使用激光切割模具实现简单的无光刻单细胞微模式
2020年4月3日
该协议引入了一种无光刻图的微模式方法，该方法对于生物工程背景有限的人来说简单且易于使用。该方法利用定制的激光切割模具，以感兴趣的形状进行微模式细胞外基质蛋白，以调节细胞形态。微模式程序使用诱导多能干细胞衍生心肌细胞进行演示。
我们将介绍一种基于模具的无光刻无单细胞微模式方法，该方法克服了与光刻和软光刻相关的许多障碍。模具可重复使用，且过程低廉且可定制。该方法为非工程研究人员在各种生理和病理环境中研究细胞形状和面积诱发的机械转化开辟了一条新途径。
此外，该协议允许对数千个细胞进行微模型，这些细胞可用于培养皿中高通量药物筛选和疾病建模。视觉演示将促进植入两个关键步骤:从水凝胶分离盖玻片，在放置模具之前充分干燥水凝胶。如手稿所述，在新的 50 毫升丙烯离心管中准备聚丙烯酰胺水凝胶溶液。
接下来，准备5%光启动器溶液，将成分溶解在700微升100%乙醇中。成分不溶水，所以一定要完全溶解的漩涡。添加 300 微升 PBS，最终体积为 1 毫升。
在冰上工作，用冰冷DMEM F12介质或1X PBS稀释基底膜基质蛋白库存溶液，以优化稀释比。放在冰上供以后使用。使用地下室膜基质时，确保始终在冰上工作，并在冷冻移液器尖端和管中使用冰冷溶液。
将紫外线台灯放在生物安全罩中。接下来，将之前准备的灭菌石蜡薄膜放置。如果石蜡薄膜未完全干燥，请使用真空吸气系统去除任何残留液体。
使用自 <3>化钳子，在每个培养皿中，在石蜡膜上放置六个自 <3>自 <3>化盖玻片。为了准备UV交核多丙烯酰胺最终溶液，用聚丙烯酰胺水凝胶前体溶液稀释光启动器溶液。使用 50 毫升过滤装置对溶液进行灭菌，其孔径为 0.22 微米。
然后将 200 微升的 UV 交核多丙烯酰胺最终溶液分配到 Petri 盘中的六个玻璃盖玻片上。使用自动解吸钳，小心地用第二个盖玻片盖住每个盖玻片，在两个盖玻片之间捕获溶液的一层。将装有盖玻片的培养皿放在紫外线台灯下，盖子未关闭。
白纸覆盖在非白色表面上对尽量减少紫外线强度损失非常重要。为防止紫外线辐射，请用铝箔盖住灯。多丙烯酰胺水凝胶的光聚聚一体，可进行五分钟。
使用剃须刀刀片小心地分离每对盖玻片。用 PBS 填充包含六种水凝胶盖玻片复合材料的储液罐。冲洗五分钟后，将水凝胶盖玻片复合材料返回培养皿中的石蜡膜。
在零下80摄氏度的储存中获取一管S sulfo-SANPAH。将1，200微升预冷却PBS加入管子，通过上下移液混合。将稀释的 Sulfo-SANPAH 的 200 微升分配到 Petri 盘中的石蜡薄膜上。
将水凝胶盖玻片复合材料放在 Sulfo-SANPAH 上，水凝胶与 Sulfo-SANPAH 接触。接下来，将水凝胶盖玻片复合材料放在紫外灯下，并将其暴露五分钟，以激活 Sulfo-SANPAH。如果 Sulfo-SANPAH 从橙色变为棕色，表示激活和合并成功，请于 10 分钟内继续执行下一步。
用新鲜的 PBS 补充一次性聚丙烯储液罐。将激活的水凝胶盖玻片复合材料转移到储液罐中，并短暂冲洗，以去除未绑定的 Sulfo-SANPAH。将水凝胶盖玻片复合材料放在培养皿中的石蜡薄膜上，然后用无菌无绒湿巾小心地涂抹。
在每个水凝胶盖玻片复合材料的顶部放置一个模具。为确保模具和复合材料之间的密封紧密，使用自动清洁的无绒湿巾擦拭，去除多余的水分。小心地分配稀释的基底膜基质蛋白溶液，在每个水凝胶盖玻片复合材料上放置 200 微升。
在37摄氏度下过夜孵化结构。第二天，将复合材料转移到六井板。通过观察基质蛋白溶液是否保留在模具顶部，可以很容易地验证水凝胶和模具之间的紧密密封。
未能形成紧密密封会导致蛋白质溶液快速通过孔泄漏。将复合材料完全浸入 PBS 中。使用自 <3>化钳子，小心地将模具从水凝胶中分离，而不会撕裂水凝胶。
从油井中去除 PBS，用 DMEM 重新填充油井。在37摄氏度下孵育板。从培养箱中取出板后，检查 DMEM。
如果 DMEM 不是多云的，水凝胶盖玻片复合材料可用于细胞电镀。模具是制造出来的，包含方形和矩形数组。微表层水凝胶基板是从基质蛋白的模具和孤岛中创造的。
也获得细胞岛。例如，人类诱导多能干细胞衍生的心肌细胞的岛屿。基质蛋白浓度在生成适当模式方面起着至关重要的作用。
最佳浓度导致蛋白质的均匀分布。次优基质蛋白溶液浓度导致模式不理想。使用模具的正面至关重要。
如果使用模具的背面，则由于激光切割的方向，基质蛋白岛的大小会增加。虽然使用模具的背面没有显著影响矩形图案的宽度，但高度显著增加导致预期纵横比降低。基于模具的图案应用于硅弹性体基板。
硅弹性体基板上的图案心肌细胞在低放大率下通过心脏肌蛋白T的免疫细胞化学和高放大率的沙康蛋白α-actin进行可视化。基于模具的图案也应用于具有不同刚度的水凝胶上并排的两个心肌细胞。人类诱导多能干细胞的发现和相应的分化方案，使其成为研究肿瘤生成和发病机系的理想体外模型。
然而，使用IPS系统的一个主要限制是缺乏结构，对微环境具有特殊的生化成分和刚度与细胞相互作用。模式可以与牵引力显微镜和免疫细胞化学分析相结合，来描述心肌细胞的结构和功能。分析IPS衍生细胞类型，在我们的案例中，在更生理的形态中，为研究培养皿中具有挑战性的心肌细胞提供了机会。
该技术还可用于许多其他系统，如和高含量筛选板。形状和基板可以随应用而轻松调整。
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概述
本方案介绍了一种基于模板的、无需光刻技术的微图形化方法，适用于生物工程经验有限的研究人员。该方法利用可重复使用的激光切割模板对细胞外基质蛋白进行微图形化，从而实现对细胞形态的调控，尤其适用于诱导性多能干细胞来源的心肌细胞。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 生物工程学
- 干细胞研究
背景
- 传统的光刻和软光刻方法可能复杂且成本较高。
- 这种新方法设计为低成本且可定制。
- 它使非工程领域的研究人员能够探索细胞形态和机械转导。
- 微图形化技术可应用于数千个细胞，适用于高通量研究。
研究目的
- 提供一种简便的微图形化方法，使更广泛的研究人员能够开展相关研究。
- 促进在不同背景下对细胞形态和机械转导的研究。
- 实现高通量药物筛选和疾病建模。
使用的方法
- 聚丙烯酰胺水凝胶溶液的制备。
- 使用激光切割模板进行微图案化。
- 将盖玻片从水凝胶上剥离。
- 放置模板前对水凝胶进行干燥。
主要结果
- 该方法可成功实现细胞外基质蛋白的图案化。
- 该方法展现出有效调控细胞形态的能力。
- 该方法适用于高通量应用。
- 可视化演示有助于加深对实验方案的理解。
结论
- 这种无需光刻的方法简化了微图形化过程。
- 它为细胞生物学和机械转导研究开辟了新的途径。
- 该方案适用于生物医学研究中的多种应用。
常见问题
行业应用价值
这种无需光刻的基于掩膜的微图形化方法解决了单细胞分析中的可及性障碍，使更广泛的研发团队能够在无需专业微加工技术的情况下研究力传导和细胞命运决定。通过支持数千个细胞的高通量图形化，该方法提高了在靶点验证和表型筛选工作流程中的预测可靠性。该技术降低了操作复杂性和成本，有助于在早期发现和临床前模型开发中实现规模化应用。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过调控细胞形态和大小，研究疾病相关系统中的力传导通路，从而验证治疗假设。
- 操作价值：提供一种稳健且低成本的平台，利用诱导多能干细胞分化的心肌细胞及其他细胞类型进行功能靶点验证。
- 预测可靠性：通过生成定量的形态学和功能读数，降低机制假设的风险，支持项目组合的筛选决策。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：通过创建具有可控细胞外基质呈递的标准化微图案化基底，制备可用于下游化合物评价的经验证生物学系统。
- 操作价值：利用可重复使用的激光切割模板和基于水凝胶的蛋白质图案化技术，实现检测方法的标准化和可重复性。
- 可扩展性：支持高通量筛选，每次实验可图案化多达 2,000 个细胞，有助于剂量-反应关系和表型分析。
转化与临床前研究
- 疾病相关系统：适用于诱导多能干细胞来源的心肌细胞，能够研究成体样矩形形态，更真实地模拟心脏疾病背景下生理性的机械转导过程。
- 转化连续性：通过在不同基质刚度下评估细胞结构与功能，连接发现阶段与临床前研究，支持生物标志物的一致性分析及基于风险评估的推进决策。
- 机制性风险降低：通过分离细胞几何形状对信号通路的影响，减少表型与基因型关系中的不确定性，提高向体内转化的预测价值。
流程与工作流整合
该方法可融入从假设验证到先导化合物鉴定的整个发现流程，为机制性检测和表型检测提供标准化的细胞制备。
- 发现生物学：通过精确控制细胞形态和面积，支持在诱导多能干细胞（iPSC）衍生模型中进行假设检验和信号通路解析，以研究机械转导。
- 筛选：通过可重复地对数千个细胞进行微图形化处理，提供即用型检测和定量输出，从而在疾病建模应用中实现可靠的化合物筛选。
- 分析：生成可量化的输出结果，如细胞排列、蛋白岛形成及形态学指标，帮助研究团队比较不同遗传或药物干预条件下的差异。
- 转化研究：通过在可调基底（例如硅基弹性体）上进行图案化，评估刚度依赖性响应，与纤维化或缺血性心脏模型相关，实现与临床前研究的衔接。
- 企业级复用：将基于模板的方法定位为跨项目可复用的技术能力，减少重复性设置，推动在力学生物学和表型筛选平台中的跨团队应用。
运营与企业影响
- 科学价值：通过可控的单细胞微图形化减少机制上的模糊性，提高靶点验证的预测可信度。
- 操作价值：利用可重复使用的模板和基于水凝胶的图形化技术，与标准细胞培养流程兼容，增强实验的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过实现对形态依赖性表型反应的早期检测，改善“推进/终止”决策，降低心血管和以机械转导为重点的研究项目在后期阶段的生物学风险。
- 项目组合影响：生成高内涵、与形态关联的数据，为靶点选择和先导化合物优化提供依据，支持基于风险调整的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备基本的细胞培养和分子生物学专业知识；无需专门的微加工技术培训。
- 依赖于紫外光源、激光切割掩膜板（可外包）以及标准水凝胶试剂（如丙烯酰胺、Sulfo-SANPAH）的可及性。
- 需要跨团队统一规范掩膜板方向和水凝胶制备流程，以确保蛋白图案的一致性和长宽比的可控性。
- 适应性考虑因素包括基底兼容性（如玻璃、弹性体）以及针对特定细胞类型的细胞外基质蛋白优化。
- 实际限制包括需小心操作掩膜板以避免水凝胶撕裂，以及在Sulfo-SANPAH活化过程中需精确控制时间，以确保蛋白固定效率。
