功能化磁性纳米颗粒的合成、与铁载体去铁胺的偶联及其在细菌检测中的应用评价

磁性纳米颗粒由于具有强磁性以及表面易于功能化，是分析科学和纳米医学的理想工具。本文首次报道了氨基功能化二氧化硅磁性颗粒与铁载体去铁胺的偶联物，并评估了其对光合物质的捕获能力。铁载体是一类在铁摄取机制中起关键作用的小分子有机化合物，可被细菌外膜上的特异性受体识别。

本视频逐步展示了一种制备磁性铁纳米颗粒的有效方案。随后，这些纳米颗粒被二氧化硅包覆，以保护其分散性并保护磁性核心。最终得到的反应器表面以氨基官能团进行修饰。

合成与去铁胺偶联的磁性纳米颗粒。在20 mL玻璃小瓶中加入0.5克Fe(acac)₃，然后加入10 mL苯甲醇混合。

将此混合物超声处理2分钟。然后转移至加热块中，在180°C下加热72小时。用96%乙醇冲洗纳米颗粒。

离心30分钟。使用钕磁铁通过磁力吸引将纳米颗粒从上清液中分离。弃去残余溶剂。

弃去上清液，并交替进行超声处理，直至溶剂变得澄清。将2克磁性纳米颗粒（MNP）悬浮于80毫升异丙醇中，加入4毫升21%氨水、7.5毫升蒸馏水和0.56毫升正硅酸乙酯（TEOS）。在持续搅拌条件下，将混合物于40摄氏度加热2小时。

然后，超声处理1小时。用磁铁分离磁性纳米颗粒（MNP），弃去上清液，将其分散于30毫升异丙醇中，按之前所述相同顺序加入氨水、蒸馏水和正硅酸乙酯（TEOS）。在持续搅拌条件下，将混合物于40 °C加热2小时。

然后，超声处理一小时。取出并用适当方法清洗磁力搅拌子，以回收全部材料。弃去上清液，并用96%乙醇对纳米颗粒进行三次洗涤，每次洗涤交替进行超声处理。

将纳米颗粒在室温下真空干燥12小时。用500毫克上一步得到的MNP@SIO2与二甲基甲酰胺冲洗。超声处理后弃去。

将颗粒重新悬浮于圆底烧瓶中，用磁力搅拌子搅拌，并加入9毫升APTES。在60摄氏度下搅拌混合物12小时。弃去上清液，用96%乙醇洗涤纳米颗粒三次，每次交替进行超声处理。

将100 mg去铁胺甲磺酸盐和53.0 mg乙酰丙酮铁溶解于5 mL蒸馏水中。室温下搅拌混合物过夜。在分液漏斗中用20 mL乙酸乙酯洗涤所得产物三次。

在减压条件下除去有机溶剂。将水相冷冻干燥，得到去铁胺和一种红色固体。在50毫升圆底烧瓶中，将350毫克琥珀酸酐加入100毫克去铁胺溶于5毫升吡啶的溶液中。

将所得混合物在室温下搅拌16小时。在减压条件下除去多余的吡啶。用3毫升甲醇溶解反应粗产物。

将甲醇溶液转移至LH-20柱中，以0.5 mL/分钟的流速进行洗脱。收集红色组分，并在减压条件下除去甲醇。用DMF将30 mg干燥的胺基功能化纳米颗粒冲洗两次，并将纳米颗粒置于100毫升锥形瓶中，在超声仪中处理30分钟。

在50毫升圆底烧瓶中，将200毫克N-琥珀酰铁胺素、173毫克苯并三氮唑-1-基氧基三(二甲氨基)磷鎓六氟磷酸盐（BOP）、46毫克1-羟基苯并三氮唑（HOBt）和128.8毫克N,N-二异丙基乙胺（DIPEA）溶于10毫升DMF中，配制成溶液。在干燥且无氧条件下，将先前洗涤过的MNP@SiO2@NH2悬浮于3毫升DMF中，并进行超声处理。使用氩气氛围。

将混合物A逐滴加入混合物B中，混匀。将最终混合物在室温下使用旋转摇床振荡过夜。利用磁铁将形成的偶联物从悬浮液中分离。采用耶尔森菌（Y. enterocolitica）菌株进行细菌实验，以定量检测纳米颗粒对致病菌的分离与捕获效果。

将所有中间纳米颗粒及最终偶联物用无菌管以 PBS 配制成 1 mg/mL 的悬浮液。在 5 mL 的 Luria Bertani（LB）肉汤中培养 Y.entorocolitica 过夜。通过加入 50 微升 10 mM 2,2-联吡啶溶液，制备 5 mL 缺铁的胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）。

将5毫升缺铁TSB肉汤接种50微升小肠耶尔森菌（Y. enterocolitica）过夜培养物，在37°C下振荡培养，直至OD600达到0.5至0.8。取100微升过夜培养物，加入含有900微升PBS的试管中进行稀释，得到1/10的第一步稀释液。

然后，使用相同方法从第一次稀释液中制备1/100的稀释液，使细菌细胞浓度约为每毫升10的6次方菌落形成单位（CFU/mL）。向1毫升1/100稀释的细菌液中加入100微升（µL）浓度为1毫克/毫升（mg/mL）的纳米颗粒悬液。利用磁铁分离磁性纳米颗粒-细菌聚集体，并小心弃去上清液。

使用涡旋振荡器用1毫摩尔PBS缓冲液将分离的纳米颗粒洗涤两次。从前述悬浮液中制备连续的4个1/10稀释液，直至得到10⁻⁴稀释度。将每个稀释液的10微升接种至TS琼脂平板上。

使用凝胶数字成像仪在透射白光模式下对平板进行拍照。利用合适的软件处理图像，放大菌落以便计数单个菌落数量。为确认纳米颗粒与铁载体之间共价键的形成，我们采用傅里叶变换红外拉曼光谱（FT-IR Raman spectroscopy）监测合成过程，观察每一步中新官能团对应的新谱带的出现情况。

采用透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）观察形貌和粒径。热重分析用于测量因添加有机材料引起的质量损失。X射线光电子能谱（XPS）使我们能够分析表面原子的不同氧化态，并确认共价键的形成。

最后，我们利用最终偶联物中的所有中间产物来测试其捕获细菌的能力，以确定它们作为生物传感器的特性。本实验方案旨在利用磁铁矿纳米颗粒的高生物相容性。通过二氧化硅包被可改善分散性，并保护磁性核心在水相介质中免于降解。

同时提供一个可反应的表面，用于修饰氨基，这些氨基是通过碳二亚胺化学法共价结合酸修饰的铁载体（在此为N-琥珀酰铁胺素）所必需的。对偶联物捕获细菌的能力进行了测试，结果显示菌落数量较少，且与中间产物相比无显著差异，这归因于PBS细菌悬液中因空间位阻效应引起的非特异性相互作用。