Name: 在果蝇黑色无gaster的Axon死亡期间，对Axon及其突触的形态和功能评估 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: 学习使用Drosophila melanogaster进行轴突损伤实验，评估受损轴突及其突触的形态与功能保留。该方法可表征神经元维持因子，研究轴突运输机制，为神经退行性疾病研究提供重要模型。

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我们感谢Neukomm实验室全体成员的贡献。本工作得到了瑞士国家科学基金会（SNSF）助理教授奖（资助号176855）、国际截瘫研究基金会（IRP，资助号P180）、SNSF Spark（资助号190919）以及洛桑大学和基础神经科学系（沃州政府）对LJN的支持。

1. 周围神经系统中轴突死亡过程中轴突形态的观察
<ol>
	<li>翅损伤：轴突束的部分损伤
	<ol>
		<li>取正确基因型的5只 virgin 雌蝇和5只雄蝇（图4A，P0代），在室温（RT）下进行杂交。每隔3–4天将P0代转移至新的培养瓶中。每日收集新羽化的成年子代（F1代），并饲养7–14天。</li>
		<li>在CO2麻醉垫上麻醉果蝇。使用显微剪刀在翅的中部位置切断前缘翅脉（图1A）。一只翅用于损伤处理，另一只翅作为年龄匹配的未损伤对照。每翅施加一次损伤，并确保获得足够数量的损伤翅（约15只翅）。 
		注意：可以完全切断整个翅，但仅切断前缘翅脉已足够。前缘翅脉是翅中最坚固的部分。</li>
		<li>将果蝇回收至含有食物的培养瓶中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>翅的解剖与轴突的观察
	<ol>
		<li>用移液器将10 µL 卤代烷油27沿整个载玻片均匀铺开（图1B）。</li>
		<li>在预定时间点（例如损伤后1天或7天），用显微剪刀剪下损伤翅及未损伤的对照翅，并用镊子夹取。最多将4只翅置于卤代烷油27中（图1B），加盖盖玻片。</li>
		<li>立即使用转盘共聚焦显微镜对翅进行成像。沿z轴采集一系列光学切片，步长为0.33 μm，并将z轴图像堆栈压缩为单个文件，用于后续分析。 
		注意：避免夹取容纳细胞体和轴突的前缘翅脉区域，应夹取翅的中心部位。翅组织未经过固定处理，因此从装片到完成成像的时间应控制在8分钟以内。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="果蝇翅膀解剖结构与制备示意图，显示神经元通路及用于分析的载玻片装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60865/60865fig01.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 1"> 
图1：翅膀中轴突死亡过程中轴突形态的观察。（A）带有两个稀疏表达GFP标记的感觉神经元的果蝇翅膀示意图，下方分别展示了这两个神经元。图中标示了损伤部位和观察区域。（B）翅膀成像的示意图装置。受伤翅膀与未受伤对照翅膀（灰色）被置于载玻片（浅蓝色）上的卤代烷油27（红色）中，并用盖玻片（黑色）封片。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60865/60865fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 中枢神经系统中轴突死亡期间轴突与突触形态的观察
<ol>
	<li>触角切除：完整轴突束的损伤
	<ol>
		<li>使用5只未交配的雌性个体和5只雄性个体，其基因型需正确图5A，P0 代）在室温下进行杂交。传递 P0 每3–4天更换至新离心管中。收集新羽化的成年子代（F1 每天收集（子代）并使其老化7至14天。</li>
		<li>用CO2麻醉果蝇2 垫片。使用镊子消融右侧第3个rd 用于单侧消融的触角节段；或左右两侧3rd 用于双侧消融的触角节段图2A-C）。这将去除GFP标记的神经元胞体，而其轴突投射则保留在中枢神经系统中。 
		注意：触角切除术会切断整个轴突束。若进行单侧切除，对侧（未切除触角）的轴突束可作为内部对照。请确保完成足够数量的触角切除实验（约15只动物）。</li>
		<li>将果蝇回收至含有食物的试剂管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>大脑解剖与轴突可视化
	<ol>
		<li>将硅酮弹性体基础剂（9 mL）与固化剂（1 mL）按10:1的体积比混合。将每份5 mL混合物转移至35 mm组织培养皿中，并在通风橱内轻轻振荡过夜，以减少混合过程中引入的气泡。混合物在24小时内固化。 
		注意：解剖板只需制备一次，可多次使用。</li>
		<li>用CO2麻醉果蝇2 使用两把镊子在预定时间点（例如触角切除后1天或7天）夹住果蝇并去头。用一把镊子夹住颈部，另一把镊子固定胸部，轻柔地将头部与胸部分离。 
		注意：将断头后的头部留在 CO2 垫片直至达到所需数量，但需确保在30分钟内进入下一步操作。</li>
		<li>使用已浸入固定液的镊子，将所有头部样本转移至含有1 mL固定液的1.5 mL微量离心管中，固定液成分为4%多聚甲醛（PFA）和0.1% Triton X-100溶于磷酸盐缓冲液（PBS）。 
		注意：果蝇头部容易粘附在湿润的镊子上，因此可方便地将所有头部转移至微量离心管中。</li>
		<li>在室温下轻轻振荡固定头部组织20分钟。将微量离心管置于冰上，头部组织会沉降至管底。用移液器吸除上清液，随后用含0.1% Triton X-100的PBS洗涤缓冲液在室温下轻轻振荡洗涤5次，每次2分钟，每次使用1 mL洗涤缓冲液，以去除残留的固定液。每次洗涤后将微量离心管置于冰上，组织沉降后吸除上清液。 
		注意：有关如何解剖成年个体的视频 果蝇 大脑易于获取27.</li>
		<li>用玻璃移液管将头部转移至装有洗涤缓冲液的解剖板中。用一把镊子夹住并拉出吻部，同时用另一把镊子固定头部。这样可在吻部原附着于外骨骼的位置留下一个孔洞。</li>
		<li>使用两把镊子移除小孔与每只复眼之间的外骨骼。这样便可使用两把镊子打开头部结构，并轻柔地将脑组织刮出。</li>
		<li>用镊子清除脑组织上附着的气管或脂肪组织（图2D，顶部）。脑组织清洗干净后，将其放入含有1 mL冰上预冷的洗涤缓冲液的新微量离心管中。 
		注意：视叶的损伤或缺失不会影响位于脑中央的嗅叶图2D，顶部。</li>
		<li>将所有脑组织收集并沉降至微量离心管底部后，用1 mL固定液替换洗涤缓冲液。室温下轻轻摇动固定10分钟，随后加入1 mL洗涤缓冲液，室温轻轻摇动洗涤5次，每次2分钟。</li>
		<li>在洗涤缓冲液中加入一抗（1:500），于摇床上4℃孵育过夜 4 °C，随后在室温下轻轻摇动，用1 mL洗涤缓冲液洗涤10次，每次洗涤间隔进行，总洗涤时间为2小时。</li>
		<li>在洗涤缓冲液中按1:500稀释二抗，室温避光振荡孵育2小时，用铝箔纸包裹微量离心管以避光。后续步骤中均需保持微量离心管包裹于铝箔纸中。用1 mL洗涤缓冲液振荡洗涤10次，每次室温振荡，共持续2小时。</li>
		<li>吸除上清液，用一滴抗荧光淬灭剂覆盖微型离心管中的脑组织。将脑组织在抗荧光淬灭剂中孵育至少30分钟 4 °C 在制片和成像前进行处理。</li>
		<li>准备一张盖玻片，在其上粘贴实验室胶带，并从胶带上剪出一个“T”形结构图2D，底部）。该区域用作容纳含脑组织的抗荧光淬灭试剂的空间28 将用移液器加入，最好加入两个腔室中。 
		注意：使用 20-200 µL 移液器吸头，其尖端已截去3 mm以扩大开口，便于移取含脑组织的抗荧光淬灭剂。小心地用盖玻片覆盖脑组织。</li>
		<li>使用黏土制作两条较小且均匀的条状物。确保黏土条的高度不超过盖玻片的高度。将黏土条粘附在载玻片上（图2D，底部）。将含有脑组织的盖玻片夹心结构置于黏土卷上。 
		注意：GFP标记的轴突及其突触位于脑的前部，因此从前方成像更为方便。然而，脑组织在盖玻片夹心结构中可能朝上或朝下放置。此时可用黏土卷作为夹心结构的支撑物，在成像过程中可将夹心结构翻转倒置，从而能够从前方对每个脑样本进行图像采集。</li>
		<li>沿 z 轴获取一系列光学切片 1.0 μm 使用共聚焦显微镜以特定步长采集图像，并将z轴层扫数据压缩为单个文件，用于后续分析，以评估保持完整的轴突投射数量。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="果蝇解剖与脑组织制备示意图；神经通路，嗅觉叶，触角切除" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60865/60865fig02.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2：脑内轴突死亡过程中轴突与突触形态的观察 (A) 示意图：果蝇头部的侧面观，其中细胞体、轴突和突触以 GFP 标记。B高倍放大下GFP标记的嗅觉感受神经元及其轴突和突触的前面观。细胞体位于3rd 触角节段，其轴突投射至中枢神经系统。轴突在左侧嗅叶的球状结构中形成突触，穿过中线后在对侧嗅叶的球状结构中形成突触。C) 单侧触角切除果蝇头部示例。上图：未受伤对照组。中图：第三龄幼虫触角切除rd 触角节段。底部：第2节的消融nd （因此也包括3rd）触角节。D) 大脑样本制备。上图：果蝇大脑解剖示意图，显示视野中的嗅觉叶及轴突投射。下图：大脑成像示意图。两个黏土卷（绿色）固定在载玻片（浅蓝色）上，支撑一个覆盖盖玻片的夹心结构，其中包含果蝇大脑（灰色）。大脑置于抗荧光淬灭剂（紫色）中，周围用实验室胶带（橙色）密封，并由两片盖玻片（黑色）覆盖。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60865/60865fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
3. 利用光遗传学诱导的理毛行为作为轴突和突触功能的检测指标
<ol>
	<li>光遗传学实验装置
	<ol>
		<li>在暗室中进行光遗传学实验。确保实验装置包含一个850 nm的红外（IR）LED聚光灯，用于在黑暗中照射果蝇（图3A），一个闪烁的660 nm红色LED聚光灯用于激活表达CsChrimson的神经元，以及配备700 nm长通滤光片的黑白相机，以防止记录红色闪光。</li>
		<li>使用3D打印机制造一个直径为1 cm的微型圆形行为观察室，用盖玻片覆盖，并在观察室旁放置一个与红色LED聚光灯相连的860 nm发射器（图3B). 
		注意：发射器指示红光LED聚光灯开启，从而激活神经元。</li>
		<li>将LED聚光灯和相机安装在腔室顶部（图3A，C).</li>
		<li>通过10 Hz的闪光刺激神经元10秒以激活神经元。激活持续时间可根据实验设计进行调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为光遗传学实验准备果蝇
	<ol>
		<li>将果蝇培养基在微波炉中熔化。待培养基冷却但尚未凝固时，加入乙醇（EtOH）中浓度为 20 mM 的全反式视黄醛溶液，按 1:100 的比例添加，使其终浓度达到 200 µM充分混匀后立即将培养基倒入空的试剂瓶中。 
		注意：避免将全反式视黄醛添加到热的食物中，这可能导致光遗传学效率降低。</li>
		<li>用瓶塞或棉球封住含有凝固食物的试管。用铝箔纸包裹试管，然后将装有食物的试管储存在阴暗、低温的房间中。</li>
		<li>使用5只未交配的雌性与5只雄性（图6A，第P代0）从正确的基因型中选取个体，在室温下进行杂交。传递P0 每3–4天更换至新离心管中。收集新羽化的成年子代（F代）1每天一次，在含铝箔覆盖的小瓶中培养，使其老化7至14天 200 µM 果蝇食物中的全反式视黄醛。</li>
		<li>将果蝇从含有食物的试管中轻敲至无食物的空试管中。将试管置于冰水中冷却约30秒，果蝇将进入睡眠状态。迅速将单只果蝇放入被盖玻片覆盖的小型实验腔室中图3B). 
		注意：果蝇一旦升温便会苏醒。必须迅速将每只果蝇分别放入单独的实验腔室中。避免使用 CO₂ 麻醉2 使用麻醉垫麻醉果蝇会影响其行为。</li>
		<li>利用光遗传学技术诱导触角梳理行为。该方案包含以下时间间隔：30 秒无红光，随后在 10 Hz 频率下暴露于红光 10 秒。重复此过程共三次，最后再进行一段 30 秒无红光的间隔。12,29,30. 
		注意：本方案可根据实验需求进行调整。</li>
		<li>从每个培养室中收集个体果蝇至 CO₂ 麻醉下2 垫片。对触角进行损伤处理，切除左侧和右侧的2nd 触角节（图2C）。这将去除约翰斯通器官（JO）神经元的细胞体，而轴突投射仍保留在中枢神经系统（CNS）中。将果蝇回收至含培养基的铝箔包裹的玻璃瓶中 200 µM 全反式视黄醛 
		注意：对于由光遗传学诱导的触角清洁行为，感觉神经元的细胞体位于第2节nd 触角节（图2C).</li>
		<li>在相应时间点（例如，触角切除后7天），对果蝇进行另一次梳理行为检测（返回步骤3.2.4）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="光遗传学实验装置示意图：红外和红光LED聚光灯、行为学实验舱、用于神经研究的摄像头。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60865/60865fig03.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：利用理毛行为作为轴突和突触功能读出指标的光遗传学实验装置。（A）光遗传学所需组装组件的示意图。从左至右分别为红外（IR）LED聚光灯、摄像头和红光LED聚光灯。各组件及其详细说明列于材料表中。（B）行为学实验舱的俯视示意图，包含用于指示红光LED聚光灯激活状态的红外发射器。（C）单个支架装置的示意图。共需三个支架装置，分别用于两个LED聚光灯和摄像头。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60865/60865fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

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作者声明无任何利益冲突披露。

本文所述的实验方案可实现对果蝇（Drosophila）中脱离胞体的轴突及其突触的形态和功能进行稳健且可重复的观察。翅部检测法便于在周围神经系统（PNS）中并列观察受损轴突与未受损伤的对照轴突的死亡情况14，而触角检测法则可用于观察表达GFP标记的轴突及其突触的完整神经束，从而在中枢神经系统（CNS）中同时评估其形态与功能12。在设计实验时，必须充分考虑每种方法在研究形态学方面的关键步骤和特定优势。
为了观察果蝇翅膀中周围神经系统（PNS）的轴突形态，可方便地开展实验，因为翅膀具有透明性，无需进行解剖和免疫组织化学染色。然而，由于缺乏固定步骤，翅膀在制片后必须立即进行成像14。目前常用两种不同的Gal4驱动子，分别为ok371Gal4或dpr1Gal4，这两类参考文献提供了不同的轴突退变量化方法14,26。建议通过使用&#34;带可抑制细胞标记的镶嵌分析（Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker, MARCM）&#34;14,31实现少数神经元的稀疏标记，因为该方法对轴突形态的分辨率前所未有。相比之下，在翅膀中无法观察到突触，突触位于果蝇胸部内的腹神经索中。此外，无法通过免疫组织化学方法可视化额外的轴突标记物：蜡质表皮阻碍了固定剂和抗体向下方组织的扩散。
为了观察中枢神经系统中的轴突和突触形态，必须进行脑组织解剖。该方法可通过免疫组织化学技术可视化额外的轴突和突触标记物，并在同一视野中同时观察突触与轴突。10,13已有一大批经过表征的嗅觉感受神经元（ORN）Gal4驱动品系可供使用32，且经常， OR22aGal4 是首选的驱动因子。对于触角消融，OR22a神经元的细胞体位于第3节rd 片段图2B采用基于荧光强度的定量方法来量化轴突或突触的退变程度13相反，由于需要进行脑组织解剖和抗体染色，实验耗时较长。
为了在轴突切断后可视化轴突和突触功能，采用光遗传学技术触发触角梳理行为：该行为可作为切断轴突及其突触功能保留的读出指标。12. 已对梳理行为神经环路及其相应的感觉神经元、中间神经元和运动神经元的Gal4驱动系进行了详尽描述29,30. GMR60E02Gal4 标记约翰斯通器官（JO）感觉神经元的一个亚群，该亚群对于梳理行为是必要且充分的29,30。对于触角切除，JO神经元的细胞体位于2nd 触角节（图2B）。光遗传学装置可以完全从头搭建，或对现有装置进行调整。重要的是，实验必须在暗室中进行，并使用红外（IR）LED聚光灯观察果蝇。当使用CsChrimson作为光敏通道时，必须在食物中添加全反式视黄醛，并使用红光LED聚光灯激活JO神经元29或者，可使用对蓝光敏感的通道蛋白配合蓝色LED聚光灯，或利用TrpA1通道并结合温度调控来实现神经元激活29,33梳理行为的定量分析方法已有描述。12,29.
当这些检测方法专门用于研究轴突死亡时，需要注意的是，形态学或功能上的保护表型应随时间保持显著。在某些情况下，轴突死亡会导致形态学保护表型一致但程度较轻34,35，而此类表型是否能够转化为功能上的保护仍有待确定。
在发育过程中，神经元中也观察到了轴突死亡的表型 果蝇 幼虫，其中神经受到挤压而非损伤11,23. 这里，我们特别关注成年个体 黑腹果蝇 完成发育的神经元。在此背景下，RNA干扰技术的应用36或组织特异性的CRISPR/Cas937 可轻松实施。重要的是，上述技术可用于与轴突死亡无关的情境中：它们有助于表征神经元维持因子38轴突运输39，与年龄相关的轴突线粒体变化40轴突线粒体的形态41.

神经元的形态完整性对于维持终身的神经系统功能至关重要。神经元体积的绝大部分由轴突构成1,2；因此，长期维持特别长的轴突是神经系统面临的一项重大生物学和生物能量学挑战。目前已发现多种轴突内在和胶质细胞外在的支持机制，可确保轴突的终身存活。这些机制的损伤会导致轴突变性3，而轴突变性是神经系统在疾病状态或受到机械或化学因素刺激时常见的特征4,5。然而，在任何情况下，轴突变性的分子机制仍不清楚，这使得开发有效阻止轴突丢失的治疗方法变得困难。针对这些神经系统疾病开发有效的疗法具有重要意义，因为它们给社会带来了巨大的负担6。
损伤诱导的轴突变性为研究切断的轴突如何自主解体提供了一个简单的模型。这种现象于1850年由奥古斯特斯·瓦勒尔（Augustus Waller）发现并以其名字命名，称为瓦勒变性（Wallerian degeneration, WD），它是一个涵盖两种在分子机制上可区分过程的统称7。首先，在轴突损伤后，与胞体分离的轴突会在损伤后一天内通过一种进化上保守的轴突死亡信号通路主动执行自我破坏（即轴突死亡）8。其次，周围的胶质细胞和特化的吞噬细胞会在三到五天内识别并清除所产生的轴突碎片。抑制轴突死亡信号通路可使切断的轴突在数周内保持完整9,10,11,12，而抑制胶质细胞的吞噬作用则导致轴突碎片在体内持续存在数周13,14,15。
在果蝇、小鼠、大鼠和斑马鱼中的研究揭示了若干在进化上保守且对轴突死亡信号传导至关重要的中介分子8。轴突死亡突变体中含有被切断的轴突和突触，这些结构无法发生轴突死亡；在缺乏胞体支持的情况下，它们在形态和功能上可保持完整达数周之久9,10,12,13,16,17,18,19,20,21,22,23。这些中介分子的发现与表征推动了执行轴突死亡的分子通路的定义。重要的是，轴突死亡信号通路的激活不仅发生在轴突被切断、压伤或拉伸的情况下24,25；它似乎也在多种神经系统疾病动物模型中发挥作用（例如，轴突以非损伤依赖的方式发生退变4，但可产生一系列有益效应4,8）。因此，阐明轴突损伤后轴突死亡如何执行退变过程，可能超越简单的损伤模型提供更深入的见解；同时也可能为治疗干预提供潜在靶点。
果蝇Drosophila melanogaster（Drosophila）已被证明是研究轴突死亡信号通路的宝贵模型系统。在果蝇中的研究揭示了四个关键的、在进化上保守的轴突死亡基因：highwire (hiw)11,14、dnmnat12,26、dsarm10 和 axundead (axed)12。对这些信号分子的修饰——包括hiw、dsarm和axed的功能缺失突变，以及dnmnat的过表达——能够强有力地阻断果蝇整个生命周期中的轴突死亡。虽然切断的野生型轴突在1天内即发生轴突退变，但缺失hiw、dsarm或axed的切断轴突及其突触不仅在形态上，而且在功能上均可保持完整达数周之久。是否通过高水平表达dnmnat也能实现功能的保留，仍有待确定。
本文将介绍三种简单且近期开发的实验方案，用于研究在缺乏胞体支持的情况下轴突的死亡过程（例如，切断后的轴突及其突触随时间推移的形态和功能变化）。我们将展示在hiw基因功能缺失突变（hiw∆N）条件下，轴突退变受到抑制后，切断的轴突如何在形态上得以保持；同时展示在过表达dnmnat（dnmnatOE）时，轴突退变被抑制后，切断的轴突及其突触至少在7天内仍能维持功能完整性。这些实验方案可用于观察中枢神经系统（CNS）或外周神经系统（PNS）中单个轴突和突触的形态变化13,14；而对于中枢神经系统中切断轴突及其突触的功能性保存，可通过简单的光遗传学装置结合梳理行为作为行为学读出方式进行可视化检测12。

<table><tbody><tr><td>镊子（高精度，超细）</td><td>EMS</td><td>78520-5</td><td>触角切除</td></tr><tr><td>微型剪刀（5 mm 切割刃）</td><td>EMS</td><td>72933-04</td><td>翅损伤</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管</td><td>Eppendorf</td><td>30120086.0000</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 组织培养皿</td><td>Sarstedt</td><td>83.3900</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片，厚度 1</td><td>Thermo Scientific&amp;trade;</td><td>BB02400600A113MNT0</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost 显微镜载玻片</td><td>Thermo Scientific&amp;trade;</td><td>AA00008032E00MNT10</td><td></td></tr><tr><td>高灵敏度 USB 2.0 CMOS 相机，1280 x 1024，全局快门</td><td>Thorlabs</td><td>DCC1240M</td><td>相机装置</td></tr><tr><td>用于 &amp;Oslash;1&quot; 镜筒和支架的 SM1 固定环</td><td>Thorlabs</td><td>SM1RR</td><td></td></tr><tr><td>25 mm 1/1.2&quot; C 接口镜头</td><td>Tamron</td><td>M112FM25</td><td></td></tr><tr><td>带外螺纹 M27 x 0.5 和内螺纹 SM1 的转接器</td><td>Thorlabs</td><td>SM1A36</td><td></td></tr><tr><td>非球面聚光镜，&amp;Oslash;25 mm，f=20.1 mm，NA=0.60，增透膜：650–1050 nm</td><td>Thorlabs</td><td>ACL2520U-B</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Oslash;25.0 mm 高级长通滤光片，起始波长：700 nm</td><td>Thorlabs</td><td>FELH0700</td><td></td></tr><tr><td>SM1 (1.035&quot;-40) 外螺纹连接器，长度 0.5&quot;</td><td>Thorlabs</td><td>SM1T2</td><td></td></tr><tr><td>无外螺纹 SM1 镜筒，长度 1&quot;，附带两个固定环</td><td>Thorlabs</td><td>SM1M10</td><td></td></tr><tr><td>850 nm，900 mW（最小值）安装式 LED，1200 mA</td><td>Thorlabs</td><td>M850L3</td><td>红外 LED 聚光灯</td></tr><tr><td>SM1 (1.035&quot;-40) 外螺纹连接器，长度 0.5&quot;</td><td>Thorlabs</td><td>SM1T2</td><td></td></tr><tr><td>无外螺纹 SM1 镜筒，长度 2&quot;，附带两个固定环</td><td>Thorlabs</td><td>SM1M20</td><td></td></tr><tr><td>非球面聚光镜，&amp;Oslash;25 mm，f=20.1 mm，NA=0.60，增透膜：650–1050 nm</td><td>Thorlabs</td><td>ACL2520U-B</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Oslash;25.0 mm 高级长通滤光片，起始波长：850 nm</td><td>Thorlabs</td><td>FELH0850</td><td></td></tr><tr><td>用于 &amp;Oslash;1&quot; 镜筒和支架的 SM1 固定环</td><td>Thorlabs</td><td>SM1RR</td><td></td></tr><tr><td>660 nm，940 mW（最小值）安装式 LED，1200 mA</td><td>Thorlabs</td><td>M660L4</td><td>红色 LED 聚光灯</td></tr><tr><td>非球面聚光镜，&amp;Oslash;25 mm，f=20.1 mm，NA=0.60，增透膜：650–1050 nm</td><td>Thorlabs</td><td>ACL2520U-B</td><td></td></tr><tr><td>SM1 (1.035&quot;-40) 外螺纹连接器，长度 0.5&quot;</td><td>Thorlabs</td><td>SM1T2</td><td></td></tr><tr><td>无外螺纹 SM1 镜筒，长度 2&quot;，附带两个固定环</td><td>Thorlabs</td><td>SM1M20</td><td></td></tr><tr><td>15 V，2.4 A 电源单元，带 3.5 mm 插孔连接器，用于一个 K- 或 T-立方体</td><td>Thorlabs</td><td>KPS101</td><td>LED 控制</td></tr><tr><td>T-立方体 LED 驱动器，最大驱动电流 1200 mA</td><td>Thorlabs</td><td>LEDD1B</td><td></td></tr><tr><td>150 mm x 300 mm x 12.7 mm 铝制光学平台，M6 双密度螺纹孔</td><td>Thorlabs</td><td>MB1530/M</td><td>安装底座</td></tr><tr><td>&amp;Oslash;12.7 mm 通用支架夹，弹簧加载锁紧旋钮，L = 75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>UPH75/M</td><td>支架，3 个（红外 LED、红色 LED、相机）</td></tr><tr><td>&amp;Oslash;1.20&quot; 滑环，用于 SM1 镜筒和 C 接口延长管，M4 螺纹孔</td><td>Thorlabs</td><td>SM1RC/M</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Oslash;12.7 mm 光学支架，不锈钢，M4 紧定螺钉，M6 螺纹孔，L = 150 mm</td><td>Thorlabs</td><td>TR150/M</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Oslash;12.7 mm 光学支架，不锈钢，M4 紧定螺钉，M6 螺纹孔，L = 40 mm</td><td>Thorlabs</td><td>TR40/M</td><td></td></tr><tr><td>用于 &amp;Oslash;1/2&quot; 支架的直角夹具，5 mm 六角扳手</td><td>Thorlabs</td><td>RA90/M</td><td></td></tr><tr><td>M6 x 1.0 不锈钢帽头螺钉，长 16 mm，25 个装</td><td>Thorlabs</td><td>SH6MS16</td><td>用于将支架固定到底座的螺钉</td></tr><tr><td>USB-6001 14 位 20 kS/s 多功能 I/O 及 NI-DAQmx</td><td>National Instruments</td><td>782604-01</td><td>红色 LED 聚光灯控制器</td></tr><tr><td>20 kΩ 单联线性面板安装电位器</td><td>TT Electronics/BI</td><td>P230-2EC22BR20K</td><td>指示器微调器</td></tr><tr><td>红外（860 nm）发射器，100 mA 径向</td><td>Osram</td><td>475-1365-ND</td><td>红光指示器</td></tr><tr><td>电缆</td><td>-</td><td>-</td><td>杂项</td></tr><tr><td>全反式视黄醛</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>无水乙醇</td><td>Vwr</td><td>20821.296</td><td></td></tr><tr><td>卤代烃油 27</td><td>Sigma</td><td>H8773</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>Merk</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅酮弹性体基础组分</td><td>Dow Corning Corp</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅酮弹性体固化剂</td><td>Dow Corning Corp</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>鸡抗 GFP 抗体</td><td>Rockland</td><td>600-901-215</td><td>抗体</td></tr><tr><td>山羊 Dylight 抗鸡抗体</td><td>Abcam</td><td>ab96947</td><td></td></tr><tr><td>FM7a, B</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_785</td><td>&lt;strong&gt;X 染色体&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>FRT19A[hs-neo]</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_1709</td><td></td></tr><tr><td>hiw[&amp;Delta;N]</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_51637</td><td></td></tr><tr><td>hs-FLP[12]</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_1929</td><td></td></tr><tr><td>tub-Gal80[LL1]</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_5132</td><td></td></tr><tr><td>w[1118]</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_3605</td><td></td></tr><tr><td>20xUAS-IVS-CsChrimson::mVenus</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_55135</td><td>&lt;strong&gt;第 2 染色体&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>5xUAS-Gal4[12B]</td><td>Kyoto</td><td>RRID:Kyoto_108492</td><td></td></tr><tr><td>5xUAS-HA::dnmnat</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_39702</td><td></td></tr><tr><td>5xUAS-mCD8::GFP[LL5]</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_5134</td><td></td></tr><tr><td>ase-FLP[2d]</td><td>Freeman 实验室</td><td>Neukomm 等，2014（PNAS）</td><td></td></tr><tr><td>CyO</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_2555</td><td></td></tr><tr><td>dpr1-Gal4</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_25083</td><td></td></tr><tr><td>OR22a-Gal4</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_9952</td><td></td></tr><tr><td>ey-FLP[6]</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_5577</td><td>&lt;strong&gt;第 3 染色体&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>GMR60E02-Gal4</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_39250</td><td></td></tr><tr><td>TM3,Sb,e</td><td>BDSC</td><td>RRID:BDSC_3644</td><td></td></tr></tbody></table>

在drosophila melanogaster轴突死亡过程中对轴突及其突触的形态学与功能评估

Morphological and Functional Evaluation of Axons and their Synapses during Axon Death in Drosophila melanogaster

轴突变性是神经退行性疾病以及神经系统受到机械或化学刺激时的共同特征。然而，我们对轴突变性分子机制的理解仍然有限。由损伤诱导的轴突变性可作为研究切断后的轴突如何自主解体（即轴突死亡）的简单模型。近年来，研究人员已从果蝇到哺乳动物中鉴定出一条进化上保守的轴突死亡信号级联通路，该通路对于轴突在损伤后发生变性至关重要。相反，若轴突死亡信号减弱，则可实现切断轴突及其突触在形态和功能上的保存。本文介绍了三种简单且近期建立的实验方案，可用于观察果蝇Drosophila中与神经元胞体分离后的切断轴突的轴突形态，或其轴突与突触功能。轴突形态可在翅膀中进行观察，其中部分损伤可导致同一神经束内损伤轴突（发生轴突死亡）与未损伤对照轴突并存。此外，也可在脑组织中观察轴突形态，此时通过触角切除引发整个神经束发生轴突死亡。切断轴突及其突触的功能保存可通过一种简单的光遗传学方法结合突触后梳理行为来评估。我们以highwire基因功能缺失突变以及过表达dnmnat为例进行说明，这两种干预均可使轴突死亡延迟数周至数月。重要的是，这些实验方案不仅适用于损伤研究，还可用于神经元维持因子、轴突运输及轴突线粒体功能的表征。

上述，我们描述了三种研究被切断的轴突及其突触形态与功能的方法。第一种方法可用于对外周神经系统（PNS）中单个轴突进行高分辨率观察，需利用MARCM技术产生的克隆14,31。在此，我们进行了杂交以产生野生型和highwire突变体的MARCM克隆（图4A）。在翅膀中部进行简单切割，可诱导位于远端（例如翅膀外侧）神经元的轴突损伤，而近端神经元（例如切割位点与胸部之间的神经元）则保持未受损状态。该方法使得在同一神经束内，能够并列观察损伤轴突与未损伤对照轴突的死亡过程（图1A、图4B）。本实验中，我们采用了一种遗传背景，使得GFP标记的克隆数量较少（例如每次实验约两个克隆14）。我们展示了野生型轴突在损伤后1天和7天的实例，分别用于说明对照轴突、正在经历轴突退变的轴突，以及被周围胶质细胞清除的轴突碎片。此外，我们在highwire突变体中重复了轴突损伤实验，并分析了损伤后7天的结果。
未受伤的对照组翅中包含两个野生型克隆，因此有两条GFP标记的野生型轴突图4B，野生型，未损伤对照）。使用显微剪刀切断翅中段后一天，细胞体位于切口远端的GFP标记轴突发生轴突变性，而细胞体位于近端的轴突在同一神经束内作为内部对照图4B，野生型，损伤后1天）。注意箭头所示上方区域的轴突碎片痕迹。轴突损伤7天后，周围胶质细胞清除GFP标记的轴突碎片，而GFP标记的未损伤对照轴突仍保留在神经束中（图4B，野生型，损伤后7天，箭头所示）。相比之下， highwire 断裂7天的突变体轴突在形态上仍保持完整，与先前的研究结果一致11,14 (图4B, highwire，损伤后7天，箭头所示）。这些结果展示了该方法强大的视觉分辨率 果蝇 翅。在同一神经束中，可观察到受损轴突与未受伤的对照轴突并列存在。野生型轴突在损伤后1天内发生轴突退变，其残留碎片在7天内被清除，而轴突退变缺陷的 highwire 突变体在7天内保持形态完整。
<img alt="野生型与highwire突变体损伤后基因表达分析图及神经再生比较" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60865/60865fig04.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：研究翅中GFP标记的感觉神经元轴突死亡的方法。（A）在翅中产生野生型和highwire克隆的示意图（分别为P0代和F1代）。雌性果蝇位于左侧，雄性位于右侧。基因型详细信息见材料表。（B）对照组与损伤后GFP标记轴突的示例。视野范围如（图 1A）所示。从左至右依次为：未损伤的野生型对照轴突、损伤后1天的野生型轴突、损伤后7天的野生型轴突、损伤后7天的highwire突变体轴突。箭头指示断裂的轴突，比例尺 = 5 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60865/60865fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
第二种方法描述了如何可视化投射到中枢神经系统内的完整轴突束，这些轴突束形成突触，其神经元胞体位于左右两侧触角内图2A-C）。在此，我们进行了杂交以产生野生型和 highwire 突变MARCM克隆（图5A）。在未受损伤的情况下，可在数天至数周的时间内观察到未受伤的、GFP标记的轴突及其突触图5B，野生型，未受伤对照）。或者，可将动物 subjected 至 3rd 触角节段切除后，可观察到被切断的GFP标记的轴突及其突触在数小时至数天内的动态变化过程。我们重点关注触角切除后7天的时间点，因为在此时，轴突及其突触已完成轴突退变，其产生的碎片已被周围胶质细胞完全清除。若实施右侧触角的单侧切除，则右侧轴突束被切断并发生解体，损伤后7天内所产生的碎片将被完全清除。图5B，野生型，单侧消融，损伤后7天，箭头），与先前的研究结果一致13或者，可以同时切除左右两侧的触角，这将切断两束轴突；损伤后7天，轴突及其突触均消失（图5B，野生型，双侧消融，损伤后7天，箭头所示）。相比之下，右侧触角单侧消融在 highwire 突变体在损伤后7天仍保持轴突的完整，与先前的研究结果一致11,14 (图5B, highwire，单侧消融，损伤后7天，箭头）。这些结果表明，断裂的野生型轴突会发生轴突退变，且其残余碎片在7天内被清除，而轴突退变缺陷的 highwire 突变体无法发生轴突死亡，并在形态上保持完整达7天。
<img alt="显示果蝇基因型的基因工程示意图；神经消融恢复的显微图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60865/60865fig05.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5：研究脑内GFP标记的感觉神经元轴突死亡的方法。（A）在脑中产生野生型和highwire克隆的杂交示意图（分别为P0代和F1代）。雌性 virgin 位于左侧，雄性位于右侧。基因型详细信息见材料表。（B）对照组和损伤后GFP标记轴突的示例。从左至右依次为：未损伤的野生型对照、单侧触角消融后7天的野生型、双侧触角消融后7天的野生型、单侧触角消融后7天的highwire突变体。箭头指示断裂的轴突束，比例尺 = 10 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60865/60865fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
第三种方法可用于观察中枢神经系统中被切断的轴突及其突触的功能保存情况。该方法依赖于对位于2区的一小部分JO神经元进行操控。nd 足以诱导触角梳理行为的触角节段。在约翰斯顿器官（JO）神经元中表达红移通道视紫红质（CsChrimson），并结合饮食补充全反式视黄醛，可在红光照射下引发简单的突触后梳理行为。12,30在此，我们进行了杂交实验以生成野生型JO神经元以及过表达JO神经元 dnmnat (dnmnatOE) (图6A）。野生型果蝇或轴突退化减弱的JO神经元果蝇（dnmnatOE），两者在受伤前均表现出强烈的理毛行为。然而，在受伤后7天（例如，双侧消融2nd 触角节段），由于损伤诱导的轴突和突触退化，野生型果蝇无法通过光遗传学诱导产生理毛行为，而轴突死亡减弱的个体则继续表现出理毛行为（图6B, 视频 1,2因此，减弱的轴突死亡能够功能性地保存被切断的轴突及其突触长达7天。
<img alt="果蝇中显示红光反应的遗传构建图谱和行为分析图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60865/60865fig06.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：轴突切断后可视化轴突和突触功能的方法。（A）用于生成野生型和在JO感觉神经元中过表达dnmnat的果蝇的杂交示意图（分别为P0代和F1代）。雌性个体位于左侧，雄性个体位于右侧。基因型详细信息见材料表。（B）光遗传学诱导的梳理行为个体ethogram图。上图：野生型果蝇在损伤前及损伤后7天的个体ethogram图（蓝色）。下图：在JO神经元中过表达dnmnat（dnmnatOE）的果蝇在损伤前及损伤后7天的个体ethogram图（红色）。每个条形表示在1秒内至少发生一次梳理行为。黑色线条表示所有条形的总和。（C）梳理行为的量化分析。数据以平均值±标准差表示，p &gt; 0.001（单因素方差分析，Tukey事后检验进行多重比较）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60865/60865fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
视频 1：通过光遗传学在触角切除前以及切除后 7 天诱导出的代表性野生型梳理行为。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60865/Movie_1_wild_type.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>
视频 2：在触角切除前及切除后 7 天，于 JO 神经元中过表达 dnmnat 的果蝇通过光遗传学诱导出的代表性理毛行为。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60865/Movie_2_nmnat.mp4" target="_blank">请点击此处下载该视频。</a>

本文提供了在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中进行三种简单损伤诱导的轴突变性（轴突死亡）检测的实验方案，用于评估被切断的轴突及其突触在形态和功能上的保存情况。

在Drosophila melanogaster轴突死亡过程中对轴突及其突触的形态学与功能评估

轴突退化是神经退行性疾病以及神经系统受到机械或化学因素损伤时的共同特征。然而，我们……

本果蝇损伤实验方案的总体目标是观察轴突及其突触的形态保持情况，以及突触功能。这些检测方法还可用于表征神经元维持因子、研究轴突运输或分析完整轴突内的轴突细胞器。果蝇翅膀部分损伤检测法能够在同一神经束内，对发生退变的损伤轴突与未损伤的对照轴突进行并行观察。该损伤实验可预先在野生型果蝇中进行，使用显微剪刀在翅中部大致位置进行切割。内部损伤可用于评估轴突形态，并结合光遗传学技术来观察轴突及其突触功能的保存情况。触角切除需要操作者手部稳定。建议事先在野生型果蝇中练习去除触角的操作。此外，任何可用的光遗传学装置均可用于激活戴帽果蝇中的神经元。否则，也可以从头搭建一个简单的装置。首先，选取五只未交配的雌性个体和五只雄性个体（具有目标基因型），在室温下进行杂交。每隔三至四天，将 P0 代转移至新的培养瓶中。每天收集新羽化的成年 F1 代子代，放入新的培养瓶中，并培养 7 至 14 天。麻醉后，使用显微剪刀在翅内侧翅脉的大致中点处进行剪切。一只翅用于造成损伤，另一只翅作为年龄匹配的未损伤对照。每只翅施加一次损伤，并确保共获得15只损伤翅。将果蝇回收至含有食物的小瓶中。随后，用移液器将10微升卤代烃油27均匀涂抹在整个玻片表面。在损伤后一天或七天，使用显微剪刀剪下受损翅膀以及未受损的对照翅膀。使用镊子在翅的中心位置夹取，将最多四片翅置于卤代烃油 27 中，并加盖盖玻片。利用转盘共聚焦显微镜可轻松获取翅中 GFP 标记神经元的图像。然而，由于样本未固定，加样后必须在八分钟内完成图像采集。立即使用转盘显微镜对翅膀进行成像。沿Z轴以0.33微米的步长采集一系列光学切片，并将Z轴图像堆栈压缩为单个文件以供后续分析。将五只未交配的雌性与五只相应基因型的雄性杂交，按前述方法收集F1代。麻醉后，使用镊子压碎右侧第三触角节以进行单侧消融，或同时压碎左右两侧第三触角节以进行双侧消融。该操作可去除表达GFP的神经元胞体，而其轴突投射仍保留在中枢神经系统中。根据本技术中所用的GFP标记神经元，需明确神经元胞体位于第三触角节还是第二触角节，以便后续进行损伤实验。将果蝇回收至含有食物的试剂管中。麻醉后，用镊子夹住颈部，另一把镊子固定胸部，轻轻将头部和颈部从胸部拉下。用镊子夹取已浸入固定液的样品，将所有头部组织转移至含有1毫升固定液（含4%多聚甲醛和0.1% Triton X-100的PBS溶液）的1.5毫升微量离心管中。在室温下轻轻振荡固定20分钟。随后将微量离心管置于冰上，使头部组织沉降至管底。用移液器吸去上清液，加入1毫升含0.1% Triton X-100的PBS洗涤缓冲液。将离心管置于室温下的旋转摇床上洗涤2分钟。重复洗涤四次，以去除残留的固定液。制备脑组织后，取一片盖玻片，在其上粘贴实验室胶带，并将胶带剪成“T”形。使用20至200微升的移液枪头，将其尖端剪去约3毫米，以扩大移液口。用该移液枪将含有抗荧光淬灭剂的脑组织样品移至载玻片上，然后用盖玻片覆盖脑组织。用黏土制作两条较小且均匀的条状物。确保黏土条的高度不超过载玻片的高度。将黏土条粘贴在载玻片上，然后将含有脑组织的盖玻片夹心结构放置在黏土条上。按照文稿步骤进行操作。为准备用于光遗传学实验的果蝇，首先将果蝇培养基在微波炉中融化。待培养基冷却但尚未凝固时，加入溶于乙醇的20毫摩尔全反式视黄醛，使其终浓度达到200微摩尔。充分混匀后立即将培养基倒入空的试剂瓶中。用塞子或脱脂棉封住装有凝固培养基的试剂瓶。用铝箔包裹试剂瓶。然后，将含有食物的离心管置于避光的低温房间中保存。取五只未交配的雌性个体和五只相应基因型的雄性个体，在室温下进行杂交，将F1代收集到铝箔包裹的离心管中，管内食物含有200 µM全反式视黄醛。接着，通过轻敲将含有食物的离心管中的果蝇转移至不含食物的空离心管中以收集果蝇。将小管放入含水的冰中冷却约30秒，果蝇会进入睡眠状态。随后，迅速将单个果蝇放入被盖玻片覆盖的小室中，以进行光遗传学实验。在暗室中，执行以下程序：先进行30秒无红光照射，随后进行10秒、10赫兹的红光照射。重复此过程共三次，最后再进行一次额外的30秒无红光照射间隔。从每个小室中收集个体果蝇，置于二氧化碳垫上。为了对它们进行触角损伤处理，消融左右两侧的第二触角节段。这将去除约翰斯通氏器官神经元的胞体，而轴突投射仍保留在中枢神经系统中。将果蝇回收至含有200毫摩尔全反式视黄醛的铝箔包裹的玻璃小瓶中。在相应的时间点，例如触角切除后七天，对果蝇进行另一次梳理行为检测。本方案中介绍了三种研究被切断的轴突及其突触形态与功能的方法。第一种方法可实现对外周神经系统中单个轴突的高分辨率观察。此处展示了在翅中产生野生型和highwire突变克隆的示意图杂交方案。图中还展示了损伤后GFP标记轴突的对照结果，箭头指示了被切断的轴突。此外，还介绍了第二种研究脑内GFP标记的感觉神经元轴突死亡的方法。此处展示了用于在脑中产生野生型和 highwire 克隆的示意图杂交方案。图中示例显示了损伤后对照组中GFP标记的轴突，箭头指示被切断的轴突束。第三种方法展示了在轴突切断后观察轴突和突触功能的研究途径。此处展示了用于产生野生型和过表达 dnmnat 的约翰斯顿器官感觉神经元的示意图杂交方案。野生型果蝇含有轴突退化受到抑制的约翰斯顿器官神经元。两种果蝇在损伤前均表现出强烈的梳理行为。然而，在损伤后七天，野生型果蝇无法通过光遗传学诱导产生理毛行为，而轴突退变减弱的果蝇仍能继续理毛。在此，我们利用基因功能缺失突变或基因表达操作来观察轴突形态或突触功能的保留情况。也可应用其他修饰方法，例如RNA干扰介导的基因敲低或组织特异性的CRISPR-Cas9介导的基因敲除。这些方法可用于与损伤无关的研究场景，能够对完整轴突中的神经元维持因子在衰老过程、轴突运输及轴突细胞器中的作用进行观察和表征。

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