在果蝇黑色无gaster的Axon死亡期间，对Axon及其突触的形态和功能评估
2020年3月16日
在这里，我们提供协议，在果蝇黑色素气仪中执行三个简单的伤害诱发的斧子退化（斧子死亡）测定，以评估被切断的斧子及其突触的形态和功能保存。
这个果蝇损伤协议的总体目标是观察轴突和突触形态的保存，以及轴突及其突触的突触功能。这些分析也可用于描述神经元维持因子，研究轴管传输，或分析轴管器官在完整的轴孔。部分翼损伤检测允许观察受伤的轴子同时退化，在果蝇翼的同一神经束内有未受伤的控制轴。
这种损伤分析可以很容易地事先练习在野生型苍蝇，应用一个切口大致在翅膀中间用微剪刀。内伤允许评估轴突形态，并使用光遗传学来可视化轴突及其突触的功能保存。天线消融需要稳定的手。
还建议事先练习在野生型苍蝇中去除天线。在成瘾中，任何可用的光遗传学设置都适合激活带帽子的苍蝇中的神经元。否则，可以从头开始构建简单的设置。
首先，使用5个处女和5个男性从正确的基因型执行交叉在室温下。每三到四天将 P0 代转移到新瓶中。每天将新鲜封闭的成年后代F1一代收集到新的小瓶中，并老化7至14天。
麻醉后，使用微剪刀切割翼的内翼静脉大致在机翼中间。使用一个翅膀受伤，另一个翅膀作为年龄匹配没有受伤的控制。每个机翼受一次伤害，确保 15 个翅膀受伤。
回收含有小瓶的食物中的苍蝇。接下来，用移液器，沿整个玻璃滑梯铺开 10 微升卤化碳油 27。受伤后一七天，使用微剪刀切断伤员以及未受伤的控制翼。
使用钳子抓住中间的机翼，将最大四个翅膀安装到卤化油 27 中，然后用盖板幻灯片盖住它们。在机翼中标记的GP神经元的图像可以很容易地通过旋转的磁盘获得。但是，采集时间必须在安装后 8 分钟内完成，因为菜不是固定的。
立即使用旋转的磁盘显微镜对机翼进行成像。沿 Z 轴获取一系列光学截面，尺寸为 0.33 微米，并压缩 Z 堆栈到单个文件中进行后续分析。交叉五个处女和五个男性从正确的基因型和收集F1一代一样， 如以前。
麻醉后，使用钳子将右三天线段的斜点进行单边消融，或左右三天线段进行双边消融。这删除GP标记神经元细胞体，而他们的斧质投影留在CNS。根据该技术中使用的 GFP 标记神经元，了解细胞体是位于第三个天线段还是第二个天线段中以进行后续损伤检测，这一点非常重要。
回收含有小瓶的食物中的苍蝇。麻醉后，用钳子抓住脖子，用另一个钳子固定胸部。轻轻拉颈部，头从胸部。
使用浸入固定溶液中的钳子，将所有头转移到含有 4%对甲醛和 PBS 中 0.1 三吨 X100 的 1.5 毫升微离心管中。在室温下轻轻搅拌，将头部固定20分钟。然后将微离心管放在冰上，将头吸引到微离心管的底部。
用移液器取出上流液，并在PBS中加入含有0.1%三吨X100的洗涤缓冲液。将管子放在转轮上，在室温下清洗两分钟。重复洗涤四次以去除残留的固定溶液。
准备大脑后，获取盖幻灯片，将实验室胶带粘在其上，然后从磁带上切出一个 T 形形状。使用 20 到 200 微升移液器尖端，其中 3 毫米的尖端被切断，以扩大移液器的开口。将含有抗fade试剂的大脑移到幻灯片上，用盖板幻灯片盖住大脑。
使用粘土准备两个小的均匀卷。确保粘土辊不高于玻璃滑梯的高度。将粘土卷贴在玻璃滑梯上，将含有盖板的三明治的大脑放在粘土辊上。
按照手稿进行。为了准备苍蝇的光遗传学，首先融化飞在微波炉的食物。食物冷却后，在凝固之前，在乙醇中加入20毫摩尔，最终浓度为200微摩尔。
混合好，立即将食物倒入空小瓶中。用插头或棉球盖住含有凝固食物的小瓶。用铝箔包裹小瓶。
然后，将含有小瓶的食物存放在黑暗的寒冷房间里。使用五个处女和五个雄性从正确的基因型执行交叉在室温下，并收集F1生成之前在铝覆盖小瓶包含200微摩尔所有跨视网膜在飞行食品。接下来，收集苍蝇从含有小瓶的食物到一个空小瓶没有食物。
在含水冰中冷却小瓶约30秒。苍蝇睡着了。现在，迅速把单个苍蝇放入小房间，盖上盖板幻灯片，以执行光遗传学。
在黑暗的房间里，执行由红灯不存在的 30 秒组成的协议，然后是 10 秒的红灯照射，10 赫兹。重复此过程总共三次，然后再重复 30 秒的间隔，其中红灯不存在。从每个腔室收集两氧化碳垫上的单个苍蝇。
要使它们受到天线损伤，请同时放弃左二天线段。这移除了约翰斯顿器官神经元的细胞体，而斧弓投影仍保留在CNS中。恢复苍蝇在铝覆盖小瓶包含200毫摩尔所有跨视网膜。
在相应的时间点，例如天线消融后七天，对苍蝇进行另一次梳妆检测。在该协议中，提出了三种方法，以研究被切断轴突及其突触的形态和功能。第一种方法允许对周围神经系统中的单个轴子进行高分辨率观察。
此处显示了用于生成机翼中野生型和高线克隆的原理图交叉。受伤的 GFP 标记轴的控件也显示箭头，指示被切断的轴子。提出了研究GP标记在大脑中的感官神经元轴子轴子的轴子死亡的第二种方法。
图式交叉生成野生类型和高线克隆在大脑中显示这里。在受伤的 GFP 标记轴翁中控制的示例显示箭头，指示被切断的轴翁束。第三种方法演示了在弓形切除术后可视化斧解和突触功能的方法。
原理图交叉产生野生型和dnmnat过度表达约翰斯顿的器官感觉神经元显示在这里。野生型苍蝇是含有约翰斯顿器官神经元的苍蝇，其衰减轴突死亡。两人受伤前都怀有强烈的梳妆打扮行为。
然而，受伤后7天，在野生型苍蝇的光遗传学中，梳妆未能引起，而动物与衰减的轴龙死亡继续梳理。在这里，我们使用功能突变或基因表达的丧失来观察斧星形态或突触功能的保存。可应用其他修改方法，如击倒RNA干扰或组织特定的CRISPR-Cas9中培养。
此方法可用于与伤害无关的上下文中。它们允许在衰老、轴管传输和完整轴孔的轴管中观察和表征神经元维持因子。
概述
本研究提供了在果蝇中进行诱导轴突退化测定的协议，重点评估切断轴突及其突触的形态和功能保存情况。这些测定旨在了解神经元维持因子并评估轴突运输。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 轴突退化
- 神经元维持
背景
- 轴突退化和突触维持对神经元健康至关重要。
- 果蝇是研究这些过程的有用模型。
- 了解受伤后的突触功能可以为神经退行性疾病提供见解。
- 先前的研究强调了神经元维持因子的重要性。
研究目的
- 确定受伤如何影响轴突和突触的形态和功能。
- 表征对神经元维持有贡献的因素。
- 能够分析完整轴突中的轴突运输和细胞器。
使用的方法
- 协议包括进行轴突损伤测定和细胞成像。
- 使用的生物模型是果蝇，重点是轴突损伤和随后的恢复评估。
- 文本中未提及多组学工作流程。
- 关键步骤包括执行精确的翅膀损伤和使用光遗传学可视化神经元活动。
- 通过使用GFP标记的成像技术和对突触特征的仔细分析评估损伤。
主要结果
- 这些方法成功地允许对受伤和未受伤轴突进行并排比较。
- 可以获得有关受伤后突触功能保存的重要见解。
- 该研究说明了确保准确形态评估的图像获取的关键时间线。
- 结论强调了理解神经元对损伤的反应和潜在修复机制的重要性。
结论
- 这项研究为在模型生物中评估轴突损伤和恢复机制提供了有价值的协议。
- 结果促进了对神经元健康、损伤反应和突触维持的进一步研究。
- 强调了理解神经退行性疾病和潜在治疗见解的意义。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding axon degeneration mechanisms is critical for de-risking neurodegenerative disease targets and identifying neuroprotective strategies. These Drosophila protocols enable mechanistic evaluation of axonal and synaptic preservation, supporting target validation in early discovery. The assays provide quantitative, side-by-side comparison of degeneration and protection phenotypes, enhancing predictive confidence in lead identification.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by assessing axonal and synaptic morphology after injury.
- Scientific Value: Supports functional target validation through optogenetic assessment of synaptic transmission in severed axons.
- Operational Value: Facilitates biological de-risking using highwire loss-of-function and dnmnat overexpression models that delay axon death.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible axonal injury models with internal controls (injured vs. uninjured axons in same nerve bundle).
- Operational Value: Enables high-resolution imaging of GFP-labeled axons for morphology quantification and comparison.
- Operational Value: Supports assay readiness for screening neuronal maintenance factors, axonal transport, and organelle dynamics.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system to study conserved axon death signaling cascades from flies to mammals.
- Scientific Value: Enables assessment of synaptic function preservation via optogenetically driven grooming behavior as a functional readout.
- Operational Value: Supports translational biomarker alignment by correlating morphological preservation with functional output.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows for target validation, lead identification, and preclinical assessment of neuroprotective candidates. It enables hypothesis testing of axonal degeneration pathways and supports go/no-go decisions based on morphological and functional preservation data.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and mechanistic de-risking of axon death signaling cascades using genetic and pharmacological perturbations.
- Screening: Delivers quantitative morphological outputs and functional synaptic readouts for compound or genetic modifier evaluation.
- Analytics: Enables side-by-side comparison of injured and control axons within identical environments, reducing variability and enhancing data reliability.
- Translational Research: Connects Drosophila axon death mechanisms to mammalian neurodegenerative disease models through conserved pathways like Sarm and DLK.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying neuronal maintenance factors, axonal transport, and mitochondrial health across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by linking axonal preservation to functional synaptic outcomes.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible assays with internal controls that reduce experimental noise and improve throughput.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of neuroprotective targets before costly mammalian studies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing mechanistic evidence of target engagement in axon protection pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, neuroanatomy, and microsurgical techniques for precise wing or antennal injury.
- Dependent on fluorescence microscopy infrastructure (e.g., spinning disk confocal) for high-resolution axonal imaging.
- Necessitates optogenetics setup with retinal feeding and light stimulation protocols for functional synaptic assays.
- Involves standardization across laboratories for injury timing, genotype handling, and environmental controls to ensure reproducibility.
- Limited by the need for acute injury modeling; chronic degeneration models may require alternative approaches.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:28
Observation of Axon Morphology During Axon Death in the PNS (Peripheral Nervous System)
3:22
Observation of Axon and Synapse Morphology During Axon Death in the CNS (Central Nervous System)
7:56
Results: Axon Death of GFP-Labeled Sensory Neuron Axons and Axonal/Synaptic Function After Axotomy
9:40
Conclusion
5:53
Grooming Induced by Optogenetics as a Readout for Axon and Synapse Function
