Name: 功能化磁性纳米粒子的合成及其与侧双磷铁氧胺的结合及其细菌检测评价 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 15 min 3 s
Description: 学习功能化磁性纳米粒子的合成方法及其与去铁胺结合用于细菌捕获的技术。本实验展示二氧化硅包覆、氨基修饰及与嗜铁素偶联的完整流程，并验证其对小肠结肠炎耶尔森菌的捕获效果。

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作者衷心感谢德国图宾根大学的 Klaus Hantke 教授慷慨提供本研究所用的 Yersinia enterocolitica 菌株。本研究得到了西班牙国家科研署（AEI）资助的项目 AGL2015-63740-C2-1/2-R 和 RTI2018-093634-B-C21/C22（AEI/FEDER，欧盟）的支持，经费由欧洲联盟的 FEDER 计划共同资助。圣地亚哥-德孔波斯特拉大学和拉科鲁尼亚大学的研究工作还得到了加利西亚自治区政府（Xunta de Galicia）资助的 GRC2018/018、GRC2018/039 和 ED431E 2018/03 项目（CICA-INIBIC 战略研究组）的支持。最后，我们特别感谢 Nuria Calvo 为本视频方案录制配音所做出的重要贡献。

注意：对于在惰性气氛条件下进行的反应，所有玻璃器皿均预先在65 °C的烘箱中干燥，用橡胶隔垫密封，并用氩气吹扫三次。
1. 铁氧化胺偶联磁性纳米颗粒的合成
<ol>
	<li>Fe3O4 磁性纳米颗粒（MNPs）的合成
	<ol>
		<li>将 0.5 g Fe(acac)3 加入一个 20 mL 玻璃小瓶中，然后加入 10 mL 苯甲醇混合。</li>
		<li>将该混合物超声处理 2 分钟，随后转移至加热块中，在 180 °C 下加热 72 小时。</li>
		<li>反应完成后，让小瓶自然冷却，用 96% 乙醇冲洗纳米颗粒，并在 4000 x g 条件下离心 30 分钟。至少重复离心两次。</li>
		<li>使用钕铁硼（NdFeB）磁铁通过磁力吸引将纳米颗粒与上清液分离，并弃去残余溶剂。</li>
		<li>用 96% 乙醇重复步骤 1.1.4，并交替进行 40 kHz 超声处理 1 分钟，弃去上清液，直至溶剂变得澄清。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>磁性纳米颗粒的 SiO2 包覆（MNP@SiO2）
	<ol>
		<li>在圆底烧瓶中加入磁力搅拌子，制备 2 g MNP 在 80 mL 异丙醇中的悬浮液，然后依次加入 4 mL 21% 氨水、7.5 mL 蒸馏水和 0.56 mL 正硅酸四乙酯（TEOS）。</li>
		<li>在持续搅拌下于 40 °C 加热混合物 2 小时，然后超声处理 1 小时。</li>
		<li>用磁铁分离 MNP，弃去上清液，并将其分散于 30 mL 异丙醇中。</li>
		<li>重复步骤 1.2.1 和 1.2.2。</li>
		<li>用 96% 乙醇清洗磁力搅拌子以回收全部材料。</li>
		<li>使用磁铁通过磁力吸引将纳米颗粒与上清液分离。</li>
		<li>弃去上清液，并用 96% 乙醇交替超声清洗纳米颗粒三次。</li>
		<li>在室温下真空干燥纳米颗粒 12 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MNP@SiO2 与 (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）的功能化修饰
	<ol>
		<li>在惰性气氛下，用 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）冲洗上一步所得的 500 mg MNP@SiO2，然后在 40 kHz 条件下超声处理 1 分钟。弃去上清液后重复该过程三次。</li>
		<li>将颗粒重新悬浮于圆底烧瓶中，在磁力搅拌下加入 9 mL APTES。</li>
		<li>在 60 °C 下搅拌混合物 12 小时。</li>
		<li>弃去上清液，并用 96% 乙醇交替超声清洗纳米颗粒三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>去铁胺衍生物 feroxamine 的合成
	<ol>
		<li>将 100 mg（0.15 mmol）甲磺酸去铁胺盐和 53.0 mg（0.15 mmol）Fe(acac)3 溶解于 5 mL 蒸馏水中，在室温下搅拌过夜。</li>
		<li>在分液漏斗中用 20 mL 乙酸乙酯洗涤产物三次，然后使用旋转蒸发仪在减压下除去有机溶剂。</li>
		<li>将水相冷冻干燥，得到红色固体形式的 feroxamine。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>N-琥珀酰feroxamine 的合成
	<ol>
		<li>在惰性气氛下，向 50 mL 圆底烧瓶中加入 350 mg（3.50 mmol）琥珀酸酐至 100 mg（0.17 mmol）feroxamine 溶于 5 mL 吡啶的溶液中。</li>
		<li>在室温下搅拌反应混合物 16 小时。之后，使用旋转蒸发仪在减压下除去多余的吡啶，得到深红色固体。</li>
		<li>将粗反应产物溶于 3 mL 甲醇中。</li>
		<li>将甲醇溶液转移至 Sephadex 柱（20 mm 直径柱中填充 20 cm Sephadex），以 0.5 mL/min 流速洗脱。</li>
		<li>收集红色组分，并使用旋转蒸发仪在减压下除去甲醇。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>共轭物 MNP@SiO2@NH@Fa 的合成
	<ol>
		<li>在惰性气氛下，用 DMF 将 30 mg 干燥的 MNP@SiO2@NH2 冲洗两次，并在 100 mL 锥形瓶中于惰性气氛下超声处理 30 分钟。</li>
		<li>在惰性气氛下，于 50 mL 圆底烧瓶中制备以下混合物（Mix A）：N-琥珀酰feroxamine（200 mg，0.30 mmol）、苯并三氮唑-1-基-氧-三（二甲氨基）磷六氟磷酸盐（BOP，173 mg，0.45 mmol）、1-羟基苯并三氮唑（HOBt，46 mg，0.39 mmol）和 N,N-二异丙基乙胺（DIPEA，128.8 mg，1.21 mmol）溶于 10 mL DMF 中。</li>
		<li>在氩气保护的无水无氧条件下，将先前冲洗过的 MNP@SiO2@NH2 在 3 mL DMF 中超声悬浮（Mix B）。</li>
		<li>将混合物 A 逐滴加入混合物 B 中。</li>
		<li>将最终混合物在室温下置于轨道摇床上震荡过夜。</li>
		<li>使用磁铁将生成的共轭物（MNP@SiO2@NH@Fa）从悬浮液中分离。</li>
		<li>冲洗所得固体，并用 10 mL 乙醇超声清洗五次。</li>
		<li>在真空条件下干燥固体 24 小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用Y. enterocolitica菌株进行细菌检测以定量纳米颗粒对致病菌的捕获
<ol>
	<li>在无菌的 2 mL 管中，用 PBS 将所有中间纳米颗粒及最终偶联物配制成浓度为 1 mg/mL 的悬浮液。</li>
	<li>在 5 mL LB 肉汤中培养 Y. enterocolitica，于 37 °C 过夜培养。</li>
	<li>通过加入 50 µL 的 10 mM 2,2′-联吡啶，制备 5 mL 缺铁的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）。</li>
	<li>取 50 µL 上述过夜培养的 Y. enterocolitica 菌液接种至 5 mL 缺铁 TSB 中，于 37 °C 振荡培养，直至 OD600 达到 0.5‒0.8。</li>
	<li>取步骤 2.4 中获得的菌液 100 µL，加入含有 900 µL PBS 的 2.0 mL 管中，得到 1/10 的初次稀释液；再用相同方法从该稀释液制备 1/100 稀释液，使细菌浓度约为 1 × 106 菌落形成单位（CFU）/mL。</li>
	<li>在 2.0 mL 管中，向 1 mL 的 1/100 稀释菌悬液中加入 100 µL 浓度为 1 mg/mL 的纳米颗粒悬浮液，并用涡旋振荡器混匀。</li>
	<li>于 20 °C 培养 1 小时。</li>
	<li>使用磁铁分离 MNP/细菌聚集体，并小心弃去上清液。</li>
	<li>用 1 mL PBS 对分离的纳米颗粒进行两次洗涤，每次均使用涡旋振荡器混匀。</li>
	<li>将纳米颗粒重悬于 1 mL PBS 中，用于测定捕获的细菌数量（CFU/mL）。</li>
	<li>从前一步的悬浮液中连续制备四次 1/10 稀释液，直至获得 1 × 10-4 稀释度。</li>
	<li>取每种稀释液各 10 µL 点种于 TSB 琼脂平板上，于 37 °C 过夜培养。</li>
	<li>使用凝胶成像系统在透射白光模式下拍摄平板照片。利用适当的软件处理图像，放大局部区域以计数单个菌落数量。 
	注意：每种 MNP 中间体均进行了表征，以追踪合成过程的进展。首先，采用 X 射线衍射（XRD）分析裸 MNP 的晶体结构；随后，对各中间体进行傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析，以检测相应反应中发生的化学变化；同时进行拉曼光谱分析，以验证 FT-IR 光谱得出的结论。热重分析（TGA）用于估算含有有机材料的中间体的失重情况。各中间体的形貌和尺寸通过透射电子显微镜（TEM）进行观察。最后，X 射线光电子能谱（XPS）分析对于确定各 MNP 中间体表面原子的氧化态以及确认偶联产物 MNP@SiO2@NH@Fa 中共价键的形成至关重要。</li>
</ol>

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<li>Liana, A. E., Marquis, C. P., Gunawan, C., Gooding, J. J., Amal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T4+bacteriophage+conjugated+magnetic+particles+for+E.+coli+capturing%3A+Influence+of+bacteriophage+loading%2C+temperature+and+tryptone%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">T4 bacteriophage conjugated magnetic particles for E. coli capturing: Influence of bacteriophage loading, temperature and tryptone.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 151, 47-57 (2017).</li>
<li>Fang, W., Han, C., Zhang, H., Wei, W., Liu, R., Shen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+amino-functionalized+magnetic+nanoparticles+for+enhancement+of+bacterial+capture+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Preparation of amino-functionalized magnetic nanoparticles for enhancement of bacterial capture efficiency.</a> RSC Advances. 6, 67875-67882 (2016).</li>
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</ol>

我们无任何披露事项。

本方案描述了通过共价键将磁性纳米颗粒与铁载体去铁胺形成偶联物的合成方法。四氧化三铁的合成采用Pinna等人报道的方案5，随后进行二氧化硅包覆，以保护磁性核心在水相体系中免受腐蚀，减少聚集，并为后续功能化提供适宜的表面6。本研究对二氧化硅包覆过程进行了改进：与Li等人报道的三层包覆方法6不同，本方法中磁性纳米颗粒仅包覆两层二氧化硅（图2D），该包覆程度已足以满足后续与APTES的功能化反应步骤7。
去铁胺与三价铁形成配合物，因其在室温下数小时内易发生降解。获得铁配合物的最佳方法是使用乙酰丙酮铁，因其通过液-液萃取纯化过程极为简便，且可定量得到去铁胺铁。去铁胺铁性质稳定，可进一步修饰以获得 N-使用琥珀酸酐添加末端酸性基团作为连接臂，制备琥珀酰铁胺素。通过尺寸排阻色谱纯化，可去除多余的琥珀酸酐和琥珀酸 N</em...

利用磁性纳米颗粒（MNP）进行细菌检测的方法基于抗体、适配体、生物蛋白或碳水化合物与MNP的偶联物对病原菌的分子识别作用1。鉴于铁载体可被细菌外膜上的特异性受体识别，因此也可将其连接至MNP以提高检测特异性2。铁载体是一类参与细菌摄取Fe3+的小分子有机化合物3,4。目前尚未见有关铁载体与MNP偶联物的制备及其用于细菌捕获与分离效果评价的报道。
将磁性纳米颗粒与小分子偶联的合成过程中，一个关键步骤是选择两者之间的键合类型或相互作用方式，以确保小分子能够固定在磁性纳米颗粒（MNP）表面。因此，制备磁性纳米颗粒与铁氧胺（feroxamine）——一种被Yersinia enterocolitica识别的铁载体——偶联物的过程，重点在于构建可修饰的MNP表面，从而通过碳二亚胺化学方法将铁载体共价连接至MNP表面。为了获得均一的磁铁矿纳米颗粒（MNP），并改善成核过程和粒径控制，采用苯甲醇进行溶剂分解反应，并在无振荡的加热模块中完成5。随后，通过Stöber法形成二氧化硅包覆层，以提供保护作用，并提高纳米颗粒在水相介质中悬浮液的稳定性6。考虑到铁氧胺的结构特点，需引入氨基官能团，以制备适用于与铁载体偶联的功能化纳米颗粒（MNP@SiO2@NH2）。该目标通过溶胶-凝胶法实现，即利用(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷（APTES）与经二氧化硅修饰的纳米颗粒（MNP@SiO2）表面的羟基发生缩合反应而完成7。
同时，通过将市售的去铁胺与乙酰丙酮铁在水溶液中络合，制备了铁(III)去铁胺络合物。N-琥珀酰去铁胺通过去铁胺与琥珀酸酐反应获得，其上带有可作为连接基团的琥珀酰基团。
通过碳二亚胺化学法，在弱碱性介质中使用苯并三唑-1-基-氧-三（二甲氨基）磷六氟磷酸盐（BOP）和1-羟基苯并三唑（HOBt）作为偶联试剂，将MNP@SiO2@NH2与N-琥珀酰铁氧胺偶联，得到MNP@SiO2@NH@Fa8，以活化N-琥珀酰铁氧胺中的末端羧酸基团。
在对磁性纳米颗粒（MNPs）进行表征后，我们评估了未修饰及功能化磁性纳米颗粒捕获野生型（WC-A）以及缺失铁羟肟酸受体FoxA的Y. enterocolitica突变株（FoxA WC-A 12-8）的能力。将普通MNPs、功能化MNPs以及偶联物MNP@SiO2@NH@Fa分别与每种Y. enterocolitica菌株进行孵育。通过施加磁场将细菌-偶联物聚集体从细菌悬液中分离出来。分离得到的聚集体用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，重新悬浮于PBS中制备系列稀释液，随后进行平板培养以进行菌落计数。本实验方案详细展示了MNP@SiO2@NH@Fa的合成各步骤、所有中间产物及最终偶联物的结构表征，以及一种用于评估偶联物相对于中间产物特异性的简便细菌捕获检测方法。9

<table><tbody><tr><td>1-羟基苯并三唑水合物&lt;br/&gt; HOBT</td><td>Acros</td><td>300561000</td><td></td></tr><tr><td>2,2&amp;prime;-联吡啶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D216305</td><td></td></tr><tr><td>3-氨丙基三乙氧基硅烷 99%</td><td>Acros</td><td>151081000</td><td></td></tr><tr><td>氨水溶液 28% NH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>338818</td><td></td></tr><tr><td>苯并三唑-1-氧基三（二甲基氨基）磷六氟磷酸盐 BOP 试剂</td><td>Acros</td><td>209800050</td><td></td></tr><tr><td>苯甲醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>822259</td><td></td></tr><tr><td>甲磺酸去铁胺盐 >92.5% (TLC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9533</td><td></td></tr><tr><td>乙醇，无水，96%</td><td>Panreac</td><td>131085</td><td></td></tr><tr><td>乙酸乙酯，特纯，SLR，Fisher Chemical</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙酰丙酮铁(III) 97%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F300</td><td></td></tr><tr><td>LB肉汤（Lennox）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>N,N-二异丙基乙胺，99.5+%，AcroSeal</td><td>Acros</td><td>459591000</td><td></td></tr><tr><td>N,N-二甲基甲酰胺，99.8%，超干，AcroSeal</td><td>Acros</td><td>326871000</td><td></td></tr><tr><td>吡啶，99.5%，超干，AcroSeal</td><td>Acros</td><td>339421000</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex LH-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>LH20100</td><td></td></tr><tr><td>琥珀酸酐 >99%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>239690</td><td></td></tr><tr><td>正硅酸四乙酯 >99.0%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>86578</td><td></td></tr></tbody></table>

功能化磁性纳米颗粒的合成、与铁载体去铁胺的偶联及其在细菌检测中的应用评价

Synthesis of Functionalized Magnetic Nanoparticles, Their Conjugation with the Siderophore Feroxamine and its Evaluation for Bacteria Detection

本研究描述了磁性纳米颗粒的合成，其表面包覆二氧化硅（SiO2），随后使用（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APTES）进行氨基功能化，并通过琥珀酰基团作为连接臂与去铁胺（一种被Yersinia enterocolitica识别的铁载体）偶联的过程。
磁性纳米颗粒（MNP）中的磁铁矿（Fe3O4) 通过溶热法合成，并用 SiO 涂覆2 (MNP@SiO2) 采用Stöber法合成，随后经APTES功能化处理（MNP@SiO2@NH2）。随后，将去铁胺与MNP@SiO₂偶联。2@NH2 通过碳二亚胺偶联反应得到 MNP@SiO2@NH2@Fa. 通过八种不同方法对偶联物及中间体的形貌和性质进行了表征，包括粉末X射线衍射（XRD）、傅里叶变换红外光谱（FT-IR）、拉曼光谱、X射线光电子能谱（XPS）、透射电子显微镜（TEM）以及能量色散X射线（EDX）元素分布图。上述全面的表征结果证实了偶联物的成功形成。最后，为评估纳米颗粒的捕获能力与特异性，进行了细菌捕获实验检测 小肠结肠炎耶尔森菌.

为了确定每种中间体及最终偶联物的形貌和性质，需进行全面的结构表征。为此，采用XRD、FT-IR、拉曼光谱、TGA、TEM、EDX元素分布图以及XPS等技术，以证明偶联物的形成。通过X射线光电子能谱（XPS）获得的纳米颗粒表面原子的氧化态数据，是确认纳米颗粒与铁载体之间形成共价键的最关键证据。与这些结果一致，本实验方案具有可重复性。
将裸露的磁性纳米颗粒（MNP）、功能化的磁性纳米颗粒（MNPs）以及偶联物分别与每种Y. enterocolitica菌株在磷酸盐缓冲液（PBS）溶液中混合。利用磁铁将细菌-磁性纳米颗粒聚集体从悬浮液中分离。用PBS洗涤聚集体两次后，将其重新悬浮于PBS中，制备系列稀释液，并接种培养以进行菌落计数。
采用本方案制备的中间产物及最终偶联物通过多种技术进行表征，以展示合成过程中每一步发生的化学变化。红外光谱和拉曼光谱是监测合成各步骤的简便快速方法。在傅里叶变换红外（FT-IR）和拉曼光谱（见下文）中，出现对应于Si-O、C-Si-C、Fe-O、酰胺键O=C伸缩振动以及羟肟酸O=C-N伸...

本研究描述了磁性纳米颗粒的制备方法，其表面包覆 SiO2，随后使用（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APTES）进行氨基功能化，并通过琥珀酰基团作为连接臂与去铁胺偶联。此外，还详细描述了对所有中间产物纳米颗粒及最终偶联物进行的深入结构表征，以及利用Y. enterocolitica进行的细菌捕获实验。

在本研究中，磁性纳米颗粒的合成，经 SiO2 包覆后，再通过……进行氨基功能化

磁性纳米颗粒由于具有强磁性以及表面易于功能化，是分析科学和纳米医学的理想工具。本文首次报道了氨基功能化二氧化硅磁性颗粒与铁载体去铁胺形成的偶联物，并评估了其对光合物质的捕获能力。铁载体是一类在铁摄取机制中起关键作用的小分子有机化合物，可被细菌外膜上的特异性受体识别。本视频逐步展示了一种制备磁性铁纳米颗粒的高效方案。随后，这些纳米颗粒被二氧化硅包覆，以保护其分散性并保护磁性核心。最终得到的反应器表面被功能化修饰上氨基基团。合成与去铁胺偶联的磁性纳米颗粒。将0.5克Fe(acac)3加入20 mL玻璃小瓶中，然后加入10 mL苯甲醇混合。将此混合物超声处理2分钟。然后转移至加热块中，在180°C下加热72小时。用96%乙醇冲洗纳米颗粒。离心30分钟。使用钕磁铁通过磁力吸引将纳米颗粒从上清液中分离。弃去残余溶剂。弃去上清液，并交替进行超声处理，直至溶剂变得澄清。将2克磁性纳米颗粒（MNP）溶于80毫升异丙醇中制成悬浮液，加入4毫升21%氨水、7.5毫升蒸馏水和0.56毫升正硅酸乙酯（TEOS）。在持续搅拌条件下，将混合物于40°C加热2小时。然后，超声处理1小时。用磁铁分离磁性纳米颗粒（MNP），弃去上清液，将其分散于30毫升异丙醇中，按之前所述相同顺序加入氨水、蒸馏水和正硅酸乙酯（TEOS）。在持续搅拌条件下，将混合物于40 °C加热2小时。然后，超声处理一小时。取出并用适当方法清洗磁力搅拌子，以回收全部材料。弃去上清液，并用96%乙醇对纳米颗粒进行三次洗涤，每次洗涤交替进行超声处理。将纳米颗粒在室温下真空干燥12小时。用500毫克上一步骤获得的MNP@SIO2与二甲基甲酰胺冲洗，超声处理后弃去。将颗粒重新悬浮于圆底烧瓶中，用磁力搅拌子搅拌，并加入9毫升APTES。在60摄氏度下搅拌混合物12小时。弃去上清液，用96%乙醇洗涤纳米颗粒三次，每次交替进行超声处理。将100 mg去铁胺甲磺酸盐和53.0 mg乙酰丙酮铁溶解于5 mL蒸馏水中。室温下搅拌混合物过夜。在分液漏斗中用20 mL乙酸乙酯洗涤所得产物，重复三次。在减压条件下除去有机溶剂。冷冻干燥水相，得到去铁胺和一种红色固体。在50毫升圆底烧瓶中，将350毫克琥珀酸酐加入100毫克去铁胺溶于5毫升吡啶的溶液中。将所得混合物在室温下搅拌16小时。减压除去多余的吡啶。将反应粗产物溶于3毫升甲醇中。将甲醇溶液转移至LH-20柱中，以0.5 mL/分钟的流速进行洗脱。收集红色组分，并在减压下除去甲醇。用DMF将30 mg干燥的胺基功能化纳米颗粒冲洗两次，并将纳米颗粒置于100毫升锥形瓶中，在超声仪中处理30分钟。在50毫升圆底烧瓶中，将200毫克N-琥珀酰铁胺素、173毫克苯并三唑-1-基氧基三磷酸六氟磷酸盐（BOP）、46毫克1-羟基苯并三唑（HOBt）和128.8毫克N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）溶于10毫升DMF中，配制成溶液。在干燥且无氧条件下，将先前洗涤过的MNP@SiO2@NH2悬浮于3毫升DMF中，并进行超声处理。使用氩气氛围。将混合物A逐滴加入混合物B中。使用旋转摇床在室温下振荡最终混合物过夜。利用磁铁将形成的偶联物从悬浮液中分离。采用耶尔森菌（Y. enterocolitica）菌株进行细菌实验，以定量评估纳米颗粒对致病菌的分离与捕获效果。将所有中间纳米颗粒及最终偶联物用无菌管以1 mg/mL的浓度悬浮于磷酸盐缓冲液（PBS）中。在5 mL的Luria Bertani（LB）肉汤中培养耶尔森氏肠炎杆菌（Y. entorocolitica）过夜。通过加入50微升10 mM 2,2-联吡啶溶液，制备5 mL缺铁的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）。将5毫升缺铁TSB肉汤接种50微升小肠耶尔森菌（Y. enterocolitica）过夜培养物，在37°C条件下振荡培养，直至OD600达到0.5至0.8。取100微升过夜培养物，加入含有900微升PBS的试管中进行稀释，得到第一级1/10稀释液。然后，使用相同方法从第一次稀释液中制备1/100的稀释液，以获得浓度约为每毫升10的6次方菌落形成单位（Colony Forming Units per milliliter）的细菌细胞。向1毫升1/100稀释的细菌液中加入100微升（µL）浓度为1 mg/mL的纳米颗粒悬液。利用磁铁分离磁性纳米颗粒-细菌聚集体，并小心弃去上清液。使用涡旋振荡器用1毫摩尔PBS缓冲液将分离的纳米颗粒洗涤两次。从前一悬浮液中制备连续的4个1/10稀释液，直至得到10⁻⁴稀释度。将每个稀释液的10微升接种至TS琼脂平板上。使用凝胶成像仪在透射白光模式下拍摄平板照片。利用合适的软件处理图像，放大菌落斑点以计数单个菌落数量。为确认纳米颗粒与铁载体之间共价键的形成，我们采用傅里叶变换红外拉曼光谱（FT-IR Raman spectroscopy）监测合成过程，观察每一步中新官能团对应的新谱带的出现情况。采用透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）观察形貌和粒径。热重分析用于测量因添加有机材料而导致的重量损失。X射线光电子能谱（XPS）使我们能够分析表面原子的不同氧化态，并确认共价键的形成。最后，我们利用最终偶联物中的所有中间产物来检测其捕获细菌的能力，以评估它们作为生物传感器的特性。该实验方案旨在利用磁铁矿纳米颗粒的高生物相容性。通过二氧化硅包被可改善分散性，并保护磁性核心在水相介质中免于降解。同时提供一个可反应的表面，用于修饰氨基，这些氨基是通过碳二亚胺化学法共价结合酸修饰的铁载体（在此为N-琥珀酰铁胺）所必需的。对偶联物捕获细菌的能力进行了测试，结果显示菌落数量较少，且与中间产物相比无显著差异，这归因于PBS细菌悬液中因空间位阻效应引起的非特异性相互作用。

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Research

科研

JoVE Journal

Chemistry

化学

功能化磁性纳米粒子的合成及其与侧双磷铁氧胺的结合及其细菌检测评价

我们介绍一种使用美国食品药品监督管理局（FDA）批准的超顺磁性氧化铁（SPIO）——菲柔莫醇（Feraheme）对干细胞进行标记和追踪的技术。该细胞成像技术利用磁共振（MR）成像进行可视化，可便捷地用于患者干细胞移植成功或失败的长期监测与诊断。...

使用美国食品药品监督管理局批准的氧化铁纳米颗粒 Ferumoxytol 标记干细胞

本视频展示了一种利用纳米传感器检测食品和水样中细菌污染物的技术。该方法通过磁弛豫和荧光发射两种模式相结合，实现对目标致病菌的检测。...

利用磁荧光纳米传感器检测细菌污染

来源：Rhea Kang1, Gabby Mora1, Sherry Dunbar11Luminex, A DiaSorin Company,...

使用染料标记的磁性微球进行多重定量细菌检测

本文介绍一种合成具有强磁矩和强近红外（NIR）吸收能力的磁等离子体纳米颗粒的实验方案。该方案还包括通过抗体的Fc片段将抗体偶联到纳米颗粒上，适用于需要分子特异性靶向的各种生物医学应用。...

免疫靶向磁-等离子体纳米簇的合成

使用溶液法合成不对称的二茂铁化合物具有挑战性。本报告重点介绍通过固相合成法，采用简便且洁净的反应制备二茂铁-生物素生物偶联物的方法。实验表明，引入硫醇盐基团可赋予该化合物在金表面固定化的能力。...

通过固相树脂法合成不对称二茂铁衍生的生物共轭体系的方法学

微波技术可实现用于动脉粥样硬化斑块表征的氧化铁纳米颗粒的极快速合成。在纳米颗粒外侧使用氨基双膦酸盐可促进其在动脉粥样硬化区域的快速富集。...

微波驱动合成氧化铁纳米颗粒用于快速检测动脉粥样硬化

本文介绍了一种掺钴磁性铁蛋白的合成与阳离子化方案，以及利用阳离子化磁性铁蛋白快速磁化干细胞的方法。...

合成阳离子化磁铁蛋白用于细胞的超快速磁化

本实验方案的总体目标是合成一种功能性纳米传感器，通过结合磁弛豫和荧光发射两种模式，实现对特定目标病原菌的便携式、低成本且快速的检测。...

使用磁荧光纳米传感器进行食源性致病菌筛查：快速检测 E. Coli O157:H7

为了改进血清学诊断检测方法 结核分枝杆菌...

用于肺外结核检测的超顺磁性氧化铁纳米探针的合成、表征与应用

通过非水溶胶-凝胶法制备氧化铁纳米颗粒，并用阴离子短链分子或聚合物进行包覆。利用振动样品磁强计（VSM），展示了磁强测量技术在监测磁性纳米颗粒被人类干细胞摄取及发生生物转化过程中的应用。...

利用磁力测量法监测化学合成氧化铁纳米颗粒的细胞摄取及后续生物降解

在本研究中，我们提供了一种利用抗体对磁性纳米材料进行生物功能化的方案，以实现对特定细胞的靶向。作为示例，我们使用铁纳米线来靶向癌细胞。...

磁性纳米材料的生物功能化

学习功能化磁性纳米粒子的合成方法及其与去铁胺结合用于细菌捕获的技术。本实验展示二氧化硅包覆、氨基修饰及与嗜铁素偶联的完整流程，并验证其对小肠结肠炎耶尔森菌的捕获效果。

功能化磁性纳米颗粒的合成、与铁载体去铁胺的偶联及其在细菌检测中的应用评价

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