利用免疫荧光显微镜鉴定石蜡包埋的猫动脉血栓中的中性粒细胞胞外诱捕网

本方案通过石蜡包埋主动脉切片的脱蜡及抗原修复，可作为研究中性粒细胞三细胞陷阱在猫血栓形成中作用的有用工具。与传统的组织学支架（如HNE）相比，免疫荧光法在固定并石蜡包埋的组织中检测中性粒细胞三细胞陷阱具有优势，因其可同时检测更安全的DNA和细胞外蛋白。该方案也可应用于其他类型的血栓及其他兽医物种。

在猫动脉血栓中发现中性粒细胞胞外诱捕网，提示其可能在猫的血栓形成中发挥作用。本文提供的方案仅供参考。我们强烈建议研究人员根据实际情况调整抗原修复过程的时间和条件，以获得满意的信号。

使用自动化系统对载玻片上的切片进行脱蜡和复水时，将载玻片放入支架中，完全浸入100%盐水中3分钟，重复此步骤两次。

各步骤之间无需冲洗。将样本完全浸入室温的递减浓度乙醇中，每次三分钟，重复三次。将样本完全浸入去离子水中两分钟，并重复一次。

用 TBST 处理后，将储液槽中充满加热至 100 摄氏度的去离子水。让蒸锅室平衡 20 分钟。在加热板上，将市售的含有 Tris 和 EDTA、pH 为 9.0 的抗原修复液加热至 95 至 97 摄氏度。

确保其不沸腾。将切片完全浸入加热的抗原修复液中，并通过蒸锅持续外部加热20分钟。随后，用TBST洗涤切片三次，每次五分钟。

现在，将切片放入封闭液1中，在室温下以30至50 rpm的转速轻轻振荡孵育2小时。无需洗涤，立即在载玻片上直接加入100微升稀释后的兔多克隆抗人瓜氨酸化组蛋白H3抗体。

在每个切片上放置盖玻片，以使抗体混合物均匀分布。在4°C下轻轻振荡孵育12至16小时。随后，用TBST缓冲液洗涤载玻片三次，每次五分钟。

加入抗体时，使用移液器均匀加入100 µL与Alexa Fluor 488偶联的山羊抗兔抗体。用锡箔纸包裹载玻片，并在室温下轻轻振荡孵育一小时。根据文稿用TBST洗涤后，在4°C下轻轻振荡孵育切片于封闭缓冲液2中过夜。

避光保存。用 TBST 每次五分钟，清洗三次。在封闭缓冲液 3 中封闭切片，室温下轻柔振荡孵育两小时，操作同前。

按照先前所述方法，将切片与生物素标记的多克隆兔抗人中性粒细胞弹性蛋白酶抗体在4°C孵育12至16小时。用TBST洗涤后，在室温下与Alexa Fluor 594链霉亲和素偶联物孵育1小时。随后，用TBST洗涤一次，每次5分钟。

按照制造商说明，将100微升自发荧光淬灭溶液混合物直接滴加到切片上，作用1分钟。立即用TBST缓冲液洗涤载玻片，每次10分钟，共洗涤6次。在避光条件下，每张载玻片上覆盖100微升300纳摩尔DAPI溶液，孵育5分钟。

然后用TBST洗涤五次，每次三分钟。将一滴抗荧光淬灭封片剂直接滴加在载玻片上围绕组织切片的区域。轻轻将盖玻片盖在切片上，避免产生气泡。

将样本置于4摄氏度避光条件下过夜固化。为定位血栓，使用10倍物镜的相差显微镜，沿主动脉、主动脉分叉处及每侧股动脉从头侧向尾侧进行扫描。首先使用DAPI通道（激发波长357和44纳米）检测切片中的无细胞DNA。

分别在Texas red和绿色荧光蛋白通道中识别细胞外的中性粒细胞弹性蛋白酶和瓜氨酸化组蛋白H3。在整个图像采集过程中，保持各通道曝光时间和增益的一致性，以避免像素强度饱和。中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）通过中性粒细胞弹性蛋白酶、瓜氨酸化组蛋白H3和无细胞DNA的共定位来识别。

通过苏木精和伊红染色及明场显微镜观察，猫的动脉血栓由红细胞、白细胞、纤维蛋白和血小板组成。中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）呈现为深紫色、长度不一的丝状网络结构，周围环绕着邻近的红细胞和白细胞。采用本方案，免疫荧光显微镜显示大量NETs聚集物，其成分为无细胞DNA、细胞外瓜氨酸化组蛋白H3和中性粒细胞弹性蛋白酶。

在免疫显微镜的相差成像下，血栓表现为血管腔内边界清晰的结构。然而，在任何对照样本中均未检测到血栓。该图像显示了在488纳米波长下成像时，红细胞等凝块成分表现出强烈的自发荧光。

免疫标记后短暂淬灭自发荧光，可显著提高蛋白质共定位和中性粒细胞胞外诱捕网（NET）检测的灵敏度，即使在红细胞丰富的区域也是如此。固定时间的长短会影响某些抗原的免疫反应性。我们建议固定时间不要超过24小时，然后再进行脱水和石蜡包埋。

或者，可使用无甲醇的多聚甲醛，以减少甲醛氧化产生的甲酸和酮类所导致的假象。为防止使用同一种属来源的一抗时产生干扰，我们增加了额外的封闭步骤，以饱和二抗上任何剩余的结合位点。研究者必须设置阴性对照，包括同型抗体对照、省略一抗或免疫标记步骤的对照，以及来自无血栓形成的猫的生物学对照。

组织自发荧光会限制血栓中中性粒细胞胞外诱捕网的显微鉴定。研究者可通过使用远红荧光染料来最小化荧光干扰。该技术可成为研究其他兽医物种中中性粒细胞胞外诱捕网的有力工具。

这有助于更好地理解血栓形成的病理生理学机制。