微波与荧光素-酪胺信号放大技术用于小鼠肾上腺多重免疫染色——使用同一宿主物种的非偶联一抗

免疫染色广泛应用于生物医学研究，用于确定目标蛋白的位置。多重免疫染色可在同一样本上使用不同的初级抗体检测多个靶点。该方法的优势在于使用常规缓冲液即可消除抗体交叉反应，从而允许使用来自同一宿主物种的两种或多种未标记初级抗体进行免疫染色。

本实验操作将由本实验室的研究生Sophia Zheng和访问学者Qiongxia Lyu进行演示。染色前，将福尔马林固定石蜡包埋的切片依次浸入下列各溶液中，每种溶液中浸泡5分钟，以脱蜡并水化。第二次蒸馏水浸泡后，将切片置于装有275毫升煮沸的柠檬酸钠溶液的移液枪盒底部（盒带盖），然后将盒子放入700瓦微波炉中，以75%功率加热8分钟。

处理结束后，打开盖子，待溶液冷却至室温后，将载玻片置于 Coplin 染色缸中，用新鲜的 PBST 溶液洗涤三次，每次五分钟。为阻断非特异性结合位点，最后一次洗涤后，轻轻甩去每张载玻片上多余的 PBST，然后加入足量的适当封闭液覆盖每张载玻片。在湿盒中室温孵育 30 分钟后，轻轻甩去每张载玻片上多余的封闭液，并向每个样本中加入 250 微升目标的第一抗体。

为防止样品干燥，可将载玻片覆盖一层石蜡膜。在湿盒中于4°C过夜孵育后，用新鲜的PBST洗涤载玻片三次，每次五分钟。甩去多余的PBST，然后迅速在每张载玻片上加入250 µL适当的二抗溶液，在湿盒中室温孵育一小时。

孵育结束后，如所示用新鲜的PBST洗涤载玻片三次，然后向每张载玻片上加入250 µL新配制的链霉亲和素-辣根过氧化物酶溶液。室温孵育30分钟后，用新鲜的PBST再次洗涤载玻片三次。随后甩去多余的PBST，向每张载玻片上覆盖250 µL新配制的荧光染料-酪胺溶液。

一分钟后，将切片浸入新鲜的PBST中，随后用新鲜PBST洗涤三次，每次两分钟。最后一次洗涤后，在切片上滴加数滴1:1的甘油与PBS混合溶液，通过荧光显微镜观察荧光信号的存在情况。为去除第一抗体复合物，将标记有抗体的切片置于275毫升沸腾的柠檬酸钠溶液中，至少处理八分钟，操作如示。

处理结束后，打开盖子，让溶液冷却至室温，然后用PBST洗涤载玻片三次，每次五分钟。若需对第二个目标蛋白进行染色，在完成非特异性结合位点的封闭后，每个样本加入250 µL目标第二抗体，于4°C孵育过夜。次日早晨，用新鲜PBST洗涤载玻片三次，每次五分钟，随后每张载玻片加入250 µL适当的二抗溶液，在室温下避光孵育一小时。

孵育结束后，如所示用新鲜的PBST缓冲液将玻片洗涤三次，然后向每张玻片加入250 µL新配制的链霉亲和素-辣根过氧化物酶。为显影第二个目标蛋白的信号，在三次PBST洗涤后，用另一种荧光光谱的荧光素标记酪胺对玻片进行处理。为终止酪胺信号的显影，将玻片浸入PBST缓冲液中。

然后使用适当的细胞核染料对样本进行染色。若需进行荧光显微镜成像，将每张标记有细胞核染料的玻片用一滴适当的封片介质封片。使用 4X 物镜在玻片上定位组织。

切换至10倍物镜进行成像，将光源强度调至40%至80%，曝光时间调整为100至400毫秒。然后在不移动载物台的情况下，依次获取各通道的图像。各通道的图像可合并生成多重荧光图像。

如果不介导一抗和二抗染色之间的剥离步骤，酪氨酸羟化酶的第二次染色将检测到第一种目标蛋白的信号，从而导致假阳性的酪氨酸羟化酶染色，例如本样本中肾上腺皮质内的信号。为了消除辣根过氧化物酶在一抗免疫染色中产生的抗体交叉反应，可采用微波介导的一分钟和八分钟剥离步骤，从而获得清晰的双重染色结果。在阴性对照样本中未检测到显著信号。

在沸水中用柠檬酸盐缓冲液处理8分钟，足以消除许多常用于肾上腺的抗体的交叉反应性。但在某些情况下，仍可检测到微弱的假阳性信号，即使将微波处理时间延长20分钟，也可能无法完全去除抗体交叉反应性。进行荧光成像时，在切换通道时切勿移动载物台。

然而，可能需要重新调整焦距以获得每个通道的清晰图像。对于每个通道，务必调整曝光时间，以确保信号曝光适当，图像中无过曝的像素或区域。在染色过程中，从脱蜡步骤开始就应保持切片处于水合状态。切片可使用相同的剥离方法多次剥离，以实现多重染色。