Name: 在小鼠中建立下腹部器官和后肢的原点闭路灌注 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-08-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: 学习小鼠下腹部原位灌注技术，用于研究膀胱、前列腺等器官的给药动力学与免疫相互作用。该方法避免传统离体灌注的局限性，为药物递送和免疫学研究提供新途径。

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本研究由以下项目资助：NIH 基金 CA194058（DS），Skaggs 药学院 ADR 种子基金项目（DS）；国家自然科学基金（项目编号 31771093）；吉林省国际科技合作项目（编号 201180414085GH）；中央高校基本科研业务费专项资金；吉林大学科学技术创新研究团队项目（2017TD-27，2019TD-36）。

本文所述所有方法均已获得科罗拉多大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 预热灌注系统
<ol>
	<li>手术前准备灌流系统，启动37 °C循环水浴，为所有带水套的组件（灌流液储液器、湿润室和盖子）提供恒温，其定制配置如图1A所示。确保管路清洁，必要时进行更换。为减少灌流液体积，可在湿润室内使用气泡捕获器作为灌流液储液器（图1B-6）。</li>
</ol>
2. 血管插管
<ol>
	<li>使用异氟烷兽用麻醉机对8-10周龄的BALB/c小鼠进行麻醉诱导，异氟烷浓度为3-5%，氧气流速为0.3 L/min。也可选用氯胺酮/赛拉嗪或其他类型的腹腔注射麻醉剂。通过两种方法评估麻醉深度：足趾夹捏反应和角膜反射。</li>
	<li>用双蒸水预湿带针的4-0丝线缝合线。</li>
	<li>将麻醉后的小鼠仰卧固定于泡沫板上，头部朝向术者，用胶带固定前肢和后肢。用异丙醇擦拭腹部，沿腹中线切开腹部 &#34;T&#34; 用剪刀塑形。用电凝法（烧灼）止住切口边缘的出血。</li>
	<li>将胃、空肠和结肠推向腹腔右侧，以暴露腹主动脉、下腔静脉以及髂总动脉和静脉、髂腰动脉和静脉。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用4-0丝线结扎雄性动物的髂腰动脉/静脉，以及雌性动物的卵巢动脉/静脉和髂腰动脉/静脉。图2 黄色线条）。</li>
	<li>在解剖显微镜下，用两根4-0丝线在腹主动脉和下腔静脉下方穿线（位置约在髂动脉和髂静脉上方1 cm处，两根线相距1 mm）， 图2），并在靠近髂血管的缝线处打一个松结（图2，白色虚线）。或者，也可使用6-0丝线缝合打结。</li>
	<li>在解剖显微镜下，使用持针器水平对齐并拉伸下腔静脉和腹主动脉。用24 G带翼保护型静脉留置针穿刺腹主动脉，按下按钮回缩针芯，将导管插入血管约5 mm。
	<ol>
		<li>用相同的方法处理下腔静脉，并在导管插入的血管周围打结固定两根缝线。 
		注意：针头容易刺穿血管，因此应保持血管拉直，并使针头与血管平行。当针头刺入血管约1毫米时，立即回撤针芯。腹主动脉位于下腔静脉下方，由于被结缔组织包裹，其管壁更薄且弹性更强。因此，主动脉对导管的夹持力较强，应先进行主动脉插管，再插管下腔静脉，以降低导管滑脱的风险。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用瞬干胶将导管固定于竖脊肌上，复位腹腔器官，在维持麻醉状态下结束手术。 
	注意：在灌注过程中，无法完全放回腹腔的器官需定期用灌注液湿润。</li>
</ol>
3. 建立体外灌流系统
<ol>
	<li>将小鼠转移至已预热至 37 °C 的水套式湿润腔室中，置于硅胶垫上，并用 19 G 针头将导管翼固定在垫上。</li>
	<li>用预热的灌注缓冲液（含 5% BSA 的乳酸林格液）填充动脉导管末端（入口），然后使用螺口连接器将导管末端与灌注进液管连接（图 1B，红色箭头）。 
	注意：使用止血钳夹持连接器，并用胶带固定管道，以避免移动导管。</li>
	<li>调节蠕动泵流速至 0.6 mL/min，并保持灌注出液端开放（图 1B，蓝色箭头）5–10 分钟，以通过静脉导管冲洗血液。出液导管中可能会出现一些血凝块；在关闭灌注回路前，用灌注缓冲液冲洗出这些凝块。</li>
	<li>使用螺口连接器将静脉导管末端与出液管连接，以闭合回路（图 1B）。此时，实施 CO2&#160;气体安乐死，并通过胸腔穿刺或其他方法确认死亡。</li>
	<li>用预热的盖子盖上湿润腔室。定期检查灌注液液面，必要时补充。灌注可持续最长 2 小时。 
	注意：建立闭合灌注系统需使用 5 mL 灌注液。若无泄漏或水肿，灌注液体积减少将少于 1 mL，无需额外添加缓冲液。为避免外周循环血栓引起的水肿，可在灌注最初 10 分钟使用含 0.002% 肝素的灌注缓冲液，但之后应更换为不含肝素的缓冲液，以防止切口边缘渗漏。</li>
	<li>必要时，可在任意时间向灌注储液器或注射端口加入所需试剂（图 1B-5）。例如，可在灌注结束前 2 小时向灌注液中加入 10 µL 浓度为 10 mg/mL 的 Hoechst33342 以标记细胞核，或在灌注结束前 30 分钟加入 50 µL 浓度为 1 mg/mL 的 DyLight 649 标记凝集素以标记血管内皮细胞。 
	注意：若计划使用 Hoechst 溶液标记骨髓，需在手术前 30 分钟预先注射小鼠。</li>
	<li>使用荧光试剂灌注后，再用灌注缓冲液冲洗 10 分钟，以最大限度降低背景荧光。</li>
</ol>
4. 灌注器官的分析
<ol>
	<li>采集包括睾丸、前列腺、膀胱、股骨、肌肉和皮肤（如足部）在内的器官。取约 1 mm3 大小的器官组织，置于两片玻璃载片之间压平。
	<ol>
		<li>使用倒置荧光共聚焦显微镜，配备 DAPI/Cy5 激发和发射滤光片（激发激光：DAPI，405 nm；Cy5，640 nm），采用放大倍数至少为 200 倍、数值孔径为 0.45 的物镜进行观察。</li>
		<li>或者，用 4% 甲醛溶液固定器官 24 小时，随后进行苏木精-伊红染色19。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为实现完整骨髓的观察，需制备骨窗：固定股骨或胫骨两端，用 19 G 针头的侧缘刮除皮质骨，暴露骨膜，注意保留一层薄薄的残余骨组织。将骨样本放置于盖玻片上，使骨窗面朝向玻璃，使用倒置荧光共聚焦显微镜，按照上述方法通过 DAPI 和 Cy5 通道进行成像。骨髓腔内的细胞及血管网络可被清晰观察到。</li>
</ol>

<ol><li>Ghaidan, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+year+follow-up+of+lung+transplantations+using+initially+rejected+donor+lungs+after+reconditioning+using+ex+vivo+lung+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiothoracic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Ten year follow-up of lung transplantations using initially rejected donor lungs after reconditioning using ex vivo lung perfusion.</a> Journal of Cardiothoracic Surgery. 14 (1), 125(2019).</li>
<li>Kabagambe, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Ex+vivo+Hypothermic+and+Normothermic+Perfusion+for+Assessment+of+High-risk+Deceased+Donor+Human+Kidneys+for+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Combined Ex vivo Hypothermic and Normothermic Perfusion for Assessment of High-risk Deceased Donor Human Kidneys for Transplantation.</a> Transplantation. 103 (2), 392-400 (2019).</li>
<li>Knaak, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technique+of+subnormothermic+ex+vivo+liver+perfusion+for+the+storage%2C+assessment%2C+and+repair+of+marginal+liver+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Technique of subnormothermic ex vivo liver perfusion for the storage, assessment, and repair of marginal liver grafts.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51419(2014).</li>
<li>Hems, R., Ross, B. D., Berry, M. N., Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gluconeogenesis+in+the+perfused+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Gluconeogenesis in the perfused rat liver.</a> Biochemical Journal. 101 (2), 284-292 (1966).</li>
<li>Nielsen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasopressin+increases+water+permeability+of+kidney+collecting+duct+by+inducing+translocation+of+aquaporin-CD+water+channels+to+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Vasopressin increases water permeability of kidney collecting duct by inducing translocation of aquaporin-CD water channels to plasma membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (4), 1013-1017 (1995).</li>
<li>Sutherland, F. J., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+blood+and+perfusion+fluid+perfused+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">The isolated blood and perfusion fluid perfused heart.</a> Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).</li>
<li>Schreiter, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+perfusion+system+emulating+in+vivo+conditions+in+noncirrhotic+and+cirrhotic+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">An ex vivo perfusion system emulating in vivo conditions in noncirrhotic and cirrhotic human liver.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 342 (3), 730-741 (2012).</li>
<li>Sevick, E. M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscous+resistance+to+blood+flow+in+solid+tumors%3A+effect+of+hematocrit+on+intratumor+blood+viscosity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Viscous resistance to blood flow in solid tumors: effect of hematocrit on intratumor blood viscosity.</a> Cancer Research. 49 (13), 3513-3519 (1989).</li>
<li>Duyverman, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isolated+tumor+perfusion+model+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">An isolated tumor perfusion model in mice.</a> Nature Protocols. 7 (4), 749-755 (2012).</li>
<li>Sears, H. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+perfusion+of+a+tumor-containing+colon+with+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Surg+Res%22%5BJournal%5D)">Ex vivo perfusion of a tumor-containing colon with monoclonal antibody.</a> J Surg Res. 31 (2), 145-150 (1981).</li>
<li>Duda, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+cells+facilitate+lung+metastasis+by+bringing+their+own+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21677-21682 (2010).</li>
<li>Kristjansen, P. E., Boucher, Y., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dexamethasone+reduces+the+interstitial+fluid+pressure+in+a+human+colon+adenocarcinoma+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Dexamethasone reduces the interstitial fluid pressure in a human colon adenocarcinoma xenograft.</a> Cancer Research. 53 (20), 4764-4766 (1993).</li>
<li>Sevick, E. M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+resistance+to+blood+flow+in+solid+tumors+perfused+ex+vivo%3A+effects+of+tumor+size+and+perfusion+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Geometric resistance to blood flow in solid tumors perfused ex vivo: effects of tumor size and perfusion pressure.</a> Cancer Research. 49 (13), 3506-3512 (1989).</li>
<li>Zhang, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+Maintenance+of+Primary+Human+Multiple+Myeloma+Cells+through+the+Optimization+of+the+Osteoblastic+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Ex vivo Maintenance of Primary Human Multiple Myeloma Cells through the Optimization of the Osteoblastic Niche.</a> PLoS One. 10 (5), (2015).</li>
<li>Di Buduo, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+flow+chamber+for+engineering+bone+marrow+architecture+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Modular flow chamber for engineering bone marrow architecture and function.</a> Biomaterials. 146, 60-71 (2017).</li>
<li>Lokerse, W. J. M., Eggermont, A. M. M., Grull, H., Koning, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+an+isolated+limb+infusion+model+for+investigation+of+drug+delivery+kinetics+to+solid+tumors+by+thermosensitive+liposomes+and+hyperthermia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of an isolated limb infusion model for investigation of drug delivery kinetics to solid tumors by thermosensitive liposomes and hyperthermia.</a> Journal of Controlled Release. 270, 282-289 (2018).</li>
<li>Tietjen, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle+targeting+to+the+endothelium+during+normothermic+machine+perfusion+of+human+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle targeting to the endothelium during normothermic machine perfusion of human kidneys.</a> Science Translational Medicine. 9 (418), (2017).</li>
<li>Ternullo, S., de Weerd, L., Flaten, G. E., Holsaeter, A. M., Skalko-Basnet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolated+perfused+human+skin+flap+model%3A+A+missing+link+in+skin+penetration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The isolated perfused human skin flap model: A missing link in skin penetration studies.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 96, 334-341 (2017).</li>
<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2008, 4986(2008).</li>
<li>Hekman, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Dual-Modality+Imaging+in+Renal+Cell+Carcinoma%3A+An+Ex+vivo+Kidney+Perfusion+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Targeted Dual-Modality Imaging in Renal Cell Carcinoma: An Ex vivo Kidney Perfusion Study.</a> Clinical Cancer Research. 22 (18), 4634-4642 (2016).</li>
<li>Graham, R. A., Brown, T. R., Meyer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex+vivo+model+for+the+study+of+tumor+metabolism+by+nuclear+magnetic+resonance%3A+characterization+of+the+phosphorus-31+spectrum+of+the+isolated+perfused+Morris+hepatoma+7777%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">An ex vivo model for the study of tumor metabolism by nuclear magnetic resonance: characterization of the phosphorus-31 spectrum of the isolated perfused Morris hepatoma 7777.</a> Cancer Research. 51 (3), 841-849 (1991).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

所述回路可用于探究多种研究问题，例如不同血清成分和组织屏障在药物递送或免疫细胞与干细胞迁移过程中的作用。可通过向灌注液中添加不同的药物递送系统（如脂质体和纳米颗粒），以研究生理和生化因素在递送过程中的影响。灌注持续时间可根据所研究的组织、科学目标以及灌注液的组成而变化。本文展示了使用含乳酸盐和白蛋白的林格氏液作为基础灌注介质进行长达2小时灌注的结果。需要指出的是，本研究的目标是建立灌注回路，而非开发或优化用于支持器官/组织最佳功能和氧合的灌注介质与条件。此前的文献已广泛研究了营养物质、维生素、激素和血细胞的添加，数十篇关于人和动物组织的研究论文中已描述了多种灌注介质和氧合方案7,9,10,11,12,13,<sup clas...

离体器官灌注最初是为了研究移植用器官的生理学而开发的1,2,3，它使得在不受机体其他系统干扰的情况下理解器官功能成为可能。例如，离体肾脏和心脏灌注在阐明血流动力学基本原理以及血管活性药物作用方面具有重大价值，而肝脏灌注则对理解代谢功能（包括健康与病变组织中的药物代谢）至关重要4,5,6,7。此外，灌注研究对于评估拟用于移植的器官的存活能力与功能也极为关键。在癌症研究领域，多个研究团队已报道了利用小鼠、大鼠以及新鲜切除的人体组织进行的离体肿瘤灌注模型8,9。在某些离体肿瘤灌注实验中，肿瘤被植入卵巢脂肪垫，以促使肿瘤供血血管从肠系膜动脉生长10。Jain 团队利用结肠腺癌的离体灌注开展了开创性研究，以深入理解肿瘤的血流动力学特征及转移机制8,11,12,13。其他创新性的体外工程化装置还包括基于96孔板的灌注系统，用于培养原代人多发性骨髓瘤细胞14，以及用于构建骨髓结构并研究其功能的模块化流动腔室系统15。
除了生理学和病理学研究外，器官灌注还被用于研究药物递送的基本原理。例如，有研究团队描述了离体大鼠肢体灌注，并研究了脂质体在移植性肉瘤中的蓄积情况16；另一组则采用离体人肾灌注，研究纳米颗粒对血管内皮的靶向性17。Ternullo 等人则利用离体灌注的人体皮瓣作为接近体内条件的皮肤药物渗透模型18。
尽管在大型器官和组织的灌注方面已取得进展，但目前尚无关于小鼠原位灌注模型的报道能够同时满足以下条件：a）绕过肝脏、脾脏和肾脏等清除器官；b）包含盆腔器官、皮肤、肌肉、雄性生殖器官、膀胱、前列腺以及骨髓。由于这些器官体积较小，供血血管也极为细小，体外插管并建立灌注回路在技术上难以实现。小鼠是癌症、免疫学研究及药物递送领域最重要的动物模型。若能实现对小鼠小型器官的灌注，将有助于回答有关药物向这些器官（包括植入于盆腔的肿瘤，如膀胱、前列腺、卵巢和骨髓中的肿瘤）递送的重要问题，同时也可促进对这些器官基本生理功能及免疫学疾病机制的研究。为弥补这一空白，我们开发了一种适用于小鼠的原位灌注回路，该方法有望避免组织损伤，相较于离体器官灌注，更适用于功能性研究。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>带LED光源的支架式3.5x-90x体视变倍显微镜</td><td>Amscope</td><td>SKU: SM-3BZ-80S</td><td></td></tr><tr><td>二氧化碳，USP级</td><td>Airgas healthcare</td><td>19087-5283</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>NIKON</td><td>ECLIPSE Ti2</td><td></td></tr><tr><td>一次性无菌高温电灼笔</td><td>FIAB</td><td>F7244</td><td></td></tr><tr><td>带气泡捕集器的湿润腔室（图1中第6部分）</td><td>Harvard Apparatus</td><td>733692</td><td>定制为灌注液容器；同时实现恒压灌注</td></tr><tr><td>带石英窗口的湿润腔室盖（图1中第3部分）</td><td>Harvard Apparatus</td><td>733524</td><td>维持腔室温度</td></tr><tr><td>带金属管热交换器的湿润腔室</td><td>Harvard Apparatus</td><td>732901</td><td>水套式湿润腔室，带盖，用于维持灌注液和小鼠体温</td></tr><tr><td>Olsen-Hegar带剪线器缝合针持</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>125014</td><td></td></tr><tr><td>氧气，压缩，USP级</td><td>Airgas healthcare</td><td>C2649150AE06</td><td></td></tr><tr><td>滚压泵（图1中第4部分）</td><td>Harvard Apparatus</td><td>730113</td><td>将灌注液输送至湿润腔室中的插管</td></tr><tr><td>SCP plugsys伺服控制灌注系统（图1中第1部分）</td><td>Harvard Apparatus</td><td>732806</td><td>控制灌注速度</td></tr><tr><td>硅胶垫</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>硅胶管套装（图1中箭头所示）</td><td>Harvard Apparatus (TYGON)</td><td>733456</td><td></td></tr><tr><td>学生标准型镊子</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>91100-12</td><td></td></tr><tr><td>手术剪</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>14001-14</td><td></td></tr><tr><td>湿润腔室用台板</td><td>Harvard Apparatus</td><td>734198</td><td></td></tr><tr><td>循环水浴恒温器（图1中第2部分）</td><td>Harvard Apparatus</td><td>724927</td><td>为所有水套组件提供循环水浴</td></tr><tr><td>三通旋塞阀（图1中第5部分）</td><td>Cole-Palmer</td><td>30600-02</td><td></td></tr><tr><td>兽用麻醉机</td><td>Highland</td><td>HME109</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>19G BD PrecisionGlide针头</td><td>BD</td><td>305186</td><td>用于固定Insyte Autoguard带翼针头及刮擦皮质骨</td></tr><tr><td>4-0丝线缝合线</td><td>Keebomed-Hopemedical</td><td>427411</td><td></td></tr><tr><td>6-0丝线缝合线</td><td>Keebomed-Hopemedical</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>滤器（0.2 &amp;micro;m）</td><td>ThermoFisher</td><td>42225-CA</td><td>用于过滤5% BSA-RINGER&amp;rsquo;S溶液</td></tr><tr><td>永久性记号笔</td><td>Staedtler</td><td>342-9</td><td></td></tr><tr><td>注射器（10 mL）</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-2E</td><td></td></tr><tr><td>注射器（60 mL）</td><td>BD</td><td>309653</td><td>用于过滤5% BSA-RINGER&amp;rsquo;S溶液</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1%伊文思蓝（w/v）磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.5）</td><td>Sigma</td><td>314-13-6</td><td></td></tr><tr><td>10%缓冲福尔马林</td><td>velleyvet</td><td>36692</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c小鼠（8–10周龄）</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Baxter Viaflex乳酸林格氏液</td><td>EMRN Medical Supplies Inc.</td><td>JB2324</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Thermo Fisher</td><td>11021-037</td><td></td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯胶</td><td>Krazy Glue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DyLight-649-凝集素</td><td>Vector Laboratories,Inc.</td><td>ZB1214</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（70% (vol/vol)）</td><td>Pharmco</td><td>111000190</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Piramal Enterprises Limited</td><td>66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr></tbody></table>

建立小鼠下腹部器官与后肢的原位闭路灌注技术

Establishing In Situ Closed Circuit Perfusion of Lower Abdominal Organs and Hind Limbs in Mice

离体灌注是研究分离器官（如肝脏、肾脏）功能的重要生理学工具。然而，由于小鼠器官体积较小，对骨骼、膀胱、皮肤、前列腺及生殖器官进行离体灌注具有挑战性或不可行。本文首次报道了一种在小鼠体内建立的下肢原位灌注回路，该回路可包含上述组织，同时绕过主要的清除器官（肾脏、肝脏和脾脏）。通过在髂动脉和静脉上方插管腹主动脉和下腔静脉，并电凝外周血管，建立灌注回路。灌注通过蠕动泵进行，灌流液流速可维持长达2小时。使用荧光凝集素和Hoechst溶液进行原位染色，证实微血管系统得到了成功灌注。该小鼠模型可成为研究病理过程、药物递送机制、循环肿瘤细胞在肿瘤内外的迁移/转移，以及免疫系统与灌注器官和组织相互作用的有力工具。

通过插管8-10周龄小鼠的腹主动脉和下腔静脉，建立封闭循环灌注系统，同时将灌注缓冲液体积控制在10 mL以内。图3A显示了使用含Hoechst 33342和DyLight 649-凝集素的Ringer溶液灌注组织后的共聚焦图像。肌肉、骨髓、睾丸、膀胱、前列腺和足部皮肤均显示出有效的细胞核和血管染色。图3B显示了常温灌注3小时后各器官的苏木精-伊红染色结果。
<img alt="电泳系统，凝胶电泳装置；蛋白质分离实验，实验室分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60847/60847fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1. 简化的灌流装置示意图。 （A）该系统包括（1）压力/流速控制器，（2...

本文描述了一种对小鼠下半身进行原位灌注的实验方案，包括膀胱、前列腺、性器官、骨骼、肌肉和足部皮肤。

离体灌注是一种重要的生理学工具，用于研究分离器官（如肝脏、肾脏）的功能。同时，由于其体积较小……

本方案可用于解答有关药物递送以及我们循环系统中所包含器官内免疫相互作用的问题。该技术能够对传统离体方法难以灌注的器官进行灌注，同时避免主要清除器官的干扰。在开始手术前，将循环水浴锅及所有水套组件预热至37摄氏度。确认导管已清洁，并在湿润 chamber 中使用气泡陷阱作为灌流液储液池，以减少灌流液体积。进行插管操作时，确认八至十周龄雄性麻醉的Bulb C57BL/6小鼠对足底反射无反应，并将小鼠仰卧位固定于泡沫板上，头部朝向六点钟方向。用胶带固定动物的四肢，并用异丙醇擦拭腹部。在腹部做T形切口，使用电凝止血以控制切口边缘的出血。将胃、空肠和结肠推向腹部右侧，以暴露腹主动脉、下腔静脉以及髂总动脉和髂腰动静脉。在解剖显微镜下，使用4-0丝线结扎卵巢动脉和髂腰动脉及其伴行静脉。在髂动脉和静脉上方约1厘米处，将两根4-0丝线分别穿过腹主动脉和下腔静脉，两根丝线相距1毫米。然后，在靠近髂血管的那根丝线上打一个松结。使用持针器水平对齐并拉伸下腔静脉和腹主动脉。保持血管拉伸状态，用24号带翼保护套管静脉导管穿刺腹主动脉。当针头刺入血管约1毫米时，立即按下按钮回缩针芯，并将导管插入血管内约5毫米。以相同方式将导管插入下腔静脉5毫米处。然后用缝线结扎已插管的血管。接着涂抹速干胶以固定导管与竖脊肌的位置，并将腹腔器官复位。建立灌注系统时，将小鼠置于水套式保湿腔室内的硅胶垫上，并用19号针头将导管翼固定在垫上。用预热的灌注缓冲液填充动脉导管入口。使用止血钳和螺旋连接器将导管入口连接至导管，并用胶带固定入口处的灌注管路。将蠕动泵的流速调节至0.6毫升每分钟，并保持灌注流出端开放5到10分钟，以通过静脉导管冲洗出血液。部分凝块会出现在出口导管中，需用灌注缓冲液冲洗去除凝块，然后使用螺口连接器将静脉导管末端与出口管路连接，以闭合回路。随后，将湿润腔室用预热的盖子盖住，继续灌注最多两小时，并定期检查灌注液的液位。此处展示了用含有 Hoechst 33342 和 DyLight-649 标记的凝集素的林格液灌注后获得的共聚焦图像。肌肉、骨髓、睾丸、膀胱、前列腺和足部皮肤通常表现出有效的细胞核和血管染色。在正常体温下灌注三小时后，这些组织的苏木精-伊红染色显示器官灌流成功，且无明显组织损伤。该模型可用于在生理无关的环境中研究药物摄取途径。例如，可用于研究血清成分在药物蓄积中的作用。我们正在利用该系统研究脂质体在皮肤中蓄积的机制。

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在小鼠中建立下腹部器官和后肢的原点闭路灌注

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哥廷根小型猪的基本外科技术：插管、膀胱导管插入、股血管导管插入及经心灌注

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一种改良的小鼠异位心脏移植方案，符合当代无菌技术、麻醉与镇痛标准

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利用灌流小鼠肝脏模型定量测定肝葡萄糖生成、尿素生成及脂解作用

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通过原位肝脏灌注评估小鼠胰岛素清除率

学习小鼠下腹部原位灌注技术，用于研究膀胱、前列腺等器官的给药动力学与免疫相互作用。该方法避免传统离体灌注的局限性，为药物递送和免疫学研究提供新途径。

建立小鼠下腹部器官与后肢的原位闭路灌注技术

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