Name: Opsono-坚持性检测，以评估疫苗开发中针对 无烟杆菌 和其他封装病原体的功能抗体 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: 了解调理素黏附检测法评估针对炭疽芽孢杆菌等封装病原体的功能性抗体，该方法可在BSL-1或BSL-2实验室安全进行，无需感染动物即可验证疫苗效力。

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J. Chua、D. Chabot 和 A. Friedlander 设计了本文所述的实验方案。J. Chua 和 T. Putmon-Taylor 进行了实验操作。D. Chabot 完成了数据分析。J. Chua 撰写了本文。
作者感谢 Kyle J. Fitts 提供出色的技术支持。
本工作由国防威胁降低局资助，资助编号为 CBM.VAXBT.03.10.RD.015，计划编号 921175。
观点、解释、结论和建议均为作者个人观点，不一定代表美国陆军的立场。本出版物的内容不一定反映国防部的观点或政策，提及的商标名称、商业产品或组织并不意味着得到美国政府的认可。

本研究遵循《动物福利法》、公共卫生服务政策以及与动物及动物实验相关的其他联邦法规和条例，在经机构动物护理和使用委员会批准的方案下进行。开展本研究的机构已获得国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC）认证，并遵守美国国家研究委员会《实验动物护理和使用指南》（2011年版）中所述的各项原则24。
1. RAW 264.7 细胞系的培养与维持
注意：以下操作必须使用无菌技术进行。
<ol>
	<li>将胎牛血清（FBS）在56 °C水浴中加热30分钟，以灭活补体。 
	注意：30 分钟的灭活时间从 FBS 达到 56 °C 时开始计算。为监测温度，可在同一水浴中用烧杯加热与 FBS 相近体积的水。当水温达到 56 °C 时，开始对 FBS 启动 30 分钟倒计时。或者，已灭活的 FBS&#160;已热灭活&#160;也可商业获取。</li>
	<li>通过将90%高糖DMEM与10%热灭活FBS（v/v）混合，制备RAW 264.7细胞培养基。加入L-谷氨酰胺，使其终浓度为6 mM。 
	注意：高糖DMEM含有4 mM L-谷氨酰胺。将L-谷氨酰胺补充至6 mM可促进细胞稳定生长。可添加100 U/mL青霉素和100 µg/mL链霉素以防止污染。另一种常用的小鼠细胞系J774A.1也可使用，其培养条件相似。</li>
	<li>将一管冷冻细胞在37 °C水浴中解冻，一旦完全融化立即取出。无菌操作将内容物转移至含有5 mL完全培养基的锥形管中。轻轻倒置锥形管两次，随后在300 x g 离心5分钟以沉淀细胞。</li>
	<li>使用连接真空泵的无菌巴斯德吸管吸除冻存液，重悬细胞沉淀于 5 mL 新鲜培养基中。</li>
	<li>将悬液转移至经组织培养处理的培养瓶或培养皿中。加入足量培养基，使其完全覆盖瓶底，轻轻晃动以均匀分布细胞。标注传代次数，起始编号为“1”。</li>
	<li>在37 °C、5% CO₂条件下孵育细胞2 并在湿度达到95%至100%汇合度前持续培养。从孵育的第二天开始，每天在显微镜下观察细胞。切勿让细胞达到 &#62;100% 汇合度，因为这会导致细胞脱落并死亡。 
	注意：达到汇合所需的时间取决于接种的活细胞数量以及培养瓶的生长面积。因此，建议每天观察细胞生长情况。</li>
	<li>通过刮取细胞并将其稀释至新鲜培养基中进行传代培养，每次刮取间确保至少两天的生长时间。每次传代培养时，传代次数增加1。 
	注意：传代后次日立即刮取细胞将导致随时间推移细胞总体黏附性更快丧失。RAW 264.7 细胞最多仅可使用至约第 15 代。</li>
	<li>为OAA检测接种RAW 264.7细胞时，更换新鲜培养基，使用细胞刮轻轻刮下培养瓶中的细胞。反复吹打悬液以分散细胞团块，便于细胞计数。 
	注意：传代培养RAW 264.7细胞的传统方法为刮取法。根据我们的经验，使用胰蛋白酶消化会导致RAW 264.7细胞随时间推移失去贴壁能力的速度较刮取法更快。</li>
	<li>为计数细胞，取等体积的细胞悬液与台盼蓝溶液混合。取10 µL混合液加入血细胞计数板。使用倒置显微镜配合10倍物镜观察，并计数拒染的活细胞数量。</li>
	<li>接种 1.4 × 104&#160;每孔接种活细胞至96孔0.15 µm厚玻璃平底板（Plate #1）中。细胞培养3天。在进行OAA实验前一天更换培养基。 
	注意：培养3天后，细胞数量应约为5 x 104/孔 &#160;</li>
</ol>
2. 细菌培养与制备
注意：本方案中使用的细菌物种为具有荚膜的高毒力菌株 B. anthracis Ames。对该菌株的所有操作均需具备相应的生物安全与安保许可，并且必须在位于BSL-3实验室内的II级或III级生物安全柜中进行。操作细菌时，须遵循机构关于BSL-3工作的标准操作程序以及个人防护装备的使用规范。
<ol>
	<li>通过将37 g脑心浸液（BHI）粉末溶解于1 L水中，并在121 °C下高压灭菌15分钟，制备脑心浸液肉汤。将肉汤储存在室温条件下。</li>
	<li>用水配制8%碳酸氢钠溶液，并使用0.20 µm滤膜注射器过滤除菌。将溶液储存在4 °C下，并在1天内使用。</li>
	<li>将8 g营养肉汤、3 g酵母提取物和15 g琼脂溶于1 L水中，制备NBY琼脂平板。在121 °C下高压灭菌15分钟，倒入培养皿中，静置使其凝固。将平板储存在4 °C下。 
	注意：NBY琼脂平板可含或不含碳酸氢钠。在液体和固体培养基中添加碳酸氢钠可诱导产生黏液型菌落，这些菌落由有荚膜的杆菌组成。液体和固体培养基中碳酸氢钠的终浓度为0.8%。</li>
	<li>通过混合50%高压灭菌的BHI肉汤、40%胎牛血清（FBS）和10%碳酸氢钠溶液（v/v），制备用于培养B. anthracis的培养肉汤。 
	注意：该培养基配方旨在产生短链的有荚膜杆菌。</li>
	<li>在进行液体培养前一天，从芽孢储备液中取样，在NBY琼脂平板上划线分离，制备B. anthracis主平板。于37 °C培养。</li>
	<li>在通气的250 mL三角瓶中加入30 mL培养肉汤，并接种数个B. anthracis菌落。 
	注意：为获得最大程度荚膜化的杆菌，需使用此处指定的液体体积与表面积比例。</li>
	<li>将肉汤培养物在37 °C、20% CO2及湿度条件下，以125 rpm振荡培养18–24小时。 
	注意：在高于37 °C的温度下培养B. anthracis可能会抑制荚膜的生成。</li>
	<li>在固定前，使用印度墨水负染法确认荚膜形成充分，且杆菌呈短链排列（每链1–5个杆菌）（见第3节）。</li>
	<li>为测定菌落形成单位（CFU），取100 µL培养物用磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液进行1:10系列稀释，将稀释后的菌液涂布于羊血琼脂平板上。在37 °C培养12–18小时。计数CFU，并计算每毫升培养物中的细菌数量。 
	注意：细菌固定后也可在显微镜下使用血细胞计数板进行计数。但不推荐此方法，因为在低倍镜下难以观察到杆菌。</li>
	<li>向全部体积的细菌培养物中加入16%多聚甲醛（PF），使其终浓度为4% PF，以固定杆菌。在室温下缓慢振荡孵育7天。 
	注意：在4% PF中孵育7天的操作依据美国传染病医学研究所（USAMRIID）机构标准操作程序，用于固定营养态杆菌。</li>
	<li>为去除固定剂并检测无菌性，将4 mL（占总体积10%）固定后的细菌悬液转移至50 mL锥形管中，用PBS洗涤三次，每次加入30 mL PBS，在≥3000 x g条件下离心45分钟。将剩余样品储存在含4% PF的溶液中，置于4 °C保存。 
	注意：由于荚膜的存在，离心后细菌沉淀呈蓬松状。洗涤过程中应避免扰动沉淀。必须彻底去除所有固定剂，以防干扰后续的活性检测。如有必要，可增加洗涤次数。</li>
	<li>进行活性检测时，取4 mL洗涤后的悬液（不超过肉汤体积的10%）接种至40 mL细菌生长培养基（如BHI肉汤）中，在37 °C培养7天。分别在培养前后测定600 nm处的光密度以评估浊度变化。</li>
	<li>在肉汤培养中孵育7天后，取≥100 µL培养液涂布于琼脂平板，并继续培养7天。若未观察到浊度增加且平板上无菌落生长，则认为原始培养物已达到无菌状态，可转移至BSL-2实验室。 
	注意：根据美国联邦特定病原体计划22规定，灭活的B. anthracis仅可在证明样品完全无菌后，方可从BSL-3实验室转移。对灭活B. anthracis的活性检测要求是：先将样品的10%接种于液体培养基中培养7天，再转接至固体培养基继续培养7天22,23。在确认无菌后，应遵循所在机构的指导方针申请转移许可。&#160;</li>
</ol>
3. 负染色法与光学显微镜观察荚膜及杆菌链
<ol>
	<li>在载玻片上将5 µL细菌悬液与2 µL印度墨水混合。将厚度为1或1.5 µm的盖玻片覆盖在悬液上，避免产生气泡。 
	注意：可使用指甲油将盖玻片密封固定在载玻片上。</li>
	<li>使用光学显微镜的40x至100x油镜观察细菌悬液。通过观察每个细菌周围是否存在透明区（荚膜排斥印度墨水形成的空白区域）来确认细菌是否具有荚膜，并确认杆菌呈短链排列。</li>
</ol>
4. 细菌的FITC标记
<ol>
	<li>将异硫氰酸荧光素（FITC）溶于二甲基亚砜中，配制成浓度为 2 mg/mL 的溶液。</li>
	<li>测量灭活细菌储备液的体积。</li>
	<li>用 PBS 洗涤储备液 3 次，以去除固定剂。</li>
	<li>加入 FITC 溶液，使其终浓度为 75 µg/mL。在 4 °C 下缓慢振荡混合物 18–24 小时。</li>
	<li>通过在 ≥3000 x g 条件下离心 45 分钟，将细菌洗涤 3 次，每次使用&#160;30 mL PBS 以去除过量的 FITC。洗涤过程中应确保疏松的沉淀不受扰动。将杆菌重新悬浮于与初始体积相同的 PBS 中。</li>
	<li>将杆菌分装至微量管中，于 -20 °C 保存备用。避免多次冻融，以免杆菌丢失荚膜。</li>
</ol>
5. 细菌调理作用
<ol>
	<li>将少量待测血清（来自非人灵长类动物）置于56 °C的加热块中，灭活30分钟。</li>
	<li>将FITC标记的细菌解冻，并用PBS洗涤两次，每次在15000 ×g离心3–5分钟。然后将其重悬于与初始体积相同的PBS中。</li>
	<li>在96孔圆底板（板#2）中，用细胞培养基对待测血清进行系列稀释。在另一块96孔圆底板（板#3）中，向每个孔加入10 µL稀释后的待测血清。 
	注意：每块板中均以PBS和正常猴血清替代稀释的待测血清作为阴性对照。我们还选择一份待测血清作为阳性对照，用于生成标准曲线，以标准化不同日期进行的所有实验。该阳性对照血清为任意选定，因其来源充足。</li>
	<li>向板#3中加入10 µL新配制的幼兔补体。 
	注意：一旦配制完成，剩余的幼兔补体应丢弃；不得再次冻融。</li>
	<li>向板#3中加入适量的FITC标记杆菌，使感染复数为1:20。例如，若细胞数量为5 × 104，则加入含有5 × 104 × 20个杆菌的体积。随后向板#3的每孔中加入适量细胞培养基，使总体积达到105 µL。 
	注意：含细胞的板#1将加入100 µL调理后的细菌，剩余5 µL为空白体积。每个待测血清稀释度均设复孔。</li>
	<li>将板#3置于37 °C、5% CO2及湿度条件下孵育30分钟，以完成杆菌的调理作用。</li>
</ol>
6. 哺乳动物细胞黏附实验与荧光标记
<ol>
	<li>使用前将所有试剂保持在 37 °C。</li>
	<li>将含有贴壁细胞的 1 号板放置于 37 °C 的加热金属块上。</li>
	<li>使用多通道移液器从孔中移除用过的培养基，并迅速加入来自 3 号板的 100 µL 已调理的细菌。确保移液过程中孔内未产生气泡。将 1 号板在 37 °C、5% CO2 及湿度条件下孵育 30 分钟，以促进细菌黏附。</li>
	<li>在 37 °C 加热金属块上，用 150 µL PBS 每孔洗涤 5 次，以去除未黏附的杆菌。 
	注意：洗涤过程中需小心操作，避免细胞意外脱落。</li>
	<li>用 PBS 将 16% PF 按 1:4 比例稀释，配制成 4% PF。向每孔加入 150 µL 该固定液，固定细胞 1 小时。用 PBS 洗涤细胞 2 次。</li>
	<li>将 2 µL HCS（高内涵筛选）Orange 细胞染料加入 10 mL PBS 中混匀。向固定后的细胞中每孔加入 150 µL 染色液，在室温下孵育 30 分钟。</li>
	<li>用 PBS 洗涤各孔 2 次。</li>
	<li>于 4 °C 保存，直至进行显微镜观察。</li>
</ol>
7. 显微镜观察
注意：通常情况下，高通量自动化荧光显微镜有助于OAA的成像。如果缺乏自动化系统，可手动采集贴壁杆菌的荧光图像21。在本研究中20，使用配备专用设备的蔡司700激光扫描显微系统对贴壁杆菌和细胞单层进行成像；我们的系统由配备自动载物台、定焦模块（Definite Focus module）、40倍NA 0.6物镜、Axio Cam HRc相机和Zen 2012（蓝版）软件的蔡司Axio Observer Z1倒置显微镜组成。所获取的图像为宽场图像，而非共聚焦图像。以下方案旨在提供一种适用于多种自动化显微镜系统的基本显微镜设置。
<ol>
	<li>将 1 号培养板在室温下孵育 30 分钟。开启显微镜及相关设备。 
	注意：在成像前将样品于室温下进行适应，可防止玻璃板上产生冷凝水，同时避免因温度变化导致的失焦现象。</li>
	<li>将培养板置于载物台上，使用明场或相差显微镜对细胞进行聚焦。</li>
	<li>选择96孔板作为板型设置。选择通道设置。 
	注意：FITC 的最大激发和发射波长分别为 495 nm 和 519 nm；HCS 橙色细胞染料分别为 556 nm 和 572 nm。可根据显微镜所配备的滤光片选择其他荧光染料。</li>
	<li>选择设置为平铺模式。指定要采集的图像数量。 
	注意：拼接功能可用于捕获样本孔中的多个位置，可设置为以拼接或随机模式采集图像。我们每孔采集了10个随机区域的图像。</li>
	<li>将采集模式更改为“black” &amp;#38; 白色”或“单色”且合并像素 ≥ 2x2。 
	注意：将 binning 从 1x1 设置为 2x2 或 4x4 可提高显微镜成像速度，但会导致图像分辨率降低。对于 OAA 检测而言，使用这些设置已足够，因为该实验需同时计数巨噬细胞和黏附的细菌。</li>
	<li>打开自动对焦或聚焦模块，设置自动对焦功能的执行频率。若设备支持，开启Z轴层扫功能，并设置Z轴层扫数量，以完整捕获细胞单层及附着杆菌的厚度。 
	注意：选择的Z轴层扫描数量越多，显微成像时间越长，但可确保在每个Z轴层均获得聚焦正确的图像。</li>
	<li>指定一个文件夹用于保存图像。运行自动成像程序。</li>
</ol>
8. 数据收集与分析
<ol>
	<li>计数每张图像中贴壁的杆菌数量和哺乳动物细胞数量。每条杆菌链计为一个细菌。</li>
	<li>将阳性对照试验血清的杆菌/细胞数与滴度（例如，1:10 稀释对应 10 个滴度单位）绘制成标准曲线，使用合适的统计学软件进行分析。</li>
	<li>采用非线性回归曲线拟合方法分析阳性对照试验血清。然后利用该阳性对照试验血清的标准曲线分析其余样本，以确定相应的滴度。 
	注意：在确定滴度时，通常选择标准曲线中段附近的样本稀释度最为准确。</li>
	<li>计算每个疫苗组样本的几何平均值。对经对数转换后的滴度值采用最小显著差异法进行单因素方差分析（ANOVA），计算 P 值。</li>
</ol>

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作者不存在可能构成利益冲突的商业或其他关联。

基于荚膜的疫苗已被证明对多种细菌病原体具有有效性，且其中许多已获准用于人类25,26,27这些疫苗通过诱导产生靶向荚膜的抗体发挥作用，许多此类研究采用OPKA来展示抗体的调理吞噬功能。13,14,16,28,29由于生物安全方面的考虑以及为了便于操作，我们开发了一种OAA，用于评估接种疫苗动物所产生的抗体 B. anthracis 荚膜结合物。荚膜的存在表明 B. anthracis 防止黏附和吞噬作用30，但用疫苗接种动物的血清对杆菌进行调理可诱...

识别、附着、内化和降解病原体是吞噬作用的关键环节1，该过程是宿主先天免疫应答中的一个重要通路，最早由Ilya Metchnikoff于1883年提出2,3。吞噬性白细胞以及其他免疫系统细胞在靶标选择上具有高度特异性；它们可通过模式识别受体（PRRs）识别病原体相关分子模式，从而区分“感染性非己”与“非感染性自身”4,5。宿主对病原体的识别还可通过宿主&#160;调理素（如补体和抗体）的结合而实现6。这一过程称为调理作用，即在病原体表面包被这些分子，使其与吞噬细胞上的调理素受体（如补体受体和Fc受体）结合后更易被内化6。病原体与吞噬细胞的附着需要多个受体与其相应配体共同结合才能实现。只有在此基础上，附着才能触发并在细胞内持续激活信号级联反应，从而启动内化过程6。
由于吞噬作用在清除病原体和预防感染方面具有重要作用，胞外病原体已进化出多种机制来破坏这一过程，以延长其存活时间。其中一种重要策略是产生带负电荷的聚合物荚膜（例如多糖或聚氨基酸），这类荚膜因其电荷特性而具有抗吞噬性，免疫原性差，并能屏蔽细菌包膜上的分子，使其免于被模式识别受体（PRRs）识别6,7。Cryptococcus neoformans 和 Streptococcus pneumoniae 等病原体的荚膜由糖类聚合物组成，而 Staphylococcus epidermidis 及某些 Bacillus 物种则产生聚-ɣ-谷氨酸（PGGA）7,8。另一些病原体产生的荚膜则类似于非感染性的自身成分。例如，Streptococcus pyogenes 和一种致病性 B. cereus 菌株具有透明质酸荚膜，这种荚膜不仅具有抗吞噬性，还可能不被免疫系统识别为外来物质9,10。
将荚膜与载体蛋白偶联，可将其从弱的、T细胞非依赖性抗原转化为高免疫原性的T细胞依赖性抗原，从而诱导产生高滴度的血清抗荚膜抗体11,12。该策略被用于已获许可的疫苗以预防 S. pneumoniae, 流感嗜血杆菌，以及 脑膜炎奈瑟菌11抗荚膜抗体的调理活性通常通过以下方法进行评估：&#160;调理吞噬杀伤试验（OPKA）13,14,15,16。这些&#160;检测方法测试&#160;功能性抗体是否能够触发吞噬作用和杀伤效应14然而，使用OPKA检测感染性病原体（如第一级生物选择剂和毒素（BSAT））时，包括 B. anthracis17，具有危险性并存在安全风险；这些检测需要大量操作管制性病原体。管制性病原体的操作只能在受限的生物安全三级（BSL-3）实验室中进行；由于必须遵循众多安全与安保措施，此类区域的工作流程极为繁琐。此外，BSL-3实验室通常未配备用于OPKA实验的专用设备，例如显微镜和流式细胞仪。因此，我们开发了一种基于灭活细菌的替代检测方法18,19我们将此称为依赖调理的黏附试验（OAA），该试验不以内化和杀伤作为检测指标；而是以调理后的灭活病原体的黏附作用作为吞噬作用的指标。从机制上讲，OAA 是一种合适的替代方法，因为黏附是吞噬过程中的一个必要步骤 先验的 并且与病原体的内化及细胞内杀伤过程密切相关。从生物安全角度而言，优选氧化偶联法（OAA），因其对传染性病原体的操作需求极少，实验周期较血清杀菌活性试验（OPKA）更短，且在制备并转移灭活病原体储备液后，可在生物安全二级（BSL-2）实验室中进行。
我们展示了如何利用吞噬活性分析（OAA）来检测接种了荚膜结合疫苗（即炭疽杆菌 B. anthracis 的PGGA与脑膜炎奈瑟菌 Neisseria meningitidis 外膜蛋白复合物[OMPC]结合而成的疫苗）的非人灵长类动物（NHPs）血清中抗荚膜抗体的调理功能20。 经血清调理的杆菌与贴壁生长的小鼠巨噬细胞系RAW 264.7共同孵育。固定后，通过荧光显微镜对细胞单层及附着的杆菌进行成像。与对照血清相比，当杆菌与接种荚膜结合疫苗的NHP血清孵育时，其黏附量增加20。这种黏附程度与炭疽攻击后的存活率呈正相关20,21。因此，OAA的应用明确了抗荚膜抗体的功能，并极大促进了我们对候选疫苗的评估。&#160;

<table><tbody><tr><td>0.20 &amp;micro;m 注射器滤器（25 mm，再生纤维素）</td><td>康宁，纽约州康宁市</td><td>431222</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器（鲁尔锁扣式针头）</td><td>BD，美国新泽西州富兰克林湖</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>15&amp;micro; 96孔黑色培养板（成像用1号板）</td><td>In Vitro Scientific，加利福尼亚州森尼韦尔</td><td>P96-1-N</td><td></td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛</td><td>电子显微镜科学，宾夕法尼亚州哈特菲尔德</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>75 cm² 组织培养处理过的培养瓶</td><td>康宁，纽约州，康宁</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>琼脂（粉末）</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>幼兔补体</td><td>Cedarlane Labs，北卡罗来纳州伯灵顿</td><td>CL3441</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物（Bacto）</td><td>BD，Sparks，医学博士</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>BBL 脑心浸液（BHI）</td><td>BD，Sparks 博士</td><td>211059</td><td></td></tr><tr><td>血琼脂（含羊血的TSA）平板</td><td>Remel，Lenexa，KS</td><td>R01198</td><td></td></tr><tr><td>细胞刮刀</td><td>Sarstedt，牛顿，北卡罗来纳州</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96 孔细胞培养板（板 #2 &amp;以及用于稀释的3号管</td><td>康宁，纽约州，美国</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>电子显微镜科学，宾夕法尼亚州哈特菲尔德</td><td>72200-10</td><td></td></tr><tr><td>Difco 营养肉汤</td><td>BD，Sparks，MD</td><td>234000</td><td></td></tr><tr><td>高糖型杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）</td><td>Gibco，赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>11965-092</td><td>含 4500 mg/L 葡萄糖、4 mM L-谷氨酰胺、酚红</td></tr><tr><td>EVOS FL Auto 细胞成像系统（荧光显微镜）</td><td>Life Technologies，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>AMAFD1000</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone，GE Healthcare Life Sciences，美国犹他州南洛根</td><td>SH30071.03</td><td>未经γ射线照射，未经热灭活</td></tr><tr><td>异硫氰酸荧光素</td><td>Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>F143</td><td></td></tr><tr><td>HCS Cell Mask Orange 细胞染料</td><td>Invitrogen，Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆</td><td>H32713</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板（改良型纽鲍尔）</td><td>Hausser Scientific，宾夕法尼亚州霍舍姆</td><td>3900</td><td></td></tr><tr><td>印度墨水溶液</td><td>BD，Sparks，医学博士</td><td>261194</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺（200 mM）</td><td>Gibco，Thermo Fisher Scientific，Waltham MA</td><td>25030081</td><td>在培养基中补充额外的 2 mM L-谷氨酰胺</td></tr><tr><td>尼康Eclipse TE2000-U（倒置复合显微镜）</td><td>尼康仪器公司，美国纽约州梅尔维尔</td><td>TE2000</td><td></td></tr><tr><td>不含钙和镁的 PBS</td><td>Lonza，美国马里兰州沃克维尔</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液，100倍浓缩</td><td>Hyclone，GE Healthcare Life Sciences，美国犹他州南洛根</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（100 × 15 mm）</td><td>Falcon，康宁，北卡罗来纳州德罕</td><td>351029</td><td>用于琼脂平板</td></tr><tr><td>RAW 264.7 巨噬细胞系（Tib47）</td><td>ATCC，美国弗吉尼亚州马纳萨斯</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>VWR，拉德诺，宾夕法尼亚州</td><td>16004-422</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液（0.4%）</td><td>Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>蔡司700激光扫描显微镜（共聚焦显微镜）</td><td>卡尔·蔡司显微成像公司，美国纽约州桑伍德</td><td>4109001865956000</td><td></td></tr></tbody></table>

用于评估疫苗研发中功能性抗体的调理-黏附试验 炭疽杆菌 及其他包封病原体

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

调理黏附试验是一种功能性检测方法，用于定量细菌病原体与专职吞噬细胞的黏附情况。由于黏附是吞噬作用和杀灭病原体的前提，该试验可作为调理吞噬杀伤试验的一种替代方法&#160;。调理黏附&#160;试验的一个优势在于可使用灭活的病原体和哺乳动物细胞系，从而实现多个实验之间的标准化。在试验中使用灭活病原体还有助于对生物安全等级3的感染性因子及其他高毒力病原体进行操作。在我们的研究中，采用调理黏附试验评估了经炭疽荚膜疫苗免疫的动物血清中抗体诱导固定化的Bacillus anthracis与小鼠巨噬细胞系RAW 264.7发生黏附的功能能力。通过自动化荧光显微镜拍摄黏附于巨噬细胞的杆菌图像。黏附程度的增加与血清中存在抗荚膜抗体相关。血清中抗荚膜抗体浓度较高的非人灵长类动物可免受炭疽攻击。因此，调理黏附试验可用于阐明血清中抗原特异性抗体的生物学功能，评估候选疫苗及其他治疗手段的有效性，并可能作为免疫保护的相关指标。

本部分展示了在OAA实验期间采集的代表性显微图像，以及表明OAA可用于研究抗体生物学功能的结果。此处，该检测成功用于评估一种炭疽疫苗候选物的有效性。验证芽孢杆菌的荚膜包裹状态至关重要，因为极少或无荚膜包裹会导致其黏附于宿主细胞，从而产生较高的背景信号。图1为经印度墨汁负染色后观察B. anthracis Ames荚膜的图像。OAA需要对多个相邻视野进行照明，若使用共聚焦显微镜，则需采集多个焦平面或切片图像。因此，必须确认芽孢杆菌的荧光信号既不过弱，也不会过快发生光漂白。图2为用FITC标记的芽孢杆菌图像。图3展示了B. anthracis Ames附着于细胞单层的最大投影图像。这些为OAA计数与评分所依据的代表性视野。与PGGA-OMPC抗血清共同孵育的芽孢杆菌附着增加，是由于抗荚膜抗体的存在，这些抗体对芽孢杆菌起到了调理作用。图4显示，接种10 µg和50 µg ...

调理黏附试验是评估疫苗研发中抗体调理功能的一种替代方法，可作为调理吞噬杀伤试验的补充。

调理粘附试验是一种功能性检测方法，用于定量测定细菌病原体与专职吞噬细胞的粘附情况。由于粘附是……

调理-黏附试验用于分析动物接种疫苗后产生的功能性调理抗体，这些抗体的存在已被证明与多种已获许可的人用疫苗的有效性相关。该试验适用于生物选择性病原剂及其他传染性病原体，且在灭活的BSL-3级病原体转移后，可在BSL-1或BSL-2实验室中进行。针对细菌荚膜（包括炭疽杆菌荚膜）的抗体已在动物感染模型中被证实具有保护效力。调理-黏附试验可在不感染动物的情况下功能性地评估抗体。操作炭疽杆菌的有荚膜毒力菌株时，须遵守所有机构的安全与安保规程。本视频中，我们在生物安全二级条件下使用一种灭活菌株。按照文本方案中的描述，首先准备 RAW 264.7 细胞。为进行调理-黏附试验，将培养瓶中的培养基更换为新鲜培养基，并使用细胞刮轻轻刮下培养瓶中的细胞。反复吹打以分散细胞团块，便于后续细胞计数。将每孔14,000个细胞接种于96孔、0.15微米厚玻璃平底板中。细胞培养三天，在进行OAA实验前一天更换培养基。经过三天培养后，每孔细胞数量应约为50,000个。开始实验时，从芽孢储备液中取样，在 NBY 琼脂平板上划线分离，制备炭疽杆菌主培养平板。为演示目的，本实验使用了羊血琼脂平板。在液体培养基培养前，于 37 摄氏度培养一天。然后，取数个杆菌菌落接种于装有30毫升培养液的带通气盖250毫升三角瓶中。将培养液置于125 RPM、37°C、20% CO2及适当湿度条件下振荡培养18至24小时。固定前，使用印度墨汁负染法确认荚膜形成充分，且杆菌呈短链排列。为此，将5 µL细菌悬液与2 µL印度墨汁在显微镜载玻片上混合。然后，在悬液上覆盖一片厚度为1或1.5 µm的盖玻片，注意避免产生气泡。使用光学显微镜的40至100倍油镜观察细菌悬液。厚的荚膜可排除印度墨汁。通过观察每个细菌周围存在的透明区，确认杆菌具有荚膜。同时确保杆菌呈短链排列。为测定菌落形成单位（CFUs），取100微升培养物，在PBS溶液中进行1:10倍比系列稀释，将稀释后的培养物接种于羊血琼脂平板上。在37摄氏度下孵育12至18小时。计数菌落形成单位，并计算每毫升培养物中的细菌数量。在确保芽孢杆菌已充分包封、稀释并涂布后，向30毫升培养物中加入10毫升16%的多聚甲醛，使多聚甲醛的终浓度为4%，以固定剩余的细菌培养物。将混合液转移至50毫升锥形管中，然后在室温下于摇床中缓慢振荡7天。为检测无菌性，取四毫升或固定细菌悬液的10%体积，转移至50毫升锥形管中。加入PBS洗涤悬液，并在至少3000 G条件下离心45分钟以形成沉淀。然后小心移除上清液，确保不扰动松散的沉淀物。重复此洗涤步骤至少两次后，将固定的样品重悬于 4 毫升 PBS 中。必须在洗涤过程中彻底去除所有固定剂，以避免固定剂干扰后续的活力检测。如有必要，可增加洗涤次数。进行活性检测时，将4 mL洗涤后的菌悬液接种至40 mL细菌培养基中，在37°C条件下培养7天。分别在培养前和培养7天后，使用分光光度计在600 nm波长下检测光密度以测定浊度。在液体培养基中培养7天后，取至少100 µL培养液涂布于琼脂平板，再继续培养7天。如果未观察到浊度增加，且平板上无菌落生长，则认为原始培养物无菌，可转移至BSL-2实验室。转移前需遵循机构相关规定获得批准。用PBS清洗灭活的菌种三次，以去除固定剂。加入FITC溶液，使其终浓度为75微克/毫升。在4摄氏度下缓慢振荡混合物18至24小时。按前述方法洗涤细菌，以去除多余的FITC。最后一次洗涤后，将芽孢杆菌重悬于与起始体积相同的 PBS 中，并于 -20 摄氏度保存备用。取少量非人灵长类动物的待测血清，置于加热块或 PCR 仪中，在 56 摄氏度下灭活 30 分钟。将FITC标记的细菌用PBS洗涤两次，每次以15,000 × g离心3至5分钟。用与初始体积相同的PBS重悬。在96孔圆底板中，用细胞培养基对测试血清进行连续稀释。在另一块96孔圆底板中，向每个孔加入10微升稀释的待测血清。然后，加入10微升 freshly reconstituted baby rabbit complement。向第三块板中加入适量的FITC标记的芽孢杆菌，使感染复数为20。例如，在体积中含有每 50,000 个细胞中 50,000 倍的 20 个杆菌。向 3 号板的每个孔中加入适量的细胞培养基，使总体积达到 105 微升。将 3 号板在 37 摄氏度、5% CO2 及湿度条件下孵育 30 分钟，以促进杆菌的调理作用。将含有贴壁细胞的1号板置于37摄氏度的加热块上。使用多通道移液器从孔中移除用过的培养基，并迅速加入100微升来自3号板的经调理的细菌，确保移液过程中孔内不产生气泡。为避免扰动细胞单层，应将液体加至孔的侧壁。将1号培养板在37摄氏度、5% CO2及湿度条件下孵育30分钟，以促进细胞贴壁。在37摄氏度的加热块上，用150微升PBS对每个孔清洗五次，以去除未贴附的芽孢杆菌。移液时应沿孔壁加入，确保清洗过程中细胞不被意外冲散。向每个孔中加入 150 微升 4% 多聚甲醛，固定细胞 1 小时。用 PBS 洗涤细胞两次后，将 2 微升高内涵筛选橙色细胞染料与 10 毫升 PBS 混合。然后，向固定后的细胞中加入 150 微升该染色液，于室温孵育 30 分钟。将1号培养板放置在载物台上，使用明场或相差显微镜对细胞进行聚焦。在“采集”选项卡中，选择96孔板格式作为培养板设置，然后选择“通道设置”。接下来，选择设置为平铺模式。指定要采集的图像数量。将采集模式更改为黑白或单色，并将二乘二像素合并设置为至少 2×2。打开自动对焦或对焦模块。设置自动对焦功能的执行频率。接下来，如果设备支持，请开启Z轴层扫功能。指定将捕获细胞单层及黏附杆菌厚度的Z轴层叠图像数量。指定用于保存图像的文件夹。现在运行自动成像程序。按照文本方案中所述进行数据收集和分析。为观察炭疽杆菌（Bacillus anthracis）的荚膜情况，使用印度墨汁对其进行负染色。必须验证其荚膜状态，因为荚膜极少或无荚膜的细菌可在无抗体存在时黏附于宿主细胞，导致背景信号过高。采用共聚焦显微镜检测芽孢杆菌的荧光强度及其光漂白特性。由于芽孢杆菌在成像过程中将经历长时间的光照，因此验证其荧光信号是否随时间发生显著衰减至关重要。此处展示的是炭疽杆菌附着于细胞单层的最大投影图像。这些是调理粘附试验中用于计数和评分的代表性视野图像。与荚膜结合物抗血清共同孵育后的芽孢杆菌粘附增加，是由于抗荚膜抗体对芽孢杆菌进行了调理作用所致。接种10和50微克荚膜结合物的非人灵长类动物血清抗体滴度显著高于仅接种结合物或荚膜的动物。我们正在开发一种类似的检测方法，该方法使用流式细胞术和人中性粒细胞（非黏附细胞）来测量调理活性，并定量细菌表面的荚膜。观看本视频后，您应对调理黏附检测有充分的理解。请务必注意，操作生物安全等级3级（BSL-3）病原体具有极高的危险性。必须严格遵守机构指南和安全预防措施。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

Opsono-坚持性检测，以评估疫苗开发中针对 无烟杆菌 和其他封装病原体的功能抗体

视频展示了 体外 使用人中性粒细胞共培养的调理吞噬杀伤试验...

针对细菌病原体的调理吞噬杀伤活性评估

本视频演示了一种调理-黏附试验，用于研究经调理的细菌与免疫细胞之间的相互作用。将用含抗荚膜抗体的待测血清处理过的荧光标记细菌与巨噬细胞共同孵育。在对巨噬细胞进行荧光染色后，通过显微镜观察附着在巨噬细胞表面的细菌，以实现可视化检测。...

一种用于评估抗荚膜抗体对荚膜细菌调理作用的调理-黏附检测法

介绍了一种在细菌表面快速展示抗原的新技术，该技术涉及表面生物素化，随后使目标蛋白与单体亲和素融合后与细菌结合。通过在卡介苗（BCG）表面加载选定的抗原，可有效增强其免疫原性，表明表面修饰有望替代传统的基因工程方法。...

利用亲和素-生物素系统通过非遗传性表面修饰在卡介苗（Mycobacterium bovis BCG）疫苗中表达外源性抗原

本文介绍了一种简洁的实验方案 体内...

小鼠中宿主-病原体反应及疫苗效力的评估

该调理吞噬杀伤试验用于比较吞噬性免疫细胞在不同处理和/或条件下对细菌的应答及杀伤能力。传统上，该试验作为评估针对细菌产生的抗体作为调理素时其效应功能的金 标准。...

评估针对细菌病原体免疫应答的调理吞噬杀伤试验

本文介绍了一种基于聚（β-氨基酯）聚合物的mRNA纳米颗粒的简单制备方案，通过更换所包载的mRNA即可轻松实现定制化。该方案涵盖了聚合物的合成、纳米颗粒的制备及其表征的完整工作流程。 体外...

用于疫苗接种的mRNA负载型聚(β-氨基酯)纳米颗粒的合成与表征

该方案详细介绍了评估纳米乳剂麦冬皂苷D佐剂是否能够促进有效细胞免疫反应的方法。...

体外 细胞活性评价纳米乳疫苗佐剂麦冬皂苷D

在肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）感染中，血清学检测虽可获得较好的检测结果，但由于存在免疫交叉反应，其特异性较低。本文所述的实验室自建抗原捕获ELISA方法具有高度的物种特异性，已被证明是准确诊断M.

肺炎支原体特异性检测的抗原捕获酶联免疫吸附试验

本方案制备并评估物理特性、免疫反应及 体内...

评估一种纳米乳剂佐剂疫苗针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）感染的免疫应答

本文介绍一种替代方案，通过使用免疫原性表位髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）35-55 悬浮于含灭活的副结核分枝杆菌（Mycobacterium avium subsp.

Mycobacterium paratuberculosis 在实验性自身免疫性脑脊髓炎中增强自身抗原免疫原性的佐剂活性

在本方案中，我们开发了一种阳离子纳米乳剂包裹的视黄酸（RA），用作佐剂以促进抗原特异性的全身和黏膜免疫应答。通过将美国食品药品监督管理局（FDA）批准使用的视黄酸添加到纳米乳剂中，在肌肉注射该纳米乳剂后，可促进阴道和小肠中的抗原特异性分泌型IgA（sIgA）产生。...

阳离子纳米乳液包裹的视黄酸作为佐剂促进OVA特异性全身及黏膜免疫应答

了解调理素黏附检测法评估针对炭疽芽孢杆菌等封装病原体的功能性抗体，该方法可在BSL-1或BSL-2实验室安全进行，无需感染动物即可验证疫苗效力。

用于评估疫苗研发中功能性抗体的调理-黏附试验炭疽杆菌及其他包封病原体

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用于评估疫苗研发中功能性抗体的调理-黏附试验 炭疽杆菌 及其他包封病原体

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