步骤均在室温（RT）下进行。</li>
		<li>用0.2 mL PBS稀释的4%多聚甲醛（PFA）固定细胞15分钟。随后用0.5 mL PBS清洗细胞3次，每次5分钟。 
		警告：PFA具有危害性。应采取适当防护措施，并将多聚甲醛溶液作为危险废物处理。</li>
		<li>用0.2 mL含0.5 M甘氨酸的PBS溶液淬灭PFA反应5分钟。再用0.5 mL PBS清洗细胞3次，每次5分钟。</li>
		<li>用0.2 mL含0.1%非离子型表面活性剂/去垢剂（材料表）的PBS溶液孵育细胞10分钟，以通透细胞膜。随后用0.2 mL含5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液封闭1小时。再用0.5 mL PBS清洗细胞3次，每次5分钟。</li>
		<li>用0.2 mL MyHC一抗（以PBS按1:200稀释）孵育细胞2小时。再用0.5 mL PBS清洗细胞3次，每次5分钟。</li>
		<li>用0.2 mL山羊抗小鼠罗丹明红标记的二抗（以PBS按1:200稀释）孵育细胞。再用0.5 mL PBS清洗细胞3次，每次5分钟。</li>
		<li>彻底吸除PBS后，每孔加入一滴含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂。加盖盖玻片，并根据制造商说明固化封片剂，最后用指甲油封边。</li>
		<li>使用配备合适滤光片组的荧光显微镜观察C2C12细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）评估基因敲低效率
	<ol>
		<li>按照第3.1节所述方法，在12孔板中于分化条件下培养C2C12细胞。</li>
		<li>在所需时间点，吸除分化培养基，用1 mL PBS清洗细胞一次，然后每孔加入0.5 mL RNA提取试剂（材料表）。通过轻柔吹打使细胞裂解，并将裂解液转移至无菌1.5 mL离心管中。严格按照制造商说明书提取RNA。 
		警告：RNA提取试剂含有苯酚，应在通风橱中操作。收集RNA提取试剂废液并作为危险废物处理。实验人员应佩戴适当的个人防护装备。</li>
		<li>将最终的RNA沉淀溶解于20 µL焦碳酸二乙酯（DEPC）处理过的水中。使用分光光度计测定RNA浓度和纯度，并以A260/A280比值作为质量评估指标。 
		注：通常从12孔板的一个孔中可获得5–7 µg总RNA，A260/A280比值为1.8–2.0。</li>
		<li>为消化残留的共纯化基因组DNA，取1 µg RNA溶于PCR管中，总体积为8 µL DEPC处理水。加入1 µL 10×反应缓冲液和1 µL DNase I（1单位/µL）（材料表），室温孵育15分钟。加入1 µL终止液（25 mM EDTA），70 °C孵育10分钟。</li>
		<li>合成cDNA时，将10 µL经DNase处理的RNA与10 µL 2×逆转录酶预混液混合，后者包含逆转录酶、随机引物、4 mM dNTP混合物（dATP、dTTP、dGTP和dCTP各1 mM）以及逆转录酶反应缓冲液。将反应体系置于热循环仪中，按照制造商推荐程序进行孵育。将合成的cDNA用水稀释至1:5比例。</li>
		<li>配制qRT-PCR反应体系：每反应加入5 µL SYBR Green qPCR预混液、0.5 µL特异性正向引物和0.5 µL特异性反向引物（储存浓度：10 µM），以及2 µL DEPC处理水。将qPCR反应液加入96孔qRT-PCR板的某一孔中，再加入2 µL稀释后的cDNA。每个生物学重复设置三个技术重复，并包括一个看家基因（如Gapdh或Hprt1）作为内参。</li>
		<li>使用qRT-PCR热循环仪进行扩增，程序如下：50 °C 2分钟（尿嘧啶-DNA糖基化酶[UDG]激活），95 °C 2分钟（双锁DNA聚合酶激活），随后进行40个循环：95 °C 15秒，60 °C 30秒，72 °C 1分钟。</li>
		<li>采用DDCt法对qRT-PCR结果进行定量分析，以内参基因（如Gapdh或Hprt1）进行标准化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过蛋白质印迹（Western blotting）评估基因敲低效率
	<ol>
		<li>为进行蛋白质印迹分析，在6孔板中每孔接种300,000个嘌呤霉素抗性的C2C12细胞。24小时后，更换为无血清DMEM以启动分化（定义为分化的第0天）。</li>
		<li>在所需时间点，收集两份1 mL无血清条件培养基至1.5 mL离心管中，在室温下以500 × g离心5分钟，以去除脱落的细胞和细胞碎片。 
		注：此步骤仅在研究细胞外基质蛋白或其他分泌蛋白时需要。若目标蛋白位于细胞质或为膜结合蛋白，则可直接吸除培养基，进入细胞裂解步骤（3.4.7–3.4.12）。为尽量减少蛋白降解及其他因细胞层长时间存放导致的非预期后果，细胞裂解应与条件培养基中的蛋白沉淀步骤同步进行。</li>
		<li>离心后，将1 mL条件培养基转移至新的1.5 mL离心管中，通过加入0.391 mL三氯乙酸（TCA）与非离子型表面活性剂/去垢剂的混合液沉淀蛋白。短暂涡旋混合后，冰上孵育10分钟。 
		注：使用前立即配制蛋白沉淀混合液，每1 mL条件培养基加入0.252 mL 55% TCA和0.139 mL 1%非离子型表面活性剂/去垢剂，短暂涡旋，溶液将变浑浊。 
		警告：TCA具有腐蚀性，必须谨慎操作。</li>
		<li>在4 °C下以&#62;16,000 × g离心10分钟，收集蛋白沉淀，弃去上清液。 
		警告：上清液含有TCA，应单独收集并作为危险物质处理。</li>
		<li>用预冷的丙酮清洗蛋白沉淀3次，每次在4 °C下以&#62;16,000 × g离心10分钟。</li>
		<li>在室温下将蛋白沉淀空气干燥3–4分钟，溶于50 µL 1× SDS-PAGE上样缓冲液（含50 mM Tris pH 6.8、2% SDS、6%甘油、0.004%溴酚蓝，并补充5% β-巯基乙醇）。95 °C煮沸5分钟后，按标准流程进行蛋白质印迹，以检测目标蛋白。 
		警告：β-巯基乙醇具有恶臭且有毒，必须在通风橱中操作。</li>
		<li>对于细胞内或膜结合蛋白，用2 mL PBS清洗细胞层一次。</li>
		<li>加入1 mL PBS，用细胞刮刀刮下细胞，收集至1.5 mL离心管中，在4 °C下以3,420 × g离心3分钟。用1 mL PBS清洗细胞沉淀3次，每次在4 °C下以3,420 × g离心3分钟。</li>
		<li>为裂解细胞，将细胞沉淀重悬于0.2 mL裂解缓冲液中（含20 mM Tris-HCl pH 7.5、150 mM NaCl、1 mM Na2EDTA、1 mM EGTA、1% NP40、1%脱氧胆酸钠、2.5 mM焦磷酸钠、1 mM β-甘油磷酸钠和1 mM正钒酸钠），并补充1×不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物，冰上孵育30分钟。</li>
		<li>在冰上以23 kHz工作频率、输出功率设定为10的条件下超声处理15秒。</li>
		<li>在4 °C下以13,680 × g离心20分钟，去除细胞碎片。将上清液转移至新的1.5 mL离心管中，使用商用Bradford法或其他合适方法测定蛋白浓度。</li>
		<li>每个样品取100 µg蛋白，加入5× SDS-PAGE上样缓冲液，总体积调至60 µL，95 °C煮沸5分钟。按标准蛋白质印迹流程分析样品中目标蛋白的表达水平。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种在 C2C12 成肌细胞中稳定敲低细胞外基质（ECM）蛋白的实验方案，以及对 C2C12 成肌细胞向肌管分化过程进行表型分析的方法。实验结果受多种因素影响，需仔细考虑。保持 C2C12 细胞处于增殖阶段是维持其成肌前体细胞状态的关键步骤。C2C12 细胞能否持续稳定地分化为肌管，取决于以下三个方面：i）细胞的传代次数，ii）常规培养过程中细胞的密度，以及 iii）营养物质的可获得性，后者要求频繁且定期更换细胞培养基11,12,13。由于某些尚未明确的机制，高传代次数的 C2C12 细胞也会丧失进一步发生成肌细胞融合的能力11。C2C12 细胞供应商建议将传代次数控制在15代以内，超过此范围后，细胞的分化能力可能下降，使用此类细胞进行实验可能导致肌管形成的一致性降低。另一方面，常规培养中的细胞密度也可能产生类似影响9。在常规培养过程中若达到汇合状...

细胞外基质（ECM）蛋白为所有组织提供结构支持，介导细胞间通讯，并决定细胞命运。因此，ECM 的形成及其动态重塑对于维持组织和器官的稳态至关重要1,2。多个编码 ECM 蛋白的基因发生致病性变异可导致骨骼肌系统疾病，其表型范围从肌营养不良症到假性肌肉发达3,4。例如，ADAMTSL2 基因的致病性变异会引起极为罕见的骨骼肌系统疾病——小人症样发育不良（geleophysic dysplasia），其特征之一为假性肌肉发达，即骨骼肌质量看似增加5。结合小鼠和人类中的基因表达数据，这提示 ADAMTSL2 在骨骼肌发育或稳态中具有重要作用6,7。
本文所述方案旨在研究ADAMTSL2在细胞培养条件下调控骨骼肌发育和/或稳态的机制。我们在小鼠C2C12成肌细胞系中稳定敲低了ADAMTSL2。C2C12成肌细胞及其向肌管细胞的分化是一种已被充分描述且广泛应用的细胞培养模型，用于研究骨骼肌分化及骨骼肌生物工程8,9。在撤除血清后，C2C12细胞会经历明确的分化阶段，经过3−10天的培养后形成多核肌管细胞。这些分化过程可通过检测特定标志基因（如MyoD、肌生成素或肌球蛋白重链（MyHC））的mRNA水平进行可靠监测。在C2C12细胞中建立稳定基因敲低的一个优势在于，相较于通过小干扰（si）RNA实现的瞬时敲低（其效应通常在转染后持续5−7天，且受转染效率影响），该方法能更有效地靶向在C2C12分化后期表达的基因。本方案的第二个优势是可通过嘌呤霉素筛选相对快速地获得成批的C2C12基因敲低细胞。其他替代方法，例如CRISPR/Cas9介导的基因敲除，或从人类样本或目的基因缺陷小鼠中分离原代骨骼肌前体细胞，则在技术上更具挑战性，或分别依赖于患者肌肉活检样本或目的基因缺陷小鼠的可获得性。然而，与其他基于细胞培养的方法类似，C2C12细胞作为骨骼肌细胞分化模型也存在局限性，例如细胞培养体系为二维（2D）结构，且缺乏体内微环境——而后者对于维持未分化骨骼肌前体细胞至关重要10。

<table><tbody><tr><td>丙酮</td><td>Fisher Chemical</td><td>191784</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1423</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr><tr><td>自动化细胞计数仪 Countesse II</td><td>Invitrogen</td><td>A27977</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 试剂</td><td>Thermo Scientific</td><td>P4205987</td><td></td></tr><tr><td>C2C12 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>腔室载玻片</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher Chemical</td><td>183172</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>DNase I（扩增级）</td><td>Invitrogen</td><td>18068015</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB374</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>VWR Life Sciences</td><td>19C2656013</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠二抗（IRDYE 800CW）</td><td>Li-Cor</td><td>C90130-02</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠二抗（罗丹明红）</td><td>Jackson Immune Research</td><td>133389</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>A144S</td><td></td></tr><tr><td>培养箱（摇床）</td><td>Denville Scientific Corporation</td><td>1704N205BC105</td><td></td></tr><tr><td>巯基乙醇</td><td>Amresco, VWR Life Sciences</td><td>2707C122</td><td></td></tr><tr><td>质粒中量提取试剂盒</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>肌球蛋白 4（肌球蛋白重链）</td><td>Invitrogen</td><td>14-6503-82</td><td></td></tr><tr><td>封片剂</td><td>Invitrogen</td><td>2086310</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Life Sciences</td><td>241</td><td></td></tr><tr><td>非离子型表面活性剂/去垢剂</td><td>VWR Life Sciences</td><td>18D1856500</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>MP</td><td>199983</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP399-4</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素抗生素</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯管</td><td>Fisherbrand</td><td>149569C</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂混合片剂</td><td>Roche</td><td>33576300</td><td></td></tr><tr><td>嘌呤霉素</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2956100</td><td></td></tr><tr><td>PCR（实时）</td><td>Applied Biosystems</td><td>4359284</td><td></td></tr><tr><td>反应管</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td></td></tr><tr><td>逆转录预混液</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 缓冲液</td><td>Thermo Scientific</td><td>TK274910</td><td></td></tr><tr><td>sh control 质粒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>07201820MN</td><td></td></tr><tr><td>sh 3086 质粒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRCN0000092578</td><td></td></tr><tr><td>sh 972 质粒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRCN0000092579</td><td></td></tr><tr><td>sh 1977 质粒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRCN0000092582</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计（Nanodrop）</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop One C</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green 试剂预混液</td><td>Applied Biosystems</td><td>743566</td><td></td></tr><tr><td>三氯乙酸</td><td>Acros Organics</td><td>30145369</td><td></td></tr><tr><td>Trizol 试剂</td><td>Ambion</td><td>254707</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>GIBCO</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1421</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶 EDTA 0.25%</td><td>Gibco-Life Technology Corporation</td><td>2085459</td><td></td></tr><tr><td>水（DEPC 处理且无核酸酶）</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>186163</td><td></td></tr><tr><td>Western blot 装置</td><td>Biorad</td><td>Mini Protean Tetra Cell</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP1422</td><td></td></tr></tbody></table>

利用小发夹rna在c2c12成肌细胞系中稳定敲低编码细胞外基质蛋白的基因

Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA

细胞外基质（ECM）蛋白对骨骼肌的发育和稳态至关重要。通过在C2C12成肌细胞中稳定敲低编码ECM蛋白的基因，可用于研究这些蛋白在骨骼肌发育中的作用。本文以小发夹RNA（shRNA）在C2C12细胞中敲低ECM蛋白ADAMTSL2为例，描述了一种具体的实验方案。在转染shRNA质粒后，使用嘌呤霉素对细胞进行批量筛选以获得稳定细胞系。我们进一步介绍了这些细胞系的维持方法，以及通过mRNA表达、蛋白表达和C2C12细胞分化进行的表型分析。该方法的优势在于能够相对快速地获得稳定的C2C12基因敲低细胞系，并且在细胞培养基中去除血清后，C2C12细胞可稳定地分化为多核肌管。C2C12细胞的分化过程可通过明场显微镜观察，并通过检测经典标志基因（如MyoD、肌生成素或肌球蛋白重链（MyHC））的表达水平来评估，这些标志物可反映C2C12成肌细胞向肌管分化的进程。与利用小干扰（si）RNA进行的瞬时基因敲低相比，构建稳定表达shRNA的C2C12细胞系可更有效地靶向在C2C12分化后期或肌管成熟过程中表达的基因。该方法的局限性包括不同shRNA导致的敲低效率存在差异，这一问题可通过基于CRISPR/Cas9的基因敲除策略加以克服；此外，还需考虑shRNA可能存在的脱靶效应。

转染后10−14天内即可完成对嘌呤霉素抗性C2C12细胞的筛选，这是由于非抗性（即未转染）细胞被高效清除（图1B）。通常情况下，超过80%的细胞会从细胞培养皿上脱落，并在常规细胞维护过程中被去除。表达对照（随机）shRNA的嘌呤霉素抗性C2C12细胞在低密度时保持纺锤形、细长的细胞形态，并具有分化为肌管的能力。通过撤除血清诱导C2C12细胞分化后，可利用明场显微镜观察并结合肌管标志物——肌球蛋白重链（MyHC）的免疫染色进行监测（图2）。在启动分化后3−5天内可观察到MyHC阳性的肌管。由于在MyHC阳性细胞边界内存在多个DAPI阳性细胞核，表明肌管为多核结构。图3A展示了在完全DMEM培养基中培养的稳定C2C12细胞的明场图像。此处显示的基因敲低效率范围为40−60%（图3B）。由于mRNA是在增殖...

我们提供了一种利用小发夹RNA（shRNA）在C2C12成肌细胞中稳定敲低编码细胞外基质（ECM）蛋白基因的实验方案。以ADAMTSL2基因为例，本文描述了在C2C12成肌细胞向肌管分化过程中，从mRNA、蛋白质及细胞水平上验证基因敲低效率的方法。

利用小发夹RNA在C2C12成肌细胞系中稳定敲低编码细胞外基质蛋白的基因

细胞外基质（ECM）蛋白对骨骼肌的发育和稳态至关重要。对编码ECM蛋白的基因进行稳定敲低……

本方案具有重要意义，因为它使我们能够研究在成肌管形成或成熟后期上调的蛋白质（如细胞外基质蛋白）的功能。该方法可通过使用特异性shRNA及相应的表型分析工具，在C2C12细胞中敲低任何目的基因。该方法的主要优势在于，我们已构建出能够在成熟成肌管中持续抑制目的基因的C2C12细胞系。该实验步骤最关键的环节是保持C2C12细胞处于未分化状态，即在常规细胞培养过程中维持较低的细胞密度。转染前一天，将每毫升5×10⁴个C2C12细胞接种于6孔板中，每孔加入2毫升完全DMEM培养基，在37°C、5% CO₂条件下过夜培养，使细胞融合度达到40%至50%。次日早晨，为每个培养孔准备一个1.5毫升离心管，每管中加入100微升25毫摩尔氯化钠溶液，并加入25.5微升未分化C2C12细胞培养物的PEI储备液，于37°C孵育5分钟。接下来，将三微克质粒DNA与每孔100微升25毫摩尔氯化钠溶液混合，在37摄氏度下孵育5分钟。孵育结束后，将每份稀释后的PEI试剂全部体积与对应的稀释质粒溶液通过轻柔吹打混合，于37摄氏度孵育25分钟。孵育期间，将C2C12细胞培养物的上清液更换为不含抗生素和血清的DMEM培养基。孵育结束时，将每种转染混合物的全部体积以滴加方式加入到每个孔中，同时持续移动细胞培养皿。在细胞培养箱中孵育六小时后，将每孔中的培养基更换为完全DMEM。转染24小时后，将每孔中的完全DMEM更换为添加了5微克/毫升嘌呤霉素的筛选培养基，并将细胞放回细胞培养箱中继续培养10至14天，或直至观察到稳定的C2C12细胞。然后，在含有每毫升5微克嘌呤霉素的低密度培养条件下扩增嘌呤霉素抗性的C2C12细胞，并将6至10管细胞冻存以备后续使用。为诱导C2C12细胞分化，将1.5 × 10⁵个稳定的嘌呤霉素抗性C2C12细胞接种于12孔板中，每孔加入1毫升筛选培养基，于37°C、5% CO₂条件下培养，直至细胞融合度达到95%。为诱导分化，使用配备相机的倒置明场显微镜观察肌管形成后，每隔两天将每孔中的培养基更换为无血清DMEM。对于分化细胞的肌球蛋白重链免疫染色，将五乘以十的四次方个嘌呤霉素抗性C2C12细胞接种至八孔腔室载玻片的每个孔中，每孔加入500微升完全DMEM培养基，然后将细胞放回细胞培养箱中。当细胞达到95%融合度时，将每孔中的筛选培养基更换为500微升无血清DMEM。在适当的实验时间点，用PBS缓冲液洗涤各孔中的分化细胞，每次5毫升，共洗涤三次，然后每孔加入200微升含4%多聚甲醛的PBS溶液进行固定。孵育15分钟后，用新鲜的PBS洗涤细胞，每次洗涤均按上述方法进行，共洗涤三次，随后每孔加入200 µL PBS中的5摩尔甘氨酸，孵育5分钟。孵育结束后，再次洗涤细胞三次，然后每孔加入200 µL PBS中含1%非离子型表面活性剂的溶液，孵育10分钟以通透细胞。接着，每孔加入200 µL PBS中含5%牛血清白蛋白的溶液，室温孵育1小时以封闭非特异性抗体结合位点，随后用PBS洗涤三次。最后一次洗涤后，在室温下用200微升肌球蛋白重链抗体标记细胞，孵育两小时。经过三次PBS洗涤后，将细胞与相应的二抗在室温下避光孵育两小时。最后再进行三次洗涤，吸去PBS，加入一滴含DAPI的封片剂，并加盖盖玻片封片。然后使用荧光显微镜并配合适当的滤光片组观察每个小室。为了通过蛋白质印迹法评估细胞培养物中的基因敲低效率，首先将三份每份10的5次方个嘌呤霉素抗性C2C12细胞分别接种于6孔板中，每孔加入2 mL完全DMEM培养基。24小时后，用PBS洗涤细胞，并如图所示用2 mL无血清DMEM诱导细胞分化。在适当的实验时间点分析分泌蛋白时，从每个孔中收集一毫升无血清的条件培养基，分别加入到1.5毫升的离心管中进行离心。离心后，将一毫升条件培养基上清液转移至新的1.5毫升离心管中，并每管加入391微升非离子型表面活性剂中的三氯乙酸沉淀蛋白。涡旋混匀30秒后，将混合物置于冰上孵育10分钟。孵育结束后，通过离心收集沉淀的蛋白质，并用预冷的新鲜丙酮洗涤蛋白沉淀，每次洗涤后离心，共洗涤三次。最后一次洗涤后，将沉淀在室温下空气干燥三至四分钟，然后每管加入50 µL SDS-PAGE上样缓冲液重悬。随后将样品在95 °C下煮沸5分钟，再按照标准操作流程进行Western印迹分析。对于细胞内和膜结合蛋白的分析，每孔使用两毫升磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞层，并用细胞刮棒在每毫升PBS中轻柔地刮下细胞。将细胞转移至各1.5毫升离心管中，离心后用每管一毫升PBS洗涤三次，每次均通过离心进行。最后一次洗涤后，将细胞沉淀重悬于200微升裂解缓冲液中，缓冲液中需添加无EDTA的蛋白酶抑制剂混合试剂，在冰上孵育30分钟。孵育结束后，将样品置于冰上，以23千赫兹的工作频率和10的输出功率超声处理15秒，然后通过离心去除细胞碎片。将上清液转移至新的1.5毫升反应管中，根据标准方案测定蛋白浓度。每份样品中取100微克蛋白，加入5X SDS-PAGE上样缓冲液，总体积为60微升，于95摄氏度加热5分钟。 然后通过蛋白质印迹法分析样品中是否存在目标蛋白。由于非耐药细胞被有效清除，转染后10至14天内即可完成对嘌呤霉素耐药的C2C12细胞的筛选。通常在此期间，超过80%的C2C12细胞会从细胞培养皿上脱落，并在常规细胞维护过程中被去除。表达对照或ADAMTSL2 shRNA的嘌呤霉素抗性C2C12细胞在低细胞密度下保持其纺锤形、细长的细胞形态，以及分化为成肌细胞的能力。通过撤除血清诱导C2C12细胞分化后，可利用明场显微镜和针对成肌细胞标志物——肌球蛋白重链的免疫染色进行监测。在诱导分化后3至5天可观察到肌球蛋白重链阳性的成肌细胞，这些成肌细胞为多核细胞，表现为细胞边界内存在一个以上的DAPI阳性细胞核。如增殖条件下的基因表达数据所示，转染的基因敲低效率为40%至60%。可通过Western blot分析来验证基因敲低是否成功，例如，比较稳定表达靶向ADAMTSL2的shRNA的C2C12细胞与表达对照shRNA的细胞所获得的细胞裂解液。在筛选过程中，务必保持足够高的嘌呤霉素浓度，以清除所有未转染的C2C12细胞，否则未转染的细胞可能会过度生长并取代已转染的细胞。该检测方法使我们能够确定在肌肉发育后期表达的细胞外基质蛋白的功能，即使这些蛋白是在C2C12细胞分化后五到十天才被诱导表达的。请注意，RNA 提取试剂和β-巯基乙醇应在通风橱中操作，并按照适当的安全规程处理三氯乙酸。感谢观看，祝您的实验顺利成功。

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Research

科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

使用小毛针（sh）RNA在C2C12霉细胞细胞系中编码细胞外基质蛋白的基因稳定击倒

检测了ACF染色质重塑因子在E4orf4诱导的细胞死亡中的作用。该实验方案包括筛选在强力霉素处理下可诱导性敲低ACF亚基Acf1和SNF2h的细胞克隆，并利用DAPI染色法测定在可诱导细胞系中E4orf4诱导的细胞死亡。...

为条件性敲低基因表达及检测其对E4orf4诱导细胞死亡的影响制备细胞系

在本视频中，我们演示一种方法，通过将 shRNA...

体外短发夹RNA介导的iHSPCs基因敲低：基于慢病毒的shRNA表达系统递送用于iHSPCs中特定基因表达的敲低

一种快速、简便的方法，可生成具有可诱导且可逆的cDNA过表达或shRNA介导的目标基因敲低的人源细胞系。该方法使研究人员能够可靠且高度可重复地操控那些难以通过瞬时转染方法或传统敲低/敲除策略进行改造的细胞系。...

建立可稳定表达四环素诱导型（Tet-on）shRNA或cDNA的人源细胞系

通过siRNA实现基因沉默是一种便捷的实验策略，可用于分析BRCA2依赖的生物学功能，有助于更好地理解癌症生物学。本文介绍了一种高效沉默BRCA2基因的方法，以及在人源细胞系中通过免疫印迹检测和定量BRCA2蛋白表达变化的实验流程。...

在培养的人类细胞中沉默BRCA2以鉴定新型BRCA2调控的生物学功能

在本实验方案中，我们介绍了建立强直性肌营养不良症1型成肌细胞模型的步骤，包括优化的C2C12细胞培养、基因转染/转导以及肌细胞分化。...

在C2C12成肌细胞中建立强直性肌营养不良症1型模型

本方案旨在介绍如何在癌细胞系中建立功能性Tet-ON系统，并进一步应用该系统，特别是用于研究肿瘤细胞来源的蛋白质在单核细胞/巨噬细胞向肿瘤微环境募集过程中的作用。...

在癌细胞系中条件性敲低基因表达以研究单核细胞/巨噬细胞向肿瘤微环境的募集

我们介绍了一种体内方法，通过结合心脏毒素介导的骨骼肌损伤和自递送siRNA注射，研究卫星细胞中特定基因功能的丧失。...

通过心脏毒素损伤及体内自递送siRNA注射分析卫星细胞在骨骼肌再生过程中的功能

在本研究中，使用特异性的shRNA敲低了PERK通路的两个下游信号组分——具有细胞保护作用的钙调磷酸酶以及促凋亡的CHOP。这两种组分以相反的方式调控原代皮层神经元在内质网应激诱导后发生神经突萎缩的易感性。...

慢病毒递送特异性shRNA对内质网应激神经元的分子调控

本文提供了一种利用慢病毒介导的shRNA转导技术，通过建立稳定的基因敲低细胞系，筛选参与树突状细胞（DC）发育的潜在转录因子的实验方案。 体外...

通过短发夹RNA介导的基因敲低在造血干细胞和祖细胞系中研究树突状细胞发育 体外

本方案介绍了如何从设计向导RNA开始，到细胞克隆及基因敲除克隆的鉴定，利用CRISPR/Cas9技术生成敲除型成肌细胞。...

利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建基因敲除肌肉细胞系

在此，我们提出一种用于 体外...

体外筛选靶向表观遗传沉默的工程化转录抑制因子

学习使用shRNA在C2C12肌母细胞中稳定敲低编码细胞外基质蛋白的基因，以ADAMTSL2为案例研究，验证mRNA、蛋白及细胞水平的敲低效率，助力肌肉分化与再生研究。

利用小发夹RNA在C2C12成肌细胞系中稳定敲低编码细胞外基质蛋白的基因

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