Name: 无标记基因删除由絮凝血盒等位基因交换突变在衣原体沙眼 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 了解FLAEM技术在沙眼衣原体中进行无标记基因删除的方法。该技术通过同源重组实现精准基因敲除，避免极性效应，为研究基因功能提供可靠工具。

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本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家过敏与传染病研究所（NIAID）公共卫生服务基金的资助（基金编号 A1065530 和 Al124649），资助对象为 K.A. Fields。

1. 设计并构建针对目标基因的具有同源臂的pSUmC-4.0质粒
<ol>
	<li>确定目标基因上下游约 3 kb 的区域，作为同源重组的 5' 和 3' 同源臂图1).</li>
	<li>设计PCR引物以：1）从衣原体基因组DNA扩增约3 kb的5'同源臂，以及2）在Sall限制性酶切位点消化后，包含一段长度为15–30 bp、特异性针对pSUmC-4.0的突出末端。确保引物中与pSUmC-4.0重叠区域的熔解温度为55 °C，且整个引物的发夹结构熔解温度 &#60;35 °C</li>
	<li>设计PCR引物以：1）从衣原体基因组DNA扩增约3 kb的3'同源臂，以及2）在SbfI限制性酶切位点处切割后，包含一段特异性针对pSUmC-4.0的15–30 bp突出端。确保引物中与pSUmC-4.0重叠区域的熔解温度为55 °C，且整个引物的发夹结构熔解温度 &#60;35 °C</li>
	<li>设计PCR筛选引物，用于在DNA组装反应后扩增每个同源臂插入pSUmC-4.0载体的片段16设计引物时应使其退火位置位于限制性酶切位点外侧约 500 bp 处，以便即使插入失败也能轻松观察到 PCR 产物（图1).</li>
	<li>从新提取的衣原体基因组DNA中，通过PCR扩增约3 kb的5'和3'同源臂，可使用一至两个反应以获得足量的片段用于后续DNA组装。具体反应体系和循环条件请遵循DNA聚合酶生产商的说明书。</li>
	<li>验证两条PCR产物的大小是否正确，并确认反应中无任何污染条带。取每种PCR反应产物5 μL，在1% DNA琼脂糖凝胶上电泳。</li>
	<li>采用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀法纯化并浓缩PCR片段。
	<ol>
		<li>将所有3' PCR反应液汇集至一个1.5 mL离心管中，并用无核酸酶水补至终体积200 µL2O. 对5'端PCR反应重复此过程。</li>
		<li>向每根试管中加入 200 µL 苯酚，涡旋振荡 30–60 秒。将每根试管在微量离心机中离心 &#62;21,000 × g 室温（RT）下孵育20分钟。</li>
		<li>将每支试管中的水相上层转移至新的1.5 mL离心管中，向每支管中加入十分之一体积的3 M醋酸钠，然后轻轻弹击管壁混匀。</li>
		<li>向每管中加入3倍体积的100%乙醇，轻轻振荡混匀。将两管样品于-80 °C孵育20分钟。</li>
		<li>通过将每根试管离心使DNA沉淀 &#62;21,000 × g 室温下离心5分钟。弃去上清液。</li>
		<li>用100 µL 70%乙醇洗涤DNA沉淀。将每个离心管以适当转速离心 &#62;21,000 × g 室温下离心5分钟。弃去上清液。</li>
		<li>用100 µL 100%乙醇再次洗涤DNA沉淀。将每个离心管以相同条件离心 &#62;21,000 × g 离心5分钟，室温。弃上清液。</li>
		<li>让沉淀完全风干，然后在12 µL无核酸酶的H₂O中轻轻重悬DNA。2轻轻振荡混匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按照生产商的说明书，用1单位Sall和1单位SbfI在20 µL反应体系中消化500 ng pSUmC-4.0载体。将反应体系孵育约3小时或过夜，以确保载体完全消化。</li>
	<li>通过酚/氯仿抽提和乙醇沉淀法纯化并浓缩已消化的骨架，方法如前所述（步骤 1.7.1–1.7.9）。</li>
	<li>将消化后的 pSUmC-4.0 载体与 5' 和 3' 同源臂 PCR 产物按 0.01 pmol pSUmC-4.0 与每条同源臂各 0.09 pmol 的比例混合。根据制造商说明书，通过 DNA 组装反应连接这些片段。</li>
	<li>转化50 µL电转感受态细胞 E. coli 使用1 µL DNA组装反应产物转化后涂板 E. coli 将150 µL菌液涂布于含100 µg/mL链霉素的LB琼脂平板上，每板涂布150 µL。37 °C过夜培养。</li>
	<li>第二天，使用倒置荧光显微镜筛选菌落的绿色和红色荧光。每个琼脂平板预期可见5–30个菌落。</li>
	<li>挑取5–10个菌落，接种于4 mL含有100 µg/mL链霉素的LB液体培养基中。37 °C、250 rpm振荡培养过夜。</li>
	<li>使用过夜 E. coli 培养物，进行小规模DNA纯化。用50 µL无核酸酶的H₂O洗脱DNA。2O.</li>
	<li>使用PCR筛选引物（在步骤1.4中设计）扩增每个插入片段，以确认各同源臂是否成功插入pSUmC-4.0载体中。若DNA组装成功，在1% DNA琼脂糖凝胶中，5'和3'臂区域均应观察到约4 kb的PCR产物；若出现约1 kb的PCR产物，则表明插入失败。 
	注意：如果在双片段组装反应中同源臂的插入不成功，则分别进行两次组装反应，依次插入5'臂和3'臂。首先仅用Sall酶切载体后与5'臂进行组装，然后用SbfI酶切载体以组装3'臂。</li>
	<li>转化大坝-/dcm- 感受态 E. coli 使用200 ng带有双侧同源臂的pSUmc-4.0进行组装。将转化后的细菌接种于含100 µg/mL壮观霉素的LB琼脂平板上，每板涂布25 µL。于37 °C过夜培养。预期获得20–200个菌落。</li>
	<li>按照步骤1.13所述，对平板上的红色和绿色荧光菌落进行筛选。</li>
	<li>接种含有壮观霉素（100 µg/mL）的100 mL LB液体培养基，分别挑取红色和绿色菌落进行培养，用于大规模DNA纯化。于37 °C、250 rpm振荡条件下过夜培养。</li>
	<li>收获培养物，并使用大规模DNA纯化方法纯化DNA。
	<ol>
		<li>将纯化的质粒 DNA 重悬于 100 µL NF-H 中2O. 总DNA产量至少为2 µg/µL较为理想 C. trachomatis 转化</li>
		<li>对5'和3'同源臂区域进行测序，以确保在转化前正确组装至pSUmC-4.0中 C. trachomatis.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 通过等位基因交换进行基因敲除：使用含同源臂的 pSUmC 4.0 质粒转化C. trachomatis
<ol>
	<li>将常用于培养沙眼衣原体（Chlamydia）的McCoy细胞（小鼠成纤维细胞）以每孔1 × 106个细胞的密度接种至两块6孔板中，加入培养基#1。在37 °C、5% CO2条件下孵育，直至细胞形成融合单层（约24小时）。</li>
	<li>在1.5 mL离心管中加入足够感染6孔板12个孔（MOI为2）的沙眼衣原体（C. trachomatis）野生型L2血清型原体（EBs）。在&#62;20,000 × g条件下离心30分钟以沉淀EBs，弃去上清液。</li>
	<li>通过将EBs轻轻重悬于600 µL CaCl2缓冲液中启动衣原体转化，然后向管中加入24 µg pSUmC-4.0质粒（含同源臂）。轻弹混匀。室温孵育30分钟，每10分钟轻弹混匀一次。</li>
	<li>将转化液加入24 mL Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，轻轻吹打混匀。将2 mL接种液加入6孔板中已形成融合单层的McCoy细胞各孔中，在20 °C、900 × g条件下离心1小时进行感染。</li>
	<li>移除接种液，每孔更换2 mL RPMI培养基#2。在37 °C、5% CO2条件下继续孵育。</li>
	<li>感染后至少7小时但不超过12小时，更换为每孔2 mL的选择培养基#1。自感染时起，在37 °C继续孵育48小时。</li>
	<li>收获细菌并传代至新的McCoy细胞单层。
	<ol>
		<li>使用细胞刮轻轻刮取McCoy细胞单层，使细胞悬浮于培养基中。将每孔材料转移至2 mL离心管中。在4 °C条件下，以&#62;20,000 × g离心30分钟，沉淀细胞材料。</li>
		<li>移除并弃去上清液。用移液器轻轻吹打，将细胞沉淀重悬于1 mL HBSS中。</li>
		<li>在4 °C、200 × g条件下离心5分钟，沉淀细胞碎片。将上清液转移至含融合单层McCoy细胞的新孔中。每孔额外加入1 mL HBSS，使总体积达到2 mL/孔。</li>
		<li>在20 °C、900 × g条件下离心1小时进行感染。感染后立即更换为选择培养基#1。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>每48小时将细菌传代至新的McCoy细胞单层（第2.7节），连续传代三次或以上，直至在感染后24小时（24 hpi）通过倒置荧光显微镜观察到红色和绿色包涵体。</li>
	<li>一旦观察到红色和绿色包涵体，继续使用选择培养基#2对单层细胞进行传代（第2.7节）。</li>
	<li>持续传代单层细胞，直至在感染后24小时（24 hpi）观察到仅含绿色包涵体（第3代或更晚），表明pSUmC-4.0载体已丢失，且loxP选择盒已整合入基因组。</li>
	<li>选取一个仅含绿色包涵体的孔进行富集传代。将其他同样含有仅绿色包涵体的孔收获后，用蔗糖-磷酸-谷氨酸缓冲液（SPG）冷冻保存。
	<ol>
		<li>为富集仅含绿色包涵体的样本，按步骤2.7的方法将6孔板中一孔的单层细胞进行传代；但在完成细胞碎片离心（步骤2.7.3）后，将上清液转移至含12 mL HBSS的锥形管中。将此接种液以每孔2 mL接种至两块6孔板，于20 °C、900 × g条件下离心60分钟。</li>
		<li>为冷冻保存其他孔，按步骤2.7.1收获单层细胞，但将沉淀重悬于1 mL SPG缓冲液而非HBSS中。完成细胞碎片离心（步骤2.7.3）后，将上清液转移至1.5 mL冻存管中，在-80 °C条件下冷冻保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在检测到仅含绿色包涵体后，再经过一至两次传代使其MOI达到0.5–1.0，按步骤2.11.2所述方法将单层细胞收获至SPG缓冲液中。分装为每管50 µL，置于1.5 mL离心管中，在-80 °C冷冻保存。</li>
	<li>滴定仅含绿色包涵体的细菌，根据标准滴定方案17测定每微升形成包涵体的菌落单位数（inclusion forming units/µL）。</li>
</ol>
3. 通过有限稀释法对含有loxP侧翼筛选盒的仅绿色C. trachomatis缺失突变体进行克隆分离
<ol>
	<li>在384孔组织培养板中，每孔加入50 µL生长培养基#1，接种约2,000个细胞/孔的McCoy细胞。于37 °C、5 % CO2条件下培养约24小时，直至细胞融合。</li>
	<li>将一份仅含绿色荧光的细菌样品用HBSS稀释，使每20 mL中含有约50个EB。将稀释后的接种物转移至储液板。
	<ol>
		<li>将384孔板倒置并用力轻弹，使培养基完全脱离，弃入废液容器中。使用多通道移液器向每孔加入50 µL C. trachomatis接种物。于20 °C、900 × g条件下离心1小时进行感染。 
		注意：轻弹时注意力度，避免单层细胞脱落。若细胞过度融合，则更容易脱落。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过轻弹去除接种物，每孔更换50 µL生长培养基#2。将培养板置于37 °C、5 % CO2条件下培养。 
	注意：此阶段选择盒已稳定整合至基因组中，因此不再需要使用壮观霉素进行抗生素筛选。</li>
	<li>培养5–12天后，使用落射荧光倒置显微镜或高内涵筛选平台，鉴定含有绿色荧光包涵体的单个孔。</li>
	<li>用P-10吸头刮取仅含绿色荧光包涵体的孔，将孔内全部内容物转移至含有2 mL HBSS的离心管中。轻轻混匀后，将2 mL接种物接种至6孔板中新鲜的融合McCoy单层细胞上进行感染。 
	注意：在识别含包涵体的孔时，由于初始包涵体扩增，包涵体会呈现簇状分布。若某孔内存在多个独立簇，则表明该孔可能被多个EB初始感染。此类孔不应采集，某些情况下可能需要通过连续稀释进行多轮克隆分离。</li>
	<li>将6孔板于20 °C、900 × g条件下离心1小时进行感染。弃去接种物，每孔加入2 mL生长培养基#2。于37 °C、5 % CO2条件下培养48小时。</li>
	<li>重复步骤2.11–2.13，以富集、冻存并滴定克隆群体。</li>
	<li>采用先前所述的qPCR方法12，验证从克隆分离的C. trachomatis中靶基因的缺失情况。</li>
</ol>
4. 用 pSU-Cre 转化 C. trachomatis FRAEM 突变株以启动切除两侧含 loxP 位点的筛选盒
<ol>
	<li>使用克隆分离的 C. trachomatis FRAEM 突变株、pSU-Cre 载体和选择培养基 #3，在 6 孔板中重复前述转化过程（步骤 2.1–2.8）。 
	注意：成功的转化表现为包涵体呈现红色和绿色荧光。
	<ol>
		<li>使用倒置落射荧光显微镜观察，持续传代直至检测到仅呈红色荧光的包涵体，这表明已丢失选择盒（通常需传代两到三次）。继续传代直至仅呈红色荧光的包涵体富集至 MOI 约为 0.5。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过在 384 孔板中进行有限稀释法克隆分离仅呈红色荧光的包涵体（方法如前所述，步骤 3.1–3.8）；但所有步骤均使用选择培养基 #3。</li>
	<li>传代富集克隆群体至 MOI 达到 0.1。富集完成后，将维持培养基更换为生长培养基 #2，以启动 pSU-Cre 载体的丢失（约需传代三到四次）。</li>
	<li>通过克隆分离获得无荧光的细菌（步骤 3.1–3.8）；但需手动使用明场显微镜扫描培养板以检测包涵体。随后进行富集并冻存细菌（步骤 2.11–2.12）。</li>
	<li>如前所述12，采用实时定量 PCR、Western 印迹和全基因组 DNA 测序方法对突变菌株进行筛选。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述利用FLAEM技术在C. trachomatis中构建无标记基因缺失的方法，可实现对非必需基因的靶向删除，并消除因插入筛选标记盒所引发的极性效应。该方案依赖于将精心设计的5'和3'同源臂插入pSUmC 4.0自杀型载体，高效转化C. trachomatis，并对分离获得的突变菌株进行细致筛选。通过该方法成功实现基因组编辑的细菌将不具荧光，且在目标基因缺失位点仅保留一个loxP疤痕序列。此外，该方法有望被进一步优化，用于在同一C. trachomatis菌株中连续靶向多个基因。
精心设计5'和3'同源臂并将其插入自杀载体，是克隆过程的第一步，也是最关键的一步。研究发现，3 kb的同源臂可提供最高效的等位基因重组效率。尽管插入这些同源臂会产生较大且有时难以操作的载体，但较短的同源臂效果较差，其中约2 kb是获得成功所需的最小长度。在进行DNA组装时，利用Sall和Sbfl限制性酶切位点可实现便捷的一步式构建反应。
其他克隆方法（如插入式PCR）在插入同...

Chlamydia trachomatis 是细菌性性传播疾病的首要致病原，对人类健康构成重大负担。每年有超过一亿人感染 C. trachomatis1。尽管该感染可导致盆腔炎、异位妊娠和/或不孕等严重生殖健康问题，但约70%的女性感染者无明显症状。疾病后遗症与 C. trachomatis 感染引发的免疫病理反应直接相关2。目前尚无有效的疫苗问世，因此，阐明细菌毒力因子及其他细菌基因产物的功能是一个重要而紧迫的研究课题。
作为胞内细菌，宿主细胞侵袭、胞内复制、子代释放以及逃避免疫应答是其关键的生命过程。C. trachomatis 会形成一种由寄生性膜包围的空泡结构，称为包涵体（inclusion），用于胞内发育。包涵体的建立及其他许多关键过程依赖于通过III型分泌系统（T3SS）分泌效应蛋白来实现3。由于C. trachomatis遗传操作困难，这些分泌效应蛋白的功能在多年内一直难以阐明。与E. coli不同，许多经典克隆技术不适用于Chlamydia。主要限制因素包括转化效率低、缺乏如sacB等反向筛选报告基因，以及质粒稳定性差等问题。虽然E. coli质粒通常只需复制起点和适当的选择压力即可长期稳定维持，但C. trachomatis质粒还需要额外的八个开放阅读框（pgp1-8）才能维持稳定，这些基因位于L2血清型天然pL2质粒上4。
近年来，已开发出多种基因工具以适应Chlamydia独特的生物学特性，但仍存在一些局限性5,6,7。通过甲基磺酸乙酯（EMS）处理进行化学诱变可引入错义突变，或（较少见地）导致核苷酸转换，从而引入提前终止密码子，产生无义突变8。转座子插入适用于基因破坏，但目前在Chlamydia研究中的技术仍较为繁琐且耗时9。EMS处理和转座子诱变技术均产生随机突变，需要严格的筛选方法来分离突变菌株。通过插入II型内含子（例如TargeTron）实现基因破坏的方法可进行定向诱变；然而，该方法受限于效率，且插入位点并不总能被准确预测10。
荧光报告等位基因交换诱变（Fluorescence-reported allelic exchange mutagenesis, FRAEM）是一种用于靶向基因删除并同时插入筛选盒的策略，该筛选盒可提供抗生素抗性及荧光报告基因11。然而，FRAEM 可能因筛选盒对下游基因产生的极性效应而变得复杂，尤其是在靶向多顺反子操纵子内的基因时。FLAEM（Floxed cassette allelic exchange mutagenesis）是一种新型遗传学方法，旨在缓解此前在 FRAEM 筛选盒中观察到的筛选盒诱导的极性效应12。FLAEM 利用 Cre-loxP 基因组编辑技术去除筛选盒，从而恢复下游基因的表达。该筛选盒包含抗生素抗性基因和绿色荧光蛋白（GFP），并经重新设计在其两侧添加了loxP位点。这些loxP位点在 Cre 重组酶存在的情况下可发生重组，导致筛选盒从基因组中被切除13。研究表明，该策略在靶向tmeA基因进行删除时，可有效缓解筛选盒引起的极性效应12,14。
FRAEM 和 FLAEM 两种方法均使用相同的自杀型载体 pSUmC 4.0，该载体可通过诱导表达 pgp6 实现条件性维持。pgp6 的表达此前已被证明对质粒的保留至关重要，因此被用于控制质粒的维持11,15。当在培养基中添加无水四环素（aTc）以诱导 pgp6 表达时，该载体可在 C. trachomatis 中稳定存在；而在缺乏 aTc 的情况下，载体则会丢失。目标基因的缺失通过基因与筛选盒之间的等位交换实现。目标基因上下游各 3 kb 的区域作为同源臂用于重组，这些同源臂被克隆至 pSUmC 4.0 载体中，位于筛选盒的两侧。通过荧光报告可观察到成功的 C. trachomatis 转化及重组事件：载体骨架上携带的 mCherry 和筛选盒内的 gfp 分别产生红色和绿色荧光包涵体。一旦从培养基中去除 aTc，仅显示绿色荧光的包涵体即表明自杀载体已丢失，筛选盒成功整合至细菌基因组，重组事件完成。
FLAEM 是通过将表达 Cre 重组酶的载体 pSU-Cre 转化至新构建的突变菌株中，从而实现对 FRAEM 方法的扩展。Cre 重组酶可介导 loxP 位点之间的重组并切除筛选盒。重组事件通过荧光报告进行指示。pSU-Cre 载体编码 mCherry，因此成功转化表现为在 gfp 表达的包涵体基础上增加红色荧光。在无筛选压力条件下培养时，Cre 介导的 loxP 位点重组发生，筛选盒被丢失，并表现为仅显示红色荧光的包涵体。与 pSUmC-4.0 类似，通过诱导表达 pgp6 可条件性维持 pSU-Cre 质粒的存在。当撤去 aTc 和抗生素筛选后，质粒被清除，最终获得的无标记缺失菌株不具荧光。该方法解决了筛选盒引起的极性效应问题。

<table><tbody><tr><td>琼脂糖</td><td>KSE Scientific</td><td>BMK-A1705</td><td>分子生物学级</td></tr><tr><td>盐酸无水四环素</td><td>ACROS Organics</td><td>233131000</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 缓冲液</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 7.4, 50 mM 二水氯化钙</td></tr><tr><td>二水氯化钙</td><td>Sigma</td><td>C7902-500G</td><td>适用于细胞培养</td></tr><tr><td>放线菌酮</td><td>Sigma</td><td>7698-1G</td><td></td></tr><tr><td>dam&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt;/dcm&lt;sup&gt;-&lt;/sup&gt; 感受态 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>New England BioLabs</td><td>C2925H</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ATCC</td><td>4-X</td><td>经无菌过滤且适用于细胞培养检测</td></tr><tr><td>谷氨酸</td><td>Sigma</td><td>G8415-100G</td><td>L-谷氨酸</td></tr><tr><td>生长培养基 #1</td><td></td><td></td><td>RPMI 1640 培养基，添加 10 % (vol/vol) 热灭活胎牛血清 (FBS)。</td></tr><tr><td>生长培养基 #2</td><td></td><td></td><td>RPMI 1640 培养基，添加 10 % (vol/vol) 热灭活胎牛血清 (FBS) 和 1 &amp;micro;g/mL 放线菌酮</td></tr><tr><td>Hanks' 平衡盐溶液 (HBSS) (1x)</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>热灭活胎牛血清（经鉴定合格的一次性使用）(FBS)</td><td>Gibco</td><td>A38402-02</td><td></td></tr><tr><td>McCoy 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1696</td><td></td></tr><tr><td>Monarch 质粒小量提取试剂盒</td><td>New England BioLabs</td><td>T1010S</td><td>小规模 DNA 纯化</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S3139-250G</td><td>磷酸二氢钠</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5136-500G</td><td>磷酸氢二钠</td></tr><tr><td>NEB 10-beta 电转感受态 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 细胞</td><td>New England BioLabs</td><td>C3020K</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA 组装克隆试剂盒</td><td>New England BioLabs</td><td>E5520S</td><td>Gibson 组装试剂盒</td></tr><tr><td>青霉素 G 钠盐</td><td>Sigma</td><td>P3032-10MU</td><td>适用于细胞培养的生物试剂</td></tr><tr><td>QIAGEN 质粒大量提取试剂盒</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td>大规模 DNA 纯化</td></tr><tr><td>Q5 热启动高保真 DNA 聚合酶</td><td>New England BioLabs</td><td>M0515</td><td>片段 PCR 聚合酶</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基 (1x)</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>含 2 mM L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>Sall-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3138S</td><td></td></tr><tr><td>Sbfl-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3642S</td><td></td></tr><tr><td>筛选培养基 #1</td><td></td><td></td><td>RMPI 10 % FBS, 1 &amp;micro;g/mL 放线菌酮, 500 &amp;micro;g/mL 壮观霉素，以及溶解于 DMSO 的 50 ng/mL 无水四环素</td></tr><tr><td>筛选培养基 #2</td><td></td><td></td><td>RMPI 10 % FBS, 1 &amp;micro;g/mL 放线菌酮, 500 &amp;micro;g/mL 壮观霉素</td></tr><tr><td>筛选培养基 #3</td><td></td><td></td><td>RPMI 10 % FBS, 1 &amp;micro;g/mL 放线菌酮, 50 ng/mL aTc, 以及 0.6 &amp;micro;g/mL 青霉素</td></tr><tr><td>乙酸钠缓冲液</td><td>Sigma</td><td>S7899-100ML</td><td>3M</td></tr><tr><td>SOC 增殖培养基</td><td>New England BioLabs</td><td>B9020SVIAL</td><td></td></tr><tr><td>盐酸壮观霉素五水合物，细胞培养级</td><td>Alfa Aesar</td><td>J61820</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma</td><td>S1888-1KG</td><td>适用于细胞培养的生物试剂</td></tr><tr><td>蔗糖-磷酸-谷氨酸缓冲液 (SPG)</td><td></td><td></td><td>37.5 g 蔗糖, 1.25 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.18 g NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.36 g 谷氨酸，溶于 500 ml 组织培养级水中</td></tr><tr><td>Tris</td><td>AMRESCO</td><td>0497-5KG</td><td>超纯级</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>0.25%</td></tr><tr><td>水</td><td>Sigma</td><td>W3500-500ML</td><td>经无菌过滤，生物试剂，适用于细胞培养</td></tr></tbody></table>

无标记基因缺失通过chlamydia trachomatis中带loxp盒的等位交换诱变实现

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis 是一种专性胞内病原体，历史上对其遗传操作一直存在困难。由于缺乏有效的遗传工具，目前对 C. trachomatis 建立和维持其特异性胞内生态位机制的研究进展有限。幸运的是，近年来在遗传操作技术方面取得了一系列新进展。其中一项是荧光报告等位基因交换诱变技术（FRAEM）。该方法可实现靶向基因删除，并同时插入编码抗生素抗性及绿色荧光蛋白（GFP）的筛选盒。然而，当靶向多顺反子操纵子内的基因时，由于可能对下游基因产生极性效应，该策略的应用会变得复杂。本文所述的“loxP位点修饰筛选盒等位基因交换诱变技术”（FLAEM）正是为减轻筛选盒引起的极性效应而开发的。FLAEM利用Cre-loxP基因组编辑技术，在通过等位基因交换实现靶向删除后，将筛选盒切除。最终获得的菌株包含一个或多个编码序列的无标记基因缺失。该技术有助于直接评估基因功能，并拓展了 C. trachomatis 遗传操作工具的应用范围。

利用FLAEM技术在C. trachomatis中实现无标记基因删除的方法依赖于精细的克隆和转化技术。成功的等位基因重组是关键的第一步，需要将同源臂序列鉴定并插入到pSUmC-4.0克隆载体中（图1）。无标记基因删除的第二个关键步骤是通过Cre-lox基因组编辑技术去除荧光报告基因和抗生素筛选盒，如图2所示。图3标注了完成上述每一步所使用的载体。图4展示了从野生型C. trachomatis出发，构建无标记基因删除突变株的转化策略示意图。
代表性数据如图5和图6所示，其中以tmeA为基因敲除靶点。利用FRAEM技术构建了C. trachomatis tmeA...

本文介绍了一种利用带有loxP位点的盒式基因交换突变技术（FLAEM）在Chlamydia trachomatis中实现靶向、无标记基因删除的方法。

无标记基因缺失通过Chlamydia trachomatis中带loxP盒的等位交换诱变实现

沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）是一种专性细胞内病原体，历史上对其遗传操作一直存在较大困难。近年来在……方面取得了决定性进展。

条件性基因盒等位交换诱变是一种重要的方法，因为基因敲除是一种有价值的工具，可用于理解基因产物的功能。该技术的主要优势在于，它能够实现靶向基因的删除，同时不会对下游基因产生极性效应。确定目标基因上下游约三千碱基的区域，作为同源重组的5'端和3'端同源臂，并按照文本方案中的说明设计引物。通过 PCR 从新提取的衣原体基因组 DNA 中扩增出约三千碱基的 5' 和 3' 同源臂，使用一至两次反应，以获得足量的片段用于后续 DNA 组装。按照文本方案所述纯化并浓缩 PCR 产物后，根据生产商说明书，在 20 微升反应体系中用 1 单位 Cell One 和 1 单位 SbfI 消化 500 纳克 pSUmC-4.0 载体。将经消化和纯化的 pSUmC-4.0 载体与 5' 和 3' 同源臂的 PCR 产物按 0.01 皮摩尔载体与每条同源臂各 0.09 皮摩尔的比例混合。根据制造商的说明书，在DNA组装反应中连接各片段。取1微升DNA组装反应产物，转化50微升电转感受态E.coli。将转化后的E.coli涂布于含有100微克/毫升链霉素的LB琼脂平板上。将平板在37摄氏度下孵育过夜。第二天，使用落射荧光倒置显微镜筛选发出绿色和红色荧光的菌落。每个琼脂平板预计可观察到5至30个菌落。在对所选菌落进行过夜液体培养孵育后，使用PCR筛选引物扩增每个插入片段，以确认各同源臂已插入载体中。按照文本方案所述，将通常用于培养沙眼衣原体的鼠成纤维细胞McCoy细胞接种至两个六孔板中。在1.5毫升离心管中，加入足以以MOI为2的感染复数感染六孔板12个孔的沙眼衣原体野生型血清型L2的原体（EBs），体积应充足。在大于20,000 × g条件下离心EBs 30分钟，沉淀菌体，弃去上清液。用600 µL氯化钙缓冲液轻柔重悬EBs以启动衣原体转化。然后向管中加入12 µg pSUmC-4.0质粒（含同源臂），通过轻弹管壁轻轻混匀溶液。将试管在室温下孵育30分钟，每10分钟轻轻摇动混匀。将转染溶液加入24毫升HBSS中，通过轻柔吹打混匀。将接种物各2毫升转移至六孔板中汇合的McCoy细胞的每个孔中。在20摄氏度下，以900 × g离心一小时进行感染。移除接种液，每孔加入2毫升RPMI生长培养基2号。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。感染后至少七小时但不超过十二小时，将培养基更换为每孔两毫升的选择培养基一。自感染时起，在37摄氏度继续孵育48小时。使用细胞刮轻轻刮取McCoy单层细胞，使细胞悬浮于培养基中，收集并传代细菌至新鲜的McCoy细胞单层上。将每个孔中的材料转移至一个2 mL离心管中。在4 °C条件下，于微量离心机中以超过20,000 ×g的离心力离心30分钟，使细胞材料沉淀。弃去上清液后，通过轻轻吹打，将细胞沉淀重悬于1 mL HBSS中。在4°C条件下，以200 ×

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科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

无标记基因删除由絮凝血盒等位基因交换突变在衣原体沙眼

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