通过可切换的原卟啉IX依赖性原位活性氧生成刺激小鼠皮肤干细胞微环境及组织再生

我们的方法是首个提供可靠实验工具的技术，可在活体组织内诱导内源性活性氧（ROS）产生的瞬时激活。该方法提供了一种稳健、操作简便且非侵入性的操作流程，仅需使用红光光源，即可在皮肤中稳定地产生生理水平的刺激性活性氧。由于皮肤中活性氧的生理诱导能够满足组织干细胞的需求，我们进一步将该方法应用于皮肤再生治疗，包括促进良好愈合和毛发生长。

活性氧（ROS）生物学与信号传导目前是研究热点。在体内研究ROS功能的一个主要限制是缺乏适当的工具来诱导可控的内源性ROS产生。我们的方法操作简便、易于使用，但所有设备、光源、静脉输液装置、IV、IS等均需进行充分校准。

关键的化学前体必须保持新鲜，并且必须严格遵循实验方案的每一步骤。为了在处于第二个休止期的小鼠背部皮肤上诱导毛发生长，在确认出生后约第50天的C57黑六同窝小鼠对足底反射无反应后，使用剃须刀和脱毛膏从每只小鼠背部去除两个独立且并列的皮肤区域。数分钟后，用PBS清除脱毛膏，并通过每日采集每只动物对照和处理区域背部皮肤的高分辨率图像，记录毛囊的生长情况。

为了在处于第二个休止期的小鼠背部皮肤上诱导产生二度烧伤病灶，需先去除小鼠背部的毛发。将横截面为1厘米的黄铜棒在沸水中预热至95摄氏度，然后将其置于小鼠皮肤中央区域持续5秒。烧伤形成后立即通过腹腔注射每只小鼠1毫升生理溶液，以防止脱水，并在继续后续处理前让小鼠恢复24小时。

为了生成BrdU标记的滞留细胞（LRCs），对10日龄或14日龄的同窝幼鼠进行腹腔注射，每天一次，连续四天，每次注射剂量为每千克体重50毫克的BrdU溶于PBS中。标记阶段结束后，让小鼠继续发育50至60天，然后再进行处理。为了在小鼠皮肤中诱导产生短暂的非致死性活性氧（ROS）水平以进行毛发生长分析，在获取基线毛发生长图像后，将约25毫克的mALA乳膏局部涂抹于右侧剃毛区域，并将动物置于黑暗环境中2.5小时。

在光敏剂处理期结束时，用 PBS 彻底清除多余的乳膏，并通过蓝光激发下观察红色荧光表达来原位确认 PP9 的产生，然后使用适当的红光光源对整个背部皮肤进行照射，总剂量为每平方厘米 2.5 至 4 焦耳。随后将小鼠置于电热毯上监测直至完全恢复卧姿，再将其放回笼中。为启动短暂的活性氧（ROS）产生以促进二度烧伤愈合，在右侧烧伤区域及约四毫米周围邻近组织上涂抹约 25 毫克的 mALA 乳膏，并将动物置于黑暗环境中 2.5 小时，操作如前所示。

去除乳膏后，照射整个背部皮肤，并按照所示方法对小鼠进行监测和恢复。为了在尾部皮肤中诱导短暂的活性氧（ROS）产生，将约25毫克mALA乳膏涂抹于BrdU处理小鼠尾部背侧组织区域，并按照所示方法照射尾部背侧皮肤。在处死小鼠后，取尾部皮肤用于BrdU检测。

使用手术刀从每只动物身上取下尾部，然后沿纵轴做直线切口，用镊子将整块皮肤从脊柱处完整剥离。将剥离的皮肤组织置于含有5 mM EDTA的PBS溶液中，放入5毫升离心管，37°C孵育4小时，以便后续用镊子小心分离出完整的表皮层与真皮层。分离后的组织用4%多聚甲醛PBS溶液固定，室温下放置至少72小时。

然后，在荧光共聚焦显微镜下按照标准方案观察组织之前，使用目标荧光标记抗体对固定组织进行标记，以在每种实验条件下识别并定量标记滞留细胞（LRCs）。对于活性氧（ROS）产生的体外评估，在获取小鼠尾部皮肤组织片段后，将未处理的对照组织分别置于仅含5毫摩尔EDTA和PBS的溶液中，以及补充了2毫摩尔mALA的EDTA溶液中进行光动力治疗处理。接着，向每组组织中加入羟基乙啶，使其终浓度为3.2微摩尔，并将所有样本在室温避光条件下孵育1小时。

孵育结束后，用手指将尾部皮肤样本拉伸覆盖在玻璃表面，并用波长为636纳米的红光以10焦耳/平方厘米的辐射能量照射处理后的组织。处理结束后，立即分离表皮与真皮，将表皮组织片置于含4%甲醛的磷酸盐缓冲液（PBS）中，在室温下固定至少72小时。固定结束后，使用绿色激发光通过荧光显微镜检测红色2-羟基乙锭的发射信号，以获取高质量图像。

为了在活体中检测背部皮肤活性氧（ROS）的产生，在红光照射后立即在所有目标对照组和处理组皮肤区域上涂抹100微升浓度为1毫克/毫升的DH-FDA溶液，并加入50%乙醇。将mALA前体局部施用于小鼠背部和尾部皮肤后，可在整个组织中显著积累原卟啉IX，尤其在毛囊部位尤为明显，这一点可通过该化合物在蓝光激发下呈现的粉红色荧光得以证实。随后用红光照射处理过的组织，可促进组织内特别是毛囊隆突区域活性氧（ROS）的瞬时产生。

在活体小鼠皮肤中启动非致死性活性氧（ROS）的产生，可在光动力治疗两天后显著增加毛囊隆突区标记滞留细胞（LRCs）的数量。值得注意的是，LRC数量的增加是暂时的，在治疗六天后恢复至正常水平。短暂的ROS产生可加速二度烧伤后的皮肤愈合。

对受损皮肤逐渐减少的量化分析表明，伤口愈合加速过程具有显著的稳健性和统计学意义。同样，在第二次协调性休止期（即毛囊对生长刺激无反应的阶段）剃毛后，非致死水平的活性氧（ROS）可显著促进毛发生长。此外，光疗后活性氧（ROS）的产生也可通过抗氧化化合物的应用而显著降低。

必须仔细确认在蓝光激发下通过红色荧光表达原位产生的原卟啉IX。为了诱导活性氧（ROS）的产生，必须正确设定红光光源的辐照度，以及组织和总光剂量。

在诱导活性氧（ROS）产生后，可采用现有的生物化学以及细胞和分子生物学技术来分析收集的样品，并评估组织的动态生理反应。本方法为研究体内组织中内源性ROS瞬时产生的生理效应提供了一种强有力的工具。这是一种新的实验方法，可能对活性氧信号传导领域的研究人员具有重要价值。