Name: 无目标液相色谱-质量光谱学-小麦粒基代谢代谢学分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 了解小麦籽粒代谢组学分析方法，采用乙腈提取与反相液相色谱-质谱联用技术，结合第三流动相增强分离效果。该方法可检测更广泛的代谢物，助力解析遗传、环境与管理因素对产量和品质的交互影响。

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作者谨此感谢西澳大利亚州长农业与食品研究员计划（西澳大利亚州政府就业、旅游、科学与创新部）以及州长研究员西蒙·库克教授（科廷大学和默多克大学数字农业中心）。田间试验和谷物样品采集得到了西澳大利亚州政府“地区特许权使用费”计划的支持。我们感谢Grantley Stainer和Robert French对田间试验所做出的贡献。同时感谢由NCRIS资助的澳大利亚生物平台（Bioplatforms Australia）为设备提供的资金支持。

该方法适用于30个样品（每个样品约150粒种子）。本实验采用了10种不同田间种植小麦品种的三个生物学重复。
1. 谷物的制备
<ol>
	<li>从 -80 °C 冷冻保存处取出样品（完整谷粒）。 
	注意：如果需要收集多个生长季的样品，建议在收获后尽快对种子进行冻干处理。这可以最大限度地减少因不同储存时间可能导致的代谢物浓度变化。操作时，将种子转移至 15 mL 塑料离心管中（约 300 粒种子可填满管子），并用铝箔覆盖。用针在铝箔上刺两到三个小孔，然后将完整谷粒过夜冻干（约 24 小时）。此时可将样品重新放回 -80 °C 超低温冰箱，或直接进行下一步操作。</li>
	<li>使用实验室搅拌机以高速模式研磨种子，每次 20 秒，共运行两次。 
	注意：本实验方案所用的搅拌机需至少加入约 150 粒种子，才能使样品达到刀片高度，从而获得相对均一的研磨效果。</li>
	<li>将搅拌机从底座上取下，轻敲搅拌机侧面，使研磨较粗的颗粒重新暴露于样品表面。较粗的材料可弃去或另行保存。</li>
	<li>将搅拌机中呈粉末状的细磨材料转移至 2 mL 塑料微量离心管中。 
	注意：在处理不同样品之间，需用去离子水清洗搅拌机，并用液相色谱-质谱（LC-MS）级甲醇冲洗。确保搅拌机完全干燥后再进行下一个样品的处理。</li>
	<li>将研磨好的细粉样品放回冷冻保存，或直接进入下一步（代谢物提取）。</li>
</ol>
2. 提取溶剂的制备
注意：提取溶剂需在进行提取的当天配制。
<ol>
	<li>每种标准品至少配制 2 mL 浓度为 1 mg/mL 的溶液。使用乙腈（ACN）配制 2-氨基蒽、咪康唑和 d6-反式肉桂酸；使用水配制 13C6-山梨醇。</li>
	<li>取每种 1 mg/mL 的标准品溶液各 2 mL，加入一个 100 mL 容量瓶中。</li>
	<li>用乙腈定容至容量瓶刻度线。确保最终 100 mL 乙腈溶液中每种内标物的浓度均为 20 µg/mL：即 2-氨基蒽、咪康唑、13C6-山梨醇和 d6-反式肉桂酸。</li>
</ol>
3. 代谢物提取
<ol>
	<li>称取200 mg精细研磨的谷物样品，放入2 mL微量离心管中。</li>
	<li>向200 mg精细研磨的谷物样品中加入500 µL提取溶剂。</li>
	<li>使用匀浆器以6,500 rpm的速度进行两次、每次20秒的混匀处理。</li>
	<li>在4 °C条件下以16,100 x g离心5分钟。</li>
	<li>将上清液转移至一个2 mL塑料管中。</li>
	<li>重复步骤3.1至3.5的操作两次，使上清液总体积约为1.5 mL。</li>
	<li>涡旋混匀上清液。</li>
	<li>取每种提取物等体积（55 µL）分别转移至另一个2 mL离心管中，制备混合谷物提取物样品。</li>
	<li>取50 µL提取物分装至玻璃小瓶中。 
	注意：此时提取物可于-80 °C冷冻保存，或直接进入下一步并继续进行LC-MS分析。</li>
</ol>
4. LC-MS 分析用溶液的制备
注意：对于浓酸，务必将酸加入水或溶剂中。
<ol>
	<li>配制50 mL的1 M甲酸铵储备液。称取3.153 g甲酸铵，转移至50 mL容量瓶中，用LC-MS级H2O定容至刻度线。</li>
	<li>配制1 L流动相A，组成为10 mM甲酸铵、0.1%甲酸。取约500 mL LC-MS级水加入1 L容量瓶中，加入10 mL 1 M甲酸铵储备液和1 mL甲酸，再用LC-MS级H2O定容至刻度线。转移至1 L试剂瓶中，超声15 min以脱气。</li>
	<li>配制1 L流动相B，组成为含10 mM甲酸铵的乙腈:异丙醇:水（79:20:1）混合溶剂，并含0.1%甲酸。向1 L容量瓶中加入200 mL异丙醇，再加入10 mL 1 M甲酸铵储备液和1 mL甲酸，最后用乙腈定容至刻度线。转移至1 L试剂瓶中，超声15 min以脱气。 
	注意：应先将1 M甲酸铵溶解于异丙醇（IPA）中，再加入乙腈（ACN）。甲酸铵在乙腈中不溶。</li>
	<li>配制1 L流动相C，组成为异丙醇:乙腈:水（89:10:1）含10 mM甲酸铵。向1 L容量瓶中加入约500 mL异丙醇、10 mL 1 M甲酸铵储备液和100 mL乙腈，再用异丙醇定容至刻度线。转移至1 L试剂瓶中，超声15 min以脱气。</li>
	<li>LC-MS系统清洗溶剂的配制
	<ol>
		<li>更换泵头清洗液为新鲜溶液。使用50%甲醇、10%异丙醇，或根据仪器制造商推荐的其他溶液。</li>
		<li>配制强洗液和弱洗液，用于样品进样前后清洗进样流路。强洗液使用等体积乙腈（ACN）和异丙醇（IPA）混合；弱洗液使用10%乙腈（ACN）溶液。本实验方案及样本数量下，分别需准备约500 mL强洗液和1 L弱洗液，分装于不同试剂瓶中。</li>
		<li>将强洗和弱洗的针洗体积分别设置为600 µL和1800 µL。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 用于液相色谱-质谱分析的样品制备
<ol>
	<li>根据生产商提供的标准操作程序配制400 ng/µL的亮氨酸脑啡肽，将7.5 mL水加入含有3 mg亮氨酸脑啡肽的12 mL小瓶中。分装为50 µL每份，于-80 °C冷冻保存。</li>
	<li>配制100 mL含5%乙腈（ACN）并含有200 ng/mL亮氨酸脑啡肽的溶液（加入50 µL的400 ng/µL亮氨酸脑啡肽）。应在进行液相色谱-质谱（LC-MS）分析的当天配制。</li>
	<li>向第3步制备的50 µL样品分装液中加入950 µL含有注射标准品亮氨酸脑啡肽的5%乙腈溶液。</li>
	<li>涡旋振荡以充分混匀所制备的样品。</li>
</ol>
6. 液相色谱-质谱联用仪设置
注意：仪器和数据采集方法设置的详细说明见制造商的用户指南。以下概述了一般性指南以及本方案特有的细节。以下步骤可在采集数据前的任何时间完成。
<ol>
	<li>打开一个LC-MS硬件配置文件。</li>
	<li>按照表1中所述设置色谱方法。确保液相色谱系统配备四元溶剂管理器以建立该梯度。 
	注意：异丙醇（IPA）是一种黏性溶剂。应在较低流速下引入，并在将比例升至98.0%之前留出足够的平衡时间。这些步骤可防止液相系统压力过高而停机。</li>
	<li>为正离子和负离子飞行时间质谱（ToF-MS）模式分别设置质谱仪采集方法，扫描范围为m/z 50–1,300。 
	注意：本文所用仪器要求正、负离子模式需分别进行校准和运行（即无法在单个方法内切换极性）。</li>
	<li>若使用新的LC色谱柱，请根据制造商建议对色谱柱进行预处理。 
	注意：以下步骤应在数据采集前立即完成。</li>
	<li>在“仅MS”硬件配置文件中，根据制造商推荐的方法对质谱仪进行校准。此步骤应在每种采集模式前完成，并确保系统在每种模式下均已达到稳定状态后再进行校准。</li>
	<li>使用LC-MS级溶剂（包括流动相和清洗溶剂）对液相色谱流路系统进行 purge 和冲洗。</li>
	<li>使用液相方法的起始条件对系统进行平衡，确保色谱柱压力已稳定。</li>
	<li>在样品序列开始时（如下所述）注入甲酸钠溶液（0.5 mM，溶于90% IPA），以检查仪器校准状态。</li>
	<li>设置仪器序列表格，先分析溶剂空白和制备（提取）空白样品；随后分析用于系统平衡的混合质控样品（QC，6–10个）；然后是随机排列的样品列表，并以固定间隔（例如每第五次进样）插入QC样品作为技术重复；序列结束前运行两个QC样品。 
	注意：在样品文件名中包含日期、进样/采集顺序以及样品编号将有助于管理。例如：YYYY MMDD_进样序号_品种_生物学重复。开始运行前，确保液相色谱柱压力稳定，且液相系统已正确连接至质谱仪。</li>
</ol>
7. 数据处理
注意：此处展示了一般的数据处理工作流程 图1.
<ol>
	<li>在序列运行过程中检查数据质量（内标质量准确性（计算方法见下文）和信号重复性）。为检查信号重复性，目视检查叠加谱图即可满足要求。 
	注意：质量误差（ppm）= （（理论质量 – 实测质量）/ 理论质量）× 106</li>
	<li>生成一个包含样本 × 内标的对齐峰强度矩阵（按保留时间和 m/z 值对齐）。
	<ol>
		<li>打开数据处理软件（参见 材料表）。在 主页 &#62; 打开 下，点击 数据。导航至正确的文件位置并打开所有数据文件。</li>
		<li>在 主页 &#62; 序列 &#62; 处理类型 下，从下拉菜单中选择 定量分析。</li>
		<li>在 主页 &#62; 方法 &#62; 定量 下，点击 校准组分。使用 表2 中提供的详细信息填写每个字段，然后点击 确定。</li>
		<li>在左侧面板中数据文件旁边的列中，通过右键单击单元格并选择 未知样品 来填写样品类型。将“水平”填写为 n/a。</li>
		<li>在 主页 &#62; 处理 下，选择 序列。选择一个位置以保存序列，然后点击 处理。</li>
		<li>在 主页 &#62; 结果 下，选择 定量。在 定量 查看器中，选择 导出运行至矩阵分析器。</li>
		<li>在矩阵分析器结果查看器中，点击 导出为csv。将文件保存为电子表格文件。</li>
		<li>在电子表格软件中，计算每个内标峰强度（峰面积）的平均值、标准差和相对标准偏差。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>生成一个包含样本 × 非靶向特征的对齐峰强度矩阵（按保留时间和 m/z 值对齐）。
	<ol>
		<li>打开小分子发现分析软件（参见 材料表），选择 文件 &#62; 新建 以创建新实验。为实验命名，并选择保存和存储实验文件的位置。点击 下一步。</li>
		<li>选择所用仪器类型（高分辨质谱仪）、数据格式（轮廓模式）和极性（正离子或负离子）。点击 下一步。选择库中所有可用的加合物，并根据需要编辑加合物库。点击 创建实验。将加载一个新页面，后续的数据处理将在该页面继续进行。</li>
		<li>导入数据文件。选择文件格式，然后选择导入。浏览至数据所在位置并选择要导入的数据文件。每个文件的导入进度将在页面左侧面板中显示。</li>
		<li>数据文件导入完成后，选择 开始自动处理。选择一个对齐参考的选取方法。可让软件评估所有运行是否适合作为参考，也可提供一组合适的样品（例如QC样品）列表，或手动选择最合适的参考（如序列中间的QC样品）。选择 是，自动对齐我的运行 &#62; 下一步。</li>
		<li>在实验设计页面点击 下一步（此步骤可稍后设置）。</li>
		<li>选择 执行峰提取，然后选择 设置参数。在 峰提取限制 选项卡下，选择 绝对离子强度 并输入 100。勾选应用最小峰宽并输入 0.01 分钟。点击 确定 &#62; 完成。处理完成后，点击 关闭。 
		注意：可根据需要优化其他数据文件类型的峰提取限制。</li>
		<li>在屏幕右下角，选择 本节完成。检查对齐结果，确保每个样品均正确对齐至参考。本研究中所展示数据的对齐得分均 &#62;90%。选择 本节完成。</li>
		<li>在下一页中，选择“组间设计”。为设计命名。选择 手动分组运行 并点击 创建设计。添加条件，点击 条件1 并为该组正确命名。点击 本节完成。 
		注意：根据需要继续添加条件，以便在软件内使用统计分析功能。由于我们仅使用该软件生成非靶向矩阵，因此仅使用一个标记为“全部”的单一条件。</li>
		<li>在下一页中，选择 本节完成。不要重新执行峰提取。</li>
		<li>检查解卷积结果，然后点击 本节完成。</li>
		<li>转到 文件 &#62; 导出化合物测量值。取消勾选输出中不需要的任何属性。点击 确定。选择保存 .csv 文件的位置。点击 保存 &#62; 打开文件 &#62; 打开文件夹 或 关闭。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用提取空白样进行数据过滤，以去除伪影（使用电子表格软件）。
	<ol>
		<li>对于每个 RT × m/z 特征，在新列中计算其在提取空白样中的平均响应值。</li>
		<li>对于每个 RT × m/z 特征，计算其在所有其他样品（包括QC样品）中的平均响应值。</li>
		<li>计算空白样在样品中的峰强度百分比（空白样平均响应 / 样品平均响应 × 100）。</li>
		<li>将百分比贡献列按数值从低到高排序。</li>
		<li>删除空白样强度贡献 &#62;5% 的特征。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>过滤缺失值，并将特征信号校正为混合QC样品中的信号。
	<ol>
		<li>打开数据处理软件（材料表）。点击 查看 MatrixAnalyzer 按钮。点击 打开数据文件 按钮。</li>
		<li>导航至包含各样品 RT × m/z 特征峰强度的 .csv 文件位置（非靶向矩阵）。选择 打开。</li>
		<li>在QC样品选项卡下，根据需要填写每个参数。对于本研究所描述的数据集，使用以下设置：QC类别=QC，忽略类别=空白，填补类型=无，覆盖率阈值=80，缩放方式=不缩放，取消勾选对数转换，校正方式=平滑样条，平滑系数=0.25。</li>
		<li>在矩阵面板右上角，点击播放按钮 QC校正。</li>
		<li>校正完成后，在矩阵面板右上角点击 保存结果。导航至合适位置并保存 .csv 结果文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>过滤数据，删除在QC样品中相对标准偏差（RSD）&#62;20% 的特征。
	<ol>
		<li>整理数据，使样品位于行中，特征位于列中。</li>
		<li>在新列中计算QC样品的平均峰强度。</li>
		<li>在新列中计算QC样品峰强度的标准差。</li>
		<li>计算QC样品峰强度的相对标准偏差：（QC标准差 / QC平均值）× 100。</li>
		<li>将特征按 %RSD 从低到高排序，并删除 QC RSD &#62;20% 的特征。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>过滤数据，删除 RSD样本/RSDQC 比值较低的特征（例如 &#60;1）。
	<ol>
		<li>在新列中计算样品的平均峰强度。</li>
		<li>在新列中计算样品峰强度的标准差。</li>
		<li>计算样品峰强度的相对标准偏差：（样品标准差 / 样品平均值）× 100。</li>
		<li>在新列中，将样品RSD除以QC RSD。</li>
		<li>将 RSD样本/RSDQC 比值从高到低排序，并删除比值 &#60;1 的特征。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>填补缺失值（可在线获取多种方法）。
	<ol>
		<li>格式化电子表格，使样品位于行中，特征位于列中。第一列为样品文件名。在文件名旁新增一列，并输入样品分组信息。本例中，样品按品种分组。</li>
		<li>将电子表格另存为 .csv 文件。</li>
		<li>访问基于网络的高通量代谢组学分析流程主页（参见 材料表），点击 点击此处开始。</li>
		<li>点击 统计分析。在 上传您的数据 下，选择数据类型：峰强度表，格式：样品在行中（非配对），然后点击 选择文件。</li>
		<li>导航至 .csv 文件，选择 打开，然后点击 提交。</li>
		<li>在下一页中，选择 缺失值估计。取消勾选步骤1（此步骤已在 AnalyzerPro XD 中完成）。在步骤2中，选择一种缺失值估计方法。 
		注意：本研究所用数据选择了“估计缺失值”中的“KNN”方法。</li>
		<li>此时可下载数据矩阵（从网页左侧面板选择 下载），或继续进行进一步的统计分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种基于液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）的非靶向代谢组学方法，用于小麦籽粒的分析。该方法通过在反相梯度中引入第三种流动相，将四种采集模式（正负离子化模式下的反相色谱及适用于脂类的反相色谱）整合为两种模式。该整合方法每种离子极性可获得约500个具有生物学意义的特征峰，其中约一半在不同小麦品种间的信号强度存在显著差异。不同小麦品种籽粒中代谢物浓度的显著变化表明其生物化学过程存在差异，这可能与抗病性、抗逆性以及其他影响籽粒品质和产量的重要表型特征相关。例如，代谢组学方法已被用于描述新的防御机制12，并提出代谢物在抗旱性中的作用13。本实验方案未来的应用有望进一步将特定品种的生物化学谱与特定环境和管理措施下所需的遗传性状关联起来，从而实现对特定基因型籽粒品质和产量的最优化生产。
在本实验方案中，内标物的加入至关重要，可用于判断信号变化、保留时间漂移以及质量准确性。信号的变化可能提示例如提取效率不理想、进样问题（包括流路系统堵塞）或检测器性能下降等情况。保留时间的偏移可能表明泵性能不...

理解农业中基因、环境与管理措施之间的相互作用，有助于更准确地预测和管理产品的产量与品质。植物代谢物受到基因组、环境（气候、降雨等）因素的影响，在农业环境中还受到作物管理方式（如肥料、杀菌剂的施用等）的影响。与基因组不同，代谢组受所有这些因素的共同影响，因此代谢组学数据能够提供在特定时间点上这些相互作用的生物化学特征指纹。基于代谢组学的研究通常有两个目标：第一，更深入地理解生物体的生物化学过程，帮助阐明其在生理层面上对扰动（非生物或生物胁迫）响应的机制；第二，将生物标志物与所研究的扰动相关联。在这两种情况下，获得这些知识的最终结果是制定更精确的管理策略，以实现提高产量和品质的目标。
据预测，植物代谢组包含数千种具有不同理化性质的小分子1。目前，尚无任何代谢组学平台（主要是质谱和核磁共振波谱）能够在单次分析中全面捕获整个代谢组。因此，开发能够在单次分析中尽可能广泛覆盖代谢组的技术（包括样品制备、代谢物提取与分析）是代谢组学研究人员的重要目标。以往对小麦籽粒的非靶向代谢组学分析通常结合多种色谱分离方法、不同采集极性及/或不同仪器，以实现更广泛的代谢组覆盖。然而，这种方法通常需要针对每种分析模式分别制备和采集样品。例如，Beleggia 等人2在对非极性分析物进行 GC-MS 分析的同时，还额外制备了衍生化样品用于极性分析物的 GC-MS 分析。Das 等人3则同时采用了 GC-MS 和 LC-MS 方法以提高覆盖度；但该策略通常也需要如上所述的独立样品制备流程以及两套独立的分析平台。以往基于 GC-MS2,3,4 和 LC-MS3,5 平台对小麦籽粒的研究分别检测到 50 至 412 个特征（其中 55 个被鉴定）、GC-MS 与 LC-MS 联用检测到 409 个特征，而 LC-MS 脂质组学分析则检测到数千个特征5。通过将至少两种分析模式整合至单次分析中，可在维持更广泛代谢组覆盖的同时，提升生物学解释的深度，并在时间和成本方面实现显著节约。
为了通过反相色谱有效分离多种脂质种类，现代脂质组学方法通常在洗脱溶剂中使用高比例的异丙醇6，从而提高对那些原本难以通过色谱分离的脂质类别的分辨能力。为了实现高效的脂质分离，起始流动相中的有机相比例也远高于针对其他类型分子的典型反相色谱方法7。梯度起始时的高有机相组成使得这些方法不太适用于许多其他类型的分子。值得注意的是，反相液相色谱通常采用二元溶剂梯度，起始时以水相为主，并随着色谱洗脱强度的增加逐步提高有机相含量。为此，我们尝试结合这两种方法，以实现在单次分析中同时分离脂质和非脂质类别的代谢物。
本文介绍了一种色谱方法，该方法使用第三种流动相，能够在单一样品制备和一根分析柱的条件下，实现传统的反相色谱与适用于脂质组学的色谱方法的结合。我们采用了多种质量控制措施和数据过滤步骤，这些方法此前主要应用于临床代谢组学研究中。这些策略有助于识别出具有高技术重复性和生物学相关性的可靠特征，并排除不符合这些标准的特征。例如，我们描述了对混合质控样品（pooled QC sample）的重复分析8、质控校正9、数据过滤9,10以及缺失特征值的填补11。

<table><tbody><tr><td>13C6-山梨醇</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>605514</td><td></td></tr><tr><td>2-氨基蒽</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>A38800-1 g</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FSBA955-4</td><td>Optima LC-MS 级</td></tr><tr><td>甲酸铵</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>516961-100 mL</td><td>&gt;99.995%</td></tr><tr><td>Analyst TF</td><td>Sciex</td><td></td><td>版本 1.7</td></tr><tr><td>AnalyzerPro 软件</td><td>SpectralWorks Ltd.</td><td></td><td>用于步骤 7.2 的数据处理软件。版本 5.7</td></tr><tr><td>AnalyzerPro XD 软件</td><td>SpectralWorks Ltd.</td><td></td><td>用于步骤 7.5 的数据处理软件。版本 1.4</td></tr><tr><td>天平</td><td>Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>d6-反式肉桂酸</td><td>Isotec</td><td>513962-250 mg</td><td></td></tr><tr><td>甲酸</td><td>Ajax Finechem Pty. Ltd.</td><td>A2471-500 mL</td><td>99%</td></tr><tr><td>冷冻干燥机（Freezone 2.5 Plus）</td><td>Labconco</td><td>7670031</td><td></td></tr><tr><td>玻璃肖特瓶（100 mL、500 mL、1 L）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>玻璃小瓶（2 mL）及螺口盖（预切口）</td><td>Velocity Scientific Solutions</td><td>VSS-913（小瓶），VSS-SC91191（盖子）</td><td></td></tr><tr><td>Sciex TripleToF 安装套件</td><td>Sciex</td><td>p/n 4456736</td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FSBA464-4</td><td>Optima LC-MS 级</td></tr><tr><td>实验室搅拌器</td><td>Waring commercial</td><td></td><td>型号 HGBTWTS3</td></tr><tr><td>亮氨酸脑啡肽</td><td>Waters</td><td>p/n 700008842</td><td>调谐溶液</td></tr><tr><td>Metaboanalyst</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml&quot; target=&quot;_blank">https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml&lt;/a&gt;</td><td></td><td>用于高通量代谢组学的基于网络的分析流程。免费的在线工具。版本 4.0。</td></tr><tr><td>甲醇</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FSBA456-4</td><td>Optima LC-MS 级</td></tr><tr><td>咪康唑</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>M3512-1 g</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机（Eppendorf 5415R）</td><td>Eppendorf（由中国台湾 Crown Scientific Pty. Ltd. 分销）</td><td></td><td>5426 编号 0021716</td></tr><tr><td>微量离心管（2 mL）</td><td>SSIbio</td><td>1310-S0</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peak View 软件</td><td>Sciex</td><td></td><td>版本 1.2（64 位）</td></tr><tr><td>移液器吸头（200 µL，100 µL）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MBP2069-05-HR（200 µL），MBP2179-05-HR（1000 µL）</td><td></td></tr><tr><td>移液器（200 µL，1000 µL）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塑料离心管（15 mL）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NUN339650</td><td></td></tr><tr><td>Progenesis QI</td><td>Nonlinear Dynamics</td><td></td><td>小分子发现分析软件。版本 2.3（64 位）</td></tr><tr><td>Sciex 5600 三重飞行时间质谱仪</td><td>Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带陶瓷珠的螺口裂解管（2 mL）</td><td>Bertin Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲酸钠</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>456020-25 g</td><td></td></tr><tr><td>组织研磨仪/匀浆器</td><td>Bertin Technologies</td><td></td><td>序列号 0001620</td></tr><tr><td>容量瓶（10 mL、50 mL、100 mL、200 mL、1 L）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>IKA Works Inc.（由中国台湾 Crown Scientific Pty. Ltd. 分销）</td><td></td><td>001722</td></tr><tr><td>水</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FSBW6-4</td><td>Optima LC-MS 级</td></tr><tr><td>配备四元泵的 Waters Acquity LC 系统</td><td>Waters</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters Aquity UPLC 100 mm HSST3 C18 色谱柱</td><td>Waters</td><td>p/n 186005614</td><td></td></tr></tbody></table>

基于液相色谱-质谱的非靶向小麦籽粒代谢组学分析

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

理解农业实践中基因、环境与管理措施之间的相互作用，有助于更准确地预测和管理农产品的产量与品质。代谢组学数据能够反映这些相互作用在特定时间点的状态，并提供有关生物体生化状态的信息。此外，单个代谢物或代谢物组合可作为精确的生物标志物，用于产量和品质的预测与管理。据预测，植物代谢组包含数千种具有不同理化性质的小分子，这为从生化角度深入理解生理特性及发现生物标志物提供了机会。为了充分利用这一资源，代谢组学研究的一个关键目标是在单次分析中尽可能全面地覆盖这些理化多样性。本文介绍了一种基于液相色谱-质谱联用技术的非靶向代谢组学方法，用于田间种植小麦籽粒的分析。该方法利用液相色谱仪的四元溶剂管理系统引入第三种流动相，并将传统的反相梯度与适用于脂质分析的梯度相结合。文中详细描述了籽粒前处理、代谢物提取、仪器分析及数据处理的工作流程。实验结果显示良好的质荷比准确性和信号重复性，每种电离模式下可检测到约500个具有生物学意义的特征信号。此外，不同小麦品种之间的代谢物和脂质特征信号存在显著差异。

植物代谢组受其基因组和环境的共同影响，此外在农业环境中还受到作物管理措施的影响。我们证明了小麦品种之间的遗传差异可以在代谢物水平上被观察到，仅在籽粒中就有超过500种测定化合物的浓度在不同品种间表现出显著差异。良好的质谱准确性（&lt;10 ppm 误差）和信号重复性（&lt;20% RSD）的内标物（图2在负离子和正离子化模式下均观察到（表3）。所述的样品制备及基于液相色谱-质谱联用的分析方法获得了 &gt;负离子化模式下900个去卷积特征 &gt;正离子化模式下1300个去卷积特征。制备空白样（图3）被纳入以确定样品制备和分析方法是否引入了人为特征，从而将所有非生物因素从数据矩阵中消除。结果发现，在负离子模式中有421个信号，在正离子模式中有835个信号，其信号强度等于或大于籽粒样品中平均信号强度的5%。这些特征被剔除后，经过进一步的数据过滤步骤（步骤7和 图1</stron...

本文介绍了一种对小麦籽粒代谢物和脂质进行非靶向分析的方法。该方案包括乙腈代谢物提取法以及反相液相色谱-质谱分析法，并在正离子和负离子电喷雾电离模式下进行检测。

理解基因、环境与农业管理实践之间相互作用，有助于更准确地预测和管理……

该代谢物受到基因组环境和管理措施等因素的影响。了解这些因素之间的相互作用，有助于更准确地预测和管理产品的产量与质量。通过引入第三种流动相，而非传统的两种，该技术能够实现更广泛种类代谢物的分离与检测。代谢组学可应用于生物学的任何领域。首先，可用于深入理解生物体的生物化学过程，并帮助解释其在生理层面上对非生物或生物胁迫的响应。其次，可用于将生物标志物与所研究的扰动因素相关联。由于异丙醇是一种黏性溶剂，应以较低的梯度流速引入，并在将浓度升至98%之前留出足够的平衡时间。这些步骤可防止色谱系统压力过高，避免报错或可能损坏分析柱。开始制备谷物样品时，使用实验室搅拌机对谷物进行研磨。以高速运行搅拌机20秒，然后重复操作。将搅拌杯从底座上取下。轻敲搅拌杯侧面，使粗磨的谷物颗粒上浮至样品表面。粗磨的谷物可弃去，也可保存备用。将研磨好的细粉从搅拌器转移至一个2毫升的塑料微量离心管中。在提取当天，按照文稿所述方法配制提取溶剂。随后，称取200毫克研磨好的细粉加入2毫升微量离心管中。向管中的谷物加入 500 微升提取溶剂。此外，通过向空管中加入 500 微升提取溶剂制备一个空白对照。使用匀浆器，在 6 档 500 转/分钟的条件下，将溶剂与谷物混合 20 秒。然后，再重复操作20秒。接着，将离心管在4摄氏度、16,100 × g条件下离心5分钟。将上清液转移至一个2毫升的塑料离心管中，并保留沉淀。对沉淀物重复提取过程两次。合并三次上清液，得到总体积约为1.5毫升的总提取液，并通过涡旋振荡混匀。为制备用于质量控制的所有谷物提取液的混合样本，从每种谷物提取液中各转移55微升至一个2毫升离心管中，并涡旋振荡。然后，将该混合样品各50 µL分装至玻璃小瓶中。将每份谷物样品提取物各50 µL转移至玻璃小瓶中。如书面文稿所述，制备液相色谱-质谱分析所需的各种溶液。在LCMS分析当天，配制100毫升含5%乙腈的溶液，其中含有200纳克/毫升的亮氨酸脑啡肽。取950微升该溶液加入含有50微升谷物提取物分样液的玻璃小瓶中。通过涡旋振荡混合小瓶中的内容物。首先，按照论文和制造商用户指南中的说明设置并校准仪器。接着，使用液相色谱-质谱级溶剂（包括流动相和清洗溶剂）对液相色谱流路系统进行 purge 和冲洗。根据液相色谱方法的起始条件平衡液相色谱系统，确保色谱柱压力已稳定。设置仪器序列表格。在样品序列开始时进样甲酸钠，以检查仪器校准情况。首先分析溶剂空白和制备空白，接着分析混合的质量控制样品以进行系统平衡，最后分析随机排列的样品列表。定期运行质控样品作为技术重复。在序列结束时运行两个质控样品。在序列运行过程中，检查数据质量，包括内标质量准确度和信号重复性。为检查信号的重复性，对重叠谱图进行目视检查即可。在用于制备谷物提取物的溶液中加入了四种内标物。在液相色谱-质谱分析中，正离子和负离子化模式下均观察到良好的质量准确性和内标物单一重复性。根据对空白样品的分析，负离子模式下有 421 个信号、正离子模式下有 835 个信号被判定为干扰信号。这些信号在空白样品中的强度等于或高于谷物样品中平均单一信号强度的 5%。在去除干扰信号并对数据进一步过滤后，负离子模式保留了 483 个特征峰，正离子模式保留了 523 个特征峰。大约有250个特征在生物学上具有相关性，并且在不同小麦品种间的强度存在显著差异。在此方案中，应注意质量控制措施，例如加入制备空白样本、内标物和混合样本。

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科研

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生物化学

无目标液相色谱-质量光谱学-小麦粒基代谢代谢学分析

采用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-MS）进行非靶向代谢物谱型分析是研究代谢的重要手段。本文概述了用于血清非靶向代谢物谱型分析的典型工作流程，包括样本组织与制备、数据采集、数据分析、质量控制以及代谢物鉴定。...

大规模非靶向血清代谢组学分析：超高效液相色谱-质谱法（UPLC-MS）

非靶向代谢组学可提供代谢谱的假设生成式快照。本方案将演示从细胞、血清或组织中提取和分析代谢物的方法。通过液-液相萃取、微流速超高效液相色谱/高分辨质谱法（UPLC-HRMS）结合差异分析软件，对多种代谢物进行检测。...

使用超高效液相色谱-高分辨质谱法（UPLC-HRMS）对生物来源样本进行非靶向代谢组学分析

代谢物谱分析在健康与疾病状态下的代谢研究中具有重要价值。本文介绍了一种利用正相液相色谱联用高分辨率质谱、极性切换及快速循环周期的技术方案，可对生物材料中的极性代谢物组成进行高灵敏度、高准确性和高分辨率的分析。...

一种用于高灵敏度、大规模定量代谢组学的策略

我们提出了一种用于鉴定和定量酿酒酵母（Saccharomyces...

使用液相色谱串联质谱法对Saccharomyces cerevisiae进行定量代谢组学分析

本方案描述了高效液相色谱法，结合折光指数检测或质谱检测，用于研究基于复杂裂解液的无细胞系统中的代谢反应。...

液相色谱联用折射率或质谱检测用于基于裂解液的无细胞体系中的代谢物分析

本文介绍了一种在水培条件下利用液相色谱-串联质谱法（LC-MS-MS）测定吡虫啉在小麦中吸收、转运和分布的实验方案。结果表明，小麦能够吸收吡虫啉，且在小麦的根和叶片中均检测到了吡虫啉的存在。...

噻虫嗪在小麦中的吸收、转运与分布测定

本文介绍了一种用于大麦代谢组学分析的方法。该方法包括对代谢物进行分离和衍生化处理，并采用气相色谱-质谱联用技术（GC/MS）进行分析。代谢组学分析可用于研究间作种植和干旱胁迫对谷粒的影响。...

大麦的气相色谱/质谱代谢组学分析

本方案介绍了一种经过验证的液相色谱-离子淌度-高分辨质谱法，用于检测食品中麦角生物碱的存在，符合最新发布的欧盟委员会法规（EU）2023/915的要求。...

利用液相色谱-捕集离子淌度谱-飞行时间质谱法检测食品基质中的受管制麦角生物碱

本文介绍了一种从金黄色葡萄球菌（Staphylococcus...

一种基于串联液相色谱-质谱法的代谢物分析方法 金黄色葡萄球菌

我们描述了一种利用紫外光介导的光交联和质谱技术在活细胞中鉴定RNA结合蛋白并绘制其RNA结合区域的实验方案。...

基于质谱的RNA结合区域鉴定的样品制备

了解小麦籽粒代谢组学分析方法，采用乙腈提取与反相液相色谱-质谱联用技术，结合第三流动相增强分离效果。该方法可检测更广泛的代谢物，助力解析遗传、环境与管理因素对产量和品质的交互影响。

基于液相色谱-质谱的非靶向小麦籽粒代谢组学分析

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