Name: 使用动脉内血压监测和通气通过气管切除术的小鼠脑死亡诱导 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: 了解通过气管切除术和动脉内血压监测在小鼠体内诱导脑死亡的方法。该模型用于研究脑死亡后器官特异性病理生理变化及其对实体器官移植的影响。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

动物实验遵循由美国国家医学研究协会制定的《实验室动物护理原则》以及由美国国家科学院编制、美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》（NIH 出版物编号 86-23，1985 年修订版）。所有实验均获得奥地利教育、科学和文化部（BMWF-66.011/0071-II/3b/2012）批准。
1. 动脉插管
<ol>
	<li>通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪10&#160;以及根据当地实践使用的镇痛剂（例如布托啡诺）对小鼠进行麻醉。用镊子夹捏后肢以确认麻醉深度是否合适。 
	注意：本研究使用8−12周龄的雄性C57BL/6N小鼠（体重20−25 g）。作者曾尝试同龄雄性BALB/c小鼠但未成功，尚未测试其他品系（见讨论部分）。</li>
	<li>使用电动剃刀去除感兴趣区域（头部、颈部）的毛发。确保无松散毛发残留，以防伤口污染。随后用70%乙醇/氯己定/聚维酮碘对术区进行消毒，并将小鼠仰卧位固定，头部朝向术者。</li>
	<li>使用解剖剪在颈部正中做一切口。</li>
	<li>解剖下颌下腺和颈部肌肉组织并将其分离，以暴露颈总动脉。主要使用镊子进行钝性分离。</li>
	<li>在右侧颈总动脉下方放置三根8-0丝线结扎线。</li>
	<li>在近端结扎线上放置夹子，并对动脉施加张力，以阻断血流。</li>
	<li>结扎最远端的结扎线。</li>
	<li>通过切口颅侧预先制作的皮肤小孔插入动脉导管。若导管管腔过大，可挤压并变形以减少血液反流。使用三根结扎线将导管固定。</li>
	<li>将导管缝合固定于皮肤，以防移位。可通过缝线（例如5-0单股不可吸收缝线）将导管与预置皮肤小孔周围的皮肤连接固定。</li>
</ol>
2. 气管切开术
<ol>
	<li>使用镊子钝性分离气管前肌群。</li>
	<li>在气管下方放置两根8-0丝线结扎线。</li>
	<li>使用显微剪尽可能靠近近端进行气管切开，以避免单侧通气。在两个气管软骨环之间沿水平方向剪开。</li>
	<li>插入通气管，并用两根预先准备好的结扎线固定。 
	注意：气管近端无需结扎。</li>
	<li>使用连续缝合方式缝合皮肤（例如，6-0单股非吸收缝线）。</li>
	<li>以每分钟150次的频率、200 µL的潮气量对小鼠进行通气。</li>
</ol>
3. 脑死亡诱导
<ol>
	<li>将小鼠置于俯卧位。</li>
	<li>使用手术剪和镊子夹住皮肤，去除颅骨上的皮肤。</li>
	<li>在左侧顶叶皮层上方旁中线处钻一个直径为1 mm的孔，钻孔时在穿透内层致密骨板和硬脑膜前停止操作。</li>
	<li>使用钝头镊子穿透颅骨最后的组织桥接部分，并去除锐利边缘。</li>
	<li>插入球囊导管，确保其完全位于颅腔内。确保球囊已预先充满生理盐水，并排尽所有空气。</li>
	<li>借助注射泵，在10−15分钟内以约0.1 mL/min的速度开始充胀（总体积为0.8−1.2 mL）。 
	注意：小鼠将出现肌阵挛、瞳孔散大、进一步的癫痫样活动以及临终样喘息。</li>
	<li>当小鼠尾巴变得僵硬并竖起时，判定其脑死亡。 
	注意：脑死亡通过特征性的初期血压峰值（库欣反射）、脑干反射消失以及自主呼吸停止来确认。实验过程中应避免常规进行呼吸暂停测试，因为小鼠可能因缺氧而出现循环不稳定。</li>
	<li>停止球囊导管的充胀。</li>
	<li>在小鼠身上覆盖加热毯，以防止低体温。</li>
</ol>
4. 脑死亡期间
<ol>
	<li>定期监测并记录血压。排除出现持续低血压阶段的小鼠（平均动脉压 [MAP] &#60; 50 mmHg 持续 &#62;30 分钟）。</li>
	<li>每 30 分钟输注 0.1 mL 生理盐水，以稳定小鼠的血压。 
	注：本研究中每只小鼠共给予 0.8 mL 生理盐水。</li>
	<li>脑死亡持续 4 小时后，采集小鼠器官/组织。若实验结束时小鼠心脏已停止跳动，则将该小鼠排除出实验。</li>
</ol>
5. 假手术操作
<ol>
	<li>执行步骤 1.1−3.3。 
	注意：不要切开内层密质骨。不要插入或扩张球囊导管。</li>
	<li>密切观察小鼠，持续监测其状态。使用镊子反复夹捏后肢，以确认麻醉深度。若小鼠出现苏醒迹象（根据我们的经验，通常发生在麻醉后约 2−3 小时），应皮下追加麻醉剂（剂量约为初始剂量的 1/2）。</li>
	<li>静脉输注的生理盐水量应与脑死亡（BD）小鼠相同。 
	注意：假手术小鼠在停止通气后将恢复自主呼吸，而脑死亡（BD）小鼠则不会。建立模型时应进行呼吸暂停测试，但在实验过程中应避免该操作，以防止不必要的生理应激。</li>
</ol>

<ol><li>Hart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OPTN%2FSRTR+2017+Annual+Data+Report%3A+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">OPTN/SRTR 2017 Annual Data Report: Kidney.</a> American Journal of Transplantation. 19 (Suppl 2), 19(2019).</li>
<li>The Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practice+parameters+for+determining+brain+death+in+adults+%28summary+statement%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Practice parameters for determining brain death in adults (summary statement).</a> Neurology. 45 (5), 1012-1014 (1995).</li>
<li>Terasaki, P. I., Cecka, J. M., Gjertson, D. W., Takemoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+survival+rates+of+kidney+transplants+from+spousal+and+living+unrelated+donors%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+Medicine%22%5BJournal%5D)">High survival rates of kidney transplants from spousal and living unrelated donors.</a> New England Journal Medicine. 333 (6), 333-336 (1995).</li>
<li>Pratschke, J., Neuhaus, P., Tullius, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+can+be+learned+from+brain-death+models%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">What can be learned from brain-death models?</a> Transplant International. 18 (1), 15-21 (2005).</li>
<li>Wilhelm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+heart+by+donor+brain+death+accelerates+acute+rejection+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Activation of the heart by donor brain death accelerates acute rejection after transplantation.</a> Circulation. 102 (19), 2426-2433 (2000).</li>
<li>Pomper, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+a+mouse+model+of+brain+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Introducing a mouse model of brain death.</a> Journal of Neuroscience Methods. 192 (1), 70-74 (2010).</li>
<li>Ritschl, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+brain+death+leads+to+differential+immune+activation+in+solid+organs+but+does+not+accelerate+ischaemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Donor brain death leads to differential immune activation in solid organs but does not accelerate ischaemia-reperfusion injury.</a> Journal of Pathology. 239 (1), 84-96 (2016).</li>
<li>Atkinson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+brain+death+exacerbates+complement-dependent+ischemia%2Freperfusion+injury+in+transplanted+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Donor brain death exacerbates complement-dependent ischemia/reperfusion injury in transplanted hearts.</a> Circulation. 127 (12), 1290-1299 (2013).</li>
<li>Oberhuber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+tetrahydrobiopterin+overcomes+brain+death-associated+injury+in+a+murine+model+of+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Treatment with tetrahydrobiopterin overcomes brain death-associated injury in a murine model of pancreas transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 15 (11), 2865-2876 (2015).</li>
<li>Floerchinger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+immune+responses+in+a+reproducible+mouse+brain+death+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory immune responses in a reproducible mouse brain death model.</a> Transplant Immunology. 27 (1), 25-29 (2012).</li>
<li>Steen, P. A., Milde, J. H., Michenfelder, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+barbiturate+protection+in+a+dog+model+of+complete+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">No barbiturate protection in a dog model of complete cerebral ischemia.</a> Annals of Neurology. 5 (4), 343-349 (1979).</li>
<li>Cooper, D. K., Novitzky, D., Wicomb, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiological+effects+of+brain+death+on+potential+donor+organs%2C+with+particular+reference+to+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Royal+College+of+Surgeons+of+England%22%5BJournal%5D)">The pathophysiological effects of brain death on potential donor organs, with particular reference to the heart.</a> Annals of the Royal College of Surgeons of England. 71 (4), 261-266 (1989).</li>
<li>Herijgers, P., Leunens, V., Tjandra-Maga, T. B., Mubagwa, K., Flameng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+organ+perfusion+after+brain+death+in+the+rat+and+its+relation+to+circulating+catecholamines%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Changes in organ perfusion after brain death in the rat and its relation to circulating catecholamines.</a> Transplantation. 62 (3), 330-335 (1996).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

脑死亡（BD）是多器官捐献者移植物质量的一个风险因素，其涉及多种病理生理变化，这些变化只能通过体内模型进行充分评估。血流动力学变化、细胞因子风暴、激素水平改变及其对器官移植物质量和存活率的最终影响，无法在体外进行分析4。大多数基础移植研究以及免疫学研究都依赖于复杂的诊断工具，而这些工具目前仅在小鼠模型中广泛可用。小鼠模型已在与脑死亡相关的研究中带来了一系列新见解7,8,9。
尽管在20世纪，BD研究的首批模型已在狒狒、狗和猪中建立11,12，但直到1996年才首次报道了大鼠模型13。又经过了14年，维也纳研究团队于2010年首次发表了BD的小鼠模型6<...

目前，移植是治疗终末期器官衰竭的唯一治愈性手段。迄今为止，脑死亡（BD）患者一直是器官捐献的主要来源，尽管活体捐献和循环死亡后捐献也是有价值的替代方式1。BD 的定义包括不可逆的昏迷（病因明确）、脑干反射消失以及呼吸停止2。然而，BD 供体器官在长期移植物存活率方面表现较差，这种差异独立于人类白细胞抗原（HLA）配型不匹配和冷缺血时间3。与此同时，针对这一抗原非依赖性风险因素的深入研究已揭示出由 BD 引发的三大主要病理生理改变：血流动力学、内分泌和炎症反应方面的变化4。
迄今为止，啮齿类动物的实验性脑死亡模型主要使用大鼠进行。为了更深入地了解脑死亡后对实体器官的免疫学影响，我们旨在建立一种小鼠脑死亡模型，因为目前只有小鼠模型能够对遗传或免疫因素进行系统性研究。在此背景下，小鼠体系提供了更为丰富的分析工具。
此处所述的脑死亡（BD）诱导原理基于通过将球囊导管插入颅骨下方并充气，从而增加颅内压。升高的颅内压通过阻断大脑、小脑和脑干的灌注，模拟了脑死亡的生理机制5,6。为确保外周器官得到充分灌注，手术过程中必须进行血压监测。用于此目的的导管同时可用于输注生理盐水，通过液体替代来稳定血压。由于脑死亡伴随自主呼吸停止，必须保证充分通气。使用电热毯维持生理核心体温。
总之，该模型将有助于深入研究BD诱导的损伤对白细胞迁移7、补体激活8、缺血再灌注损伤9及其他因素的影响。

<table><tbody><tr><td>动脉导管（BD Neoflon 26G）</td><td>BD</td><td>391349</td><td></td></tr><tr><td>血压换能器（APT300）</td><td>Harvard Apparatus Inc.</td><td>73-3862</td><td></td></tr><tr><td>Fogarty 动脉取栓导管 N&amp;deg; 3</td><td>Edwards Lifesciences Corporation</td><td>120403F</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>FST</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>带柔性探头的恒温毯系统</td><td>Harvard Apparatus Inc.</td><td>55-7020</td><td></td></tr><tr><td> Ketansol </td><td>Graeub</td><td>6680110</td><td></td></tr><tr><td>显微剪刀</td><td>FST</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>持针器</td><td>FST</td><td>12060-02</td><td></td></tr><tr><td>Prolene 5-0</td><td>Ethicon</td><td>8698H</td><td></td></tr><tr><td>Pump 11 Elite 单通道输注泵</td><td>Harvard Apparatus Inc.</td><td>70-4500</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>FST</td><td>14075-11</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>透气胶带（Transpore Tape）</td><td>3M</td><td>1527-1</td><td></td></tr><tr><td>护理垫</td><td>Molinea.A</td><td>274301</td><td></td></tr><tr><td>小鼠呼吸机（MiniVent Model 845）</td><td>Harvard Apparatus Inc.</td><td>73-0043</td><td></td></tr><tr><td>Xylasol</td><td>Graeub</td><td>7630109</td><td></td></tr></tbody></table>

通过气管切开术进行通气并结合动脉内血压监测的小鼠脑死亡诱导

Brain Death Induction in Mice Using Intra-Arterial Blood Pressure Monitoring and Ventilation via Tracheostomy

尽管活体捐献和循环死亡后捐献为器官移植提供了替代来源，但脑死亡（BD）后捐献仍是实体器官移植的主要供体来源。然而，脑功能的不可逆丧失已知会引发多种病理生理变化，包括血流动力学及激素水平的改变，最终导致全身性炎症反应。目前能够对这些效应进行体内系统研究的模型十分有限。本文介绍一种小鼠脑死亡诱导模型，有助于深入研究脑死亡对同种异体移植物质量的严重影响。在通过颈总动脉建立动脉内血压监测，并经气管造口实现可靠通气后，利用球囊导管逐步升高颅内压以诱导脑死亡。脑死亡诱导4小时后，可获取器官用于分析或进一步的移植操作。该策略可在小鼠模型中对供体脑死亡进行系统性分析，从而加深对实体器官移植中脑死亡相关效应的理解，并可能为优化器官预处理方案提供新途径。

小鼠BD模型已成功实施100余次，成功率超过90%。此外，干预后的心脏和肾脏器官移植也已安全开展。7.
BD 会引发多种病理生理变化，可利用此模型进一步研究。如图1所示，血压首先出现一过性高血压峰值，随后进入持续的低血压阶段。为避免低血压带来的有害生理影响，将长时间血压不足的小鼠（平均动脉压 < 50 mmHg 持续超过 30 分钟）予以排除。
另一个被广泛证实的观察结果是，脑死亡（BD）的诱导会导致免疫系统的激活。在脑死亡持续4小时后，器官特异性免疫标志物在mRNA水平出现上调图2以及观察到免疫细胞的迁移7.
...

我们提出一种用于诱导小鼠脑死亡的模型，以评估脑死亡的病理生理学效应在实体器官移植背景下对器官及其后续移植物的影响。

尽管活体捐献和循环死亡后捐献均为器官移植提供了替代机会，但捐献者脑死亡后的捐献……

尽管脑死亡后器官捐献是实体器官移植的主要来源，但脑功能的不可逆丧失会引发病理生理变化，导致全身性炎症反应。这种小鼠脑死亡诱导模型可用于多种分析工具和基因敲除模型，以研究脑死亡调控的相关通路。在确认足底反射无反应并去除上腹部毛发后，进行动脉插管操作：用70%乙醇对暴露的皮肤进行消毒，使用解剖剪在皮肤上做正中切口。使用镊子钝性分离下颌下腺及颈部肌肉组织，分开组织以暴露颈总动脉。在右侧颈总动脉下方放置三条8-0丝线结扎线，并在近端结扎线上放置夹子。牵拉动脉使其张力增加，阻断血流，然后结扎最远端的结扎线。通过切口头部方向预先形成的皮肤小孔插入26号动脉导管。若管腔过大导致回流，可用镊子夹住导管以减少回流，并用三根缝线固定导管，然后使用一根5-0单丝不可吸收缝线将导管固定在皮肤小孔附近的皮肤上。进行气管造口术时，用镊子钝性分离气管前肌组织，并在气管下方放置两根8-0丝线结扎线。将通气管插入两节气管软骨之间，以避免单侧通气，并用两条预先准备好的结扎线固定导管，然后使用6-0单股不可吸收连续缝线关闭皮肤，以每分钟150次的频率和200微升的潮气量对小鼠进行通气。为在实验动物中诱导脑死亡，将小鼠置于俯卧位，用镊子夹住皮肤，使用手术剪去除颅骨上的皮肤。在左侧顶叶皮层上方中线旁钻一个直径1毫米的钻孔，并用钝头镊子穿透颅骨最后的组织桥。去除任何锐利边缘后，插入预先充满生理盐水且已排尽空气的球囊导管。当导管完全进入颅腔后，使用注射泵以大约每分钟0.1毫米的速度在10至15分钟内开始扩张导管。当脑死亡发生时，停止球囊导管的扩张，并在小鼠身上覆盖加热毯以防止低体温。确认脑死亡后，应定期监测并记录血压，每30分钟输注100 µL生理盐水，以维持动物血压稳定。脑死亡4小时后，剔除心脏已停搏的动物，并根据标准操作流程采集目标小鼠器官和组织。脑死亡诱导后，血压首先出现短暂的高血压峰，随后进入持续的低血压阶段。另一个被广泛证实的观察结果是，脑死亡的诱导会导致免疫系统的激活。事实上，在该模型中，脑死亡持续四小时后，可在 mRNA 水平检测到器官特异性的免疫标志物上调。在预设的脑死亡阶段结束后，可获取器官用于直接分析或后续的器官移植。该模型将有助于深入研究脑死亡所诱导的损伤，并已揭示出关于补体激活和白细胞迁移的新见解。

brain-death-induction-mice-using-intra-arterial-blood-pressure

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

使用动脉内血压监测和通气通过气管切除术的小鼠脑死亡诱导

一种用于研究急性肺损伤的呼吸机诱导肺损伤小鼠模型 体内. 本文报道了一种易于应用的 原位...

压力控制通气诱导小鼠急性肺损伤

一种用于研究心肌缺血及缺血预处理的心脏保护机制的小鼠模型是一项重要工具 体内. 本文报道了一种易于应用的 原位...

使用悬挂重物系统实现小鼠冠状动脉闭塞

本文介绍了一种用于围手术期和重症监护相关急性肾损伤的有力模型。通过心脏骤停诱导的全身低灌注，几乎可以复制临床急性肾损伤的组织学和功能变化。...

常温下心脏骤停与心肺复苏：小鼠缺血-再灌注损伤模型

本视频演示了通过球囊导管可控地增加颅内压，从而在小鼠模型中诱导脑死亡的实验操作，以模拟自然状态下的脑死亡过程。...

使用球囊导管在小鼠模型中诱导脑死亡

本视频展示了通过阻断小鼠右侧颈总动脉并将其暴露于低氧环境中，在小鼠模型中复制血栓性中风的操作过程。该过程会减少向大脑的血液和氧气供应，导致血栓形成及脑损伤。...

通过低氧与缺血在小鼠模型中诱导血栓性脑卒中

一种蛛网膜下腔出血的小鼠模型

本文介绍了如何在小鼠中实施体外循环。这一新型模型将有助于研究器官损伤相关的分子机制。...

小鼠模型中的心肺转流：一种新方法

本文介绍了一种通过闭胸导管术在同一动物体内获取左右心室压力-容积（PV）环路，以评估小鼠双心室心脏功能的实验方案。重点在于手术操作与数据采集的技术细节。...

通过小鼠闭胸导管术进行心脏功能的双心室评估及压力-容积环分析

本研究建立了三种不同的肺捐献模型（脑死亡后捐献、循环死亡后捐献和出血性休克后捐献），并比较了与这些事件相关的炎症过程及病理紊乱。...

肺移植实验性器官捐献模型研究

本方案展示了一种独特的窒息性心脏骤停小鼠模型，该模型在复苏过程中无需胸外按压。该模型可用于监测和成像心脏骤停及复苏期间脑生理学的动态变化。...

小鼠心脏骤停模型用于缺血及复苏期间的脑成像与脑生理监测

该方案可实现对小鼠和大鼠胸腔三维运动的可控机械通气及磁共振成像。我们已利用此装置研究机械通气所致呼吸肌功能障碍的病理生理机制。...

机械通气小鼠和大鼠呼吸运动的三维电影磁共振成像

了解通过气管切除术和动脉内血压监测在小鼠体内诱导脑死亡的方法。该模型用于研究脑死亡后器官特异性病理生理变化及其对实体器官移植的影响。

通过气管切开术进行通气并结合动脉内血压监测的小鼠脑死亡诱导

探索更多视频