成年大鼠复合再生性外周神经接口（C-RPNI）的制备

本方案的意义在于，通过使用生物性外周神经接口，能够同时实现运动神经信号的放大和传入性感觉神经的刺激。该技术可为截肢者提供类生命体的假肢装置，因为C-RPNI能够在同一外周神经接口内实现运动控制与感觉反馈的同步进行。许多截肢患者放弃使用先进的神经假体装置，原因是这些装置缺乏直观的控制性和有意义的感觉反馈。

该技术兼具两者优势，可防止假体装置被弃用。该技术可应用于肢体力量微弱或缺失、或存在感觉功能障碍的个体，有助于进一步深入了解能够提供精确且直观的肢体控制的反馈系统。在外周神经上实施手术较为困难，因为容错空间极小。

使用高质量的仪器并经常练习是确保成功的关键。手术技术通过文字形式进行传达和学习极为困难。观察构建制备过程中的每一步骤，是掌握该方法的关键。

为准备皮肤移植，在确认大鼠对脚趾夹捏无反应后，将眼膏涂抹于麻醉大鼠的眼睛上。使用电动剃毛器，剃除整个后肢下部、踝关节区域及足部侧面的毛发。用酒精-碘伏溶液依次消毒所选后肢足底部位，并再次用酒精进行清洁。

使用手持微型电机高速钻头配合可拆卸的圆形细粒度抛光石，以每分钟 4,000 转的速度打磨足底表面，去除表皮，同时滴加生理盐水以防止灼伤皮肤。深层真皮将呈现光泽外观，并伴有针尖样出血。在下肢应用止血带以减缓血流，然后使用 15 号手术刀锐性切除足底皮肤。

将皮肤置于生理盐水浸湿的纱布中以防止干燥，并用纱布包扎出血的足部以减缓出血。将皮肤置于解剖显微镜下，使用显微剪刀从皮片深层去除所有肌腱和结缔组织。去薄后的真皮移植物应略呈半透明状，仅包含真皮组织，大小约为 0.5 厘米 × 1 厘米。

然后将组织置于一块新的、用生理盐水浸湿的纱布中，直至进行构建制备。制备肌肉移植物时，使用15号手术刀从踝关节上方至膝关节下方，沿后肢下段前侧做纵向切口。分离皮下组织，暴露其下方的肌肉组织。

在切口的远端，暴露下肢肌肉的肌腱止点。胫骨前肌通常是其中最大且位置最靠前的肌肉。该肌肉的深面稍后方为趾长伸肌。

为了从该区域的其他肌腱中分离远端趾长伸肌腱，将镊子的两个尖端插入肌腱下方，打开镊子以施加向上的压力，使肌腱移位。操作肌腱时应导致所有脚趾同时伸展。使用锐利的虹膜剪进行远端肌腱切断，并使用肌腱剥离器钝性分离肌肉与其周围组织，向近端方向操作以寻找肌腱的起始点。

当能够观察到近端肌腱时，使用虹膜剪进行第二次肌腱切断术，并将肌肉移植物置于经生理盐水润湿的纱布中。为分离和准备腓总神经，需剃除一侧大腿的毛发，并用酒精-聚维酮碘-酒精顺序消毒暴露的皮肤。将麻醉后的大鼠置于手术显微镜下的加热垫上，标记切口位置，切口从坐骨切迹远端稍下方开始，延伸至膝关节下部，位于股骨下方并呈一定角度斜向远离股骨的方向。

然后使用15号手术刀沿标记切开下方的股二头肌筋膜。仔细分离股二头肌，到达股二头肌下方的间隙。确认腓总神经后，使用显微细尖镊子和显微剪刀，小心地将腓总神经从其他坐骨神经分支中分离出来。

远端及神经跨越膝关节表面处的残余结缔组织应彻底清除，使用显微剪刀锐性横断神经。随后仔细游离腓总神经上残余的结缔组织，并向近端分离神经，使其游离长度达约两厘米。神经组织较为脆弱，操作中的轻微失误亦可导致持久的功能缺损。

反复练习、使用精确的外科器械以及理想的手部位置和支撑是掌握该技术的关键。为制备C-RPNI构建体，将肌肉移植物置于解剖显微镜下，去除全部中央肌腱组织以及一小段中央的肌外膜，保留肌腱末端完整。使用8-0尼龙缝线及两个间断缝合针，将腓总神经横断端的神经外膜固定于肌肉移植物两侧去除了肌外膜的区域。

用6-0尼龙间断缝线在近端和远端将肌肉移植物固定于股骨骨膜，神经-肌肉接头朝向远离股骨的方向。在肌肉移植物肌外膜的下中央边缘处放置8-0尼龙缝线，将其固定于腓总神经外膜，从而使神经在肌肉移植物内形成一定的松弛度。将皮肤移植物置于肌肉移植物之上，使其完全覆盖神经及大部分肌肉，真皮深层边缘置于肌肉上。

修剪掉超出肌肉边缘的任何真皮组织，使用8-0尼龙间断缝线将皮肤移植物与肌肉移植物边缘作环周固定。以5-0铬制肠线连续缝合股二头肌筋膜覆盖于移植物表面，再以4-0铬制肠线连续缝合表层皮肤。随后用酒精棉片更换手术区域，涂抹抗生素软膏，然后将大鼠置于单独环境，提供独立的食物和饮水，并密切监测直至完全恢复卧位状态。

如果手术成功，三个月后暴露构建体将可见肌肉和皮肤已重新血管化，用镊子轻轻夹压构建体近端的腓总神经可引起明显的肌肉收缩。组织学分析应显示皮肤、神经和肌肉均存活。免疫染色还将显示运动神经和感觉神经分别重新支配至神经肌肉接头和感觉终器。

如示例所示，在C-RPNI构建后三个月和九个月时，可对这些结构进行体内电生理检测。此处展示了电生理检测过程中获得的单次及总和性复合肌肉动作电位以及复合感觉神经动作电位信号的图形化结果。肌肉移植物处结果不理想的表现为信号减弱，且缺乏典型的复合肌肉动作电位波形。

真皮组分水平出现次优结果通常表现为波形衰减并伴有显著的背景噪声。高质量的仪器至关重要。剪刀应锋利，镊子应为细尖头，以便精确操作真皮移植物和神经，避免损伤。

制备完成后，该方法可用于电生理研究，以进一步表征信号传导能力，从而更深入地了解传出和传入反馈回路。尽管C-RPNI能够实现感觉反馈，但尚不清楚是否可以建立用于本体感觉的闭环反馈系统。我们目前在实验室中正在解决这一问题。