Name: 使用激光切割模具实现简单的无光刻单细胞微模式 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 了解使用激光切割模具实现无光刻单细胞微图案的方法。该技术利用可重复使用的模具对细胞外基质蛋白进行微图案化，适用于诱导多能干细胞衍生的心肌细胞，为高通量药物筛选和疾病建模提供了简便途径。

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本工作获得了以下资助：S.L. 获斯坦福儿童健康研究所（CHRI）博士后奖学金和美国国立卫生研究院（1F32HL142205-01）资助；S.M.W. 获美国国立卫生研究院院长办公室先锋奖（LM012179-03）、美国心脏协会资深研究者奖（17EIA33410923）、斯坦福心血管研究所、Hoffmann 和 Schroepfer 基金会以及斯坦福大学医学院心血管医学部资助；J.C.W. 获美国国立卫生研究院（UG3 TR002588、P01 HL141084、R01 HL126527、R01 HL113006、R01 HL123968）和烟草相关疾病研究计划（TRDRP 27IR-0012）资助；H.Y. 获美国心脏协会（AHA）博士后奖学金（18POST34030106）资助；T.S. 获Hengstberger奖学金资助。我们感谢斯坦福神经科学显微成像服务中心的Andrew Olsen博士在微图形化hiPSC-CM共聚焦成像方面的支持。我们感谢H.Y.完成了首个模板设计、制备、在聚丙烯酰胺水凝胶包被的盖玻片上对iPSC-CM进行单细胞微图形化，以及对单细胞微图形化iPSC-CM肌节结构的初步共聚焦成像。

1. 负图案聚酰亚胺基掩模的制备
<ol>
	<li>使用计算机辅助设计软件（例如 AutoCAD、SolidWorks、Onshape、Adobe Illustrator）生成.dxf格式的图案（图2A）。
	<ol>
		<li>绘制一个圆（直径 = 22 mm），用于界定掩膜的边界。</li>
		<li>绘制实心填充的形状或所需的图案。</li>
		<li>添加一个手性字母（例如 R），以标记掩膜的正面。 
		注意：作为示例，生成了方形和矩形阵列，用于在单细胞和细胞对水平上图案化iPSC-CMs。设计文件可获取（见补充文件）。微加工分辨率极限约为10 µm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将设计提交至微加工公司，进行聚酰亚胺薄膜的激光切割并制作掩膜（图2B、C）。</li>
</ol>
2. 硫代磺基-SANPAH 分装液的制备
注意：本方案修改自 Fischer 等人11。
<ol>
	<li>使用防潮的硬纸板样品储存盒（例如，100 孔，10 × 10 离心管位，尺寸：13.4 cm × 13.4 cm × 5.1 cm）。在盒上标记为&#34;姓名/日期/sulfo-SANPAH 40 µL/用 1,200 µL PBS 重悬&#34;。</li>
	<li>在 50 个微量离心管（聚丙烯材质，1.5 mL）的管盖上标记字母“S”。</li>
	<li>取 4 mL 无水、超干燥的二甲基亚砜（DMSO），使用膜过滤装置（孔径 = 0.22 µm）进行无菌过滤，并收集至无菌的 15 mL 锥形管中。</li>
	<li>准备液氮浴，并盖上盖子以减少液氮的蒸发。</li>
	<li>将 50 mg sulfo-SANPAH 溶解于 2 mL 经过滤的 DMSO 中。</li>
	<li>充分涡旋振荡，使 sulfo-SANPAH 完全溶解于 DMSO 中。</li>
	<li>将 sulfo-SANPAH 溶液以每份 40 µL 分装至无菌的 1.5 mL 离心管中。</li>
	<li>将分装后的离心管转移至储存盒中。</li>
	<li>将离心管在液氮中速冻 5 分钟。</li>
	<li>将分装样品在 -80 °C 下保存。 
	注意：分装样品在 6 个月内使用不会降低活性。sulfo-SANPAH 储备液浓度为 25 mg/mL 或 50.77 mM。</li>
</ol>
3. 工具灭菌
<ol>
	<li>将两把镊子、24 个玻璃盖玻片（22 × 22 mm，1 号或 1.5 号）、一把剃刀刀片和三块无绒吸水擦拭布进行高压灭菌。
	 
	注意：制备 12 个水凝胶结构需要 24 个玻璃盖玻片，每个结构使用两个盖玻片。建议额外准备一些备用盖玻片。</li>
	<li>将两片石蜡膜（4 × 4 英寸）放入耐乙醇的塑料盒中（例如 1,000 µL 移液器吸头盒），用新鲜的 70% 乙醇浸泡至少 15 分钟以进行消毒。&#160;</li>
</ol>
4. 聚丙烯酰胺水凝胶前体溶液的制备
注意：本方案修改自 Lee 等人12。
<ol>
	<li>在50 mL聚丙烯离心管中，将125 mg氨基乙基甲基丙烯酸酯（AEM）溶于36.25 mL去离子水中，通过涡旋混合溶解。</li>
	<li>为配制50 mL 10 kPa聚丙烯酰胺前体溶液（8–0.15–15 mM），在新的50 mL聚丙烯离心管中混合10 mL 40%丙烯酰胺溶液、3.75 mL 2%双丙烯酰胺溶液以及第4.1步制备的36.25 mL AEM溶液。 
	注意：前体溶液的终浓度为8%丙烯酰胺、0.15%双丙烯酰胺和15 mM AEM，经原子力显微镜测定其刚度约为10 kPa。根据目标组织应用的不同，可通过调整40%丙烯酰胺溶液与2%双丙烯酰胺溶液的比例来改变水凝胶的刚度。例如，8%丙烯酰胺–0.08%双丙烯酰胺溶液可形成3 kPa的水凝胶；8%丙烯酰胺–0.48%双丙烯酰胺溶液可形成38 kPa的水凝胶；8%丙烯酰胺–0.48%双丙烯酰胺溶液可形成60 kPa的水凝胶。建议通过实验验证调整比例后所制备前体溶液形成的水凝胶刚度。</li>
</ol>
5. 光引发剂溶液的制备
<ol>
	<li>配制1 mL的5%光引发剂溶液时，首先将50 mg的2-羟基-4’-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮粉末溶于带盖的1.5 mL聚丙烯离心管中的700 µL 100%乙醇中。 
	注意：2-羟基-4’-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮不溶于水。请通过涡旋振荡确保粉末在乙醇中完全溶解。</li>
	<li>通过涡旋振荡使2-羟基-4’-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮在乙醇中完全溶解后，加入300 µL磷酸盐缓冲液（PBS），最终体积为1 mL。 
	注意：2-羟基-4’-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮溶液的最终浓度为5%。避光保存的5%光引发剂溶液在4 °C下可稳定保存4周。</li>
</ol>
6. 基底膜基质蛋白溶液的制备
注意：基底膜基质（材料表）是一种温度敏感性材料。操作时务必在冰上进行，并使用预冷的移液器吸头和离心管，以及冰上预冷的溶液。新的基底膜基质储备液应在4 °C冰上缓慢解冻过夜。
<ol>
	<li>每个水凝胶结构准备 200 µL 基底膜基质蛋白溶液。对于 12 个结构，需要 2.4 mL 基底膜基质蛋白溶液。额外多准备 10% 的溶液（例如，2.6 mL）。</li>
	<li>对于每一批新的基底膜基质蛋白溶液，需优化其稀释比例。首次使用时，可测试 1:10、1:20 和 1:40 的稀释比例，以确定能够获得最佳细胞图案化效果的稀释比例。 
	注意：如果基底膜基质蛋白溶液过于黏稠，会在模板表面形成凝胶，且在移除模板时更容易脱落；如果蛋白溶液过于稀薄，则会渗透穿过模板的图案孔洞，导致图案化质量下降。</li>
	<li>在冰上用预冷的杜尔贝科改良伊格尔培养基/营养混合物 F-12（DMEM/F12）或 1× PBS 将基底膜基质蛋白原液稀释至上述优化的稀释比例。例如，将 120 µL 原液加入 2.4 mL DMEM/F12 培养基中（1:20），并在冰上保存以备后续使用。</li>
</ol>
7. 水凝胶制备
<ol>
	<li>在生物安全柜中放置一个紫外台灯（365 nm，4 mW/cm2）。</li>
	<li>将步骤 3.2 中灭菌的石蜡膜取出，并在无菌条件下完全干燥。如果石蜡膜未完全干燥，使用真空抽吸系统去除任何残留液体。使用已灭菌的镊子将步骤 3.1 中的六片经高压灭菌的盖玻片放置在每片石蜡膜上。</li>
	<li>通过将 5% 光引发剂溶液（步骤 5.2）与聚丙烯酰胺前体溶液（步骤 4.2）在 50 mL 聚丙烯离心管中混合，制备可紫外交联的聚丙烯酰胺前体溶液。配制 5 mL 可紫外交联的聚丙烯酰胺前体溶液时，向 5 mL 聚丙烯酰胺前体溶液中加入 50 µL 的 5% 光引发剂溶液。</li>
	<li>使用带有 0.22 µm 孔径滤膜的 50 mL 滤器装置对步骤 7.3 中的前体溶液进行过滤灭菌。 
	注意：务必现配现用前体溶液。</li>
	<li>在石蜡膜包裹的培养皿中，将步骤 7.4 中的 200 µL 聚丙烯酰胺前体溶液滴加至每个 22 × 22 mm 玻璃盖玻片上，并小心地将另一片 22 × 22 mm 玻璃盖玻片覆盖在上方，使溶液夹在两片盖玻片之间（图 3A）。 
	注意：使用石蜡膜可防止溶液溢出，并将前体溶液限制在盖玻片之间。</li>
	<li>将步骤 7.5 中含有盖玻片的培养皿置于紫外台灯下，对聚丙烯酰胺水凝胶进行 5 分钟的光聚合（图 3B）。 
	注意：&#160;若表面非白色，表面的紫外吸收会降低光交联效率。在非白色表面上覆盖白纸对于减少紫外强度损失至关重要。&#160;为防止紫外辐射，需用铝箔覆盖紫外灯，并佩戴防紫外护目镜。</li>
	<li>使用刀片通过杠杆作用小心地将一片盖玻片从另一片上分离（图 3C）。 
	注意：水凝胶通常会粘附在上方的盖玻片上。在将盖玻片从柔软的水凝胶上剥离时需格外小心，因其容易破裂。</li>
	<li>用 PBS 填充一次性聚丙烯储液槽。将带有水凝胶的盖玻片复合物&#160;转移至含 PBS 的储液槽中，用 PBS 冲洗水凝胶 5 分钟。冲洗后，将水凝胶结构重新放回培养皿中的石蜡膜上。</li>
</ol>
8. 蛋白质偶联
<ol>
	<li>准备一个冰桶并将 PBS 预冷。 
	注意：对于六个水凝胶，需要 1,200 µL 冷 PBS。</li>
	<li>取出 sulfo-SANPAH 分装样品（1 瓶 = 6 个凝胶）。 
	注意：如有必要，在优化后可减少 sulfo-SANPAH 的使用量。</li>
	<li>向一瓶 sulfo-SANPAH 分装样品中加入 1,200 µL 冷 PBS，并通过上下吹打混匀。</li>
	<li>在培养皿中的石蜡膜上分配 200 µL sulfo-SANPAH 溶液，并将水凝胶-盖玻片复合物覆盖其上，使水凝胶接触 sulfo-SANPAH（图 3D）。 
	注意：由于水解作用，sulfo-SANPAH 对水分极为敏感。使用前应从 -80 °C 新鲜解冻，不可重复使用或重新冷冻剩余样品。</li>
	<li>将水凝胶置于 365 nm、4 mW/cm2 的紫外灯下照射 5 分钟，以激活 sulfo-SANPAH。 
	注意：照射后，sulfo-SANPAH 颜色会由橙色变为棕色（图 3E）。若水凝胶变棕，表明 sulfo-SANPAH 的苯基叠氮基团已成功激活，并已结合到水凝胶表面。激活后需在 10 分钟内立即进行步骤 8.6–8.9，因为 sulfo-SANPAH 的活性会随时间下降。</li>
	<li>用新鲜 PBS 补充一次性聚丙烯储液槽。在 sulfo-SANPAH 激活后，将激活的水凝胶转移至 PBS 储液槽中，快速冲洗以去除未结合的 sulfo-SANPAH。 
	注意：长时间洗涤会导致蛋白偶联效率降低。</li>
	<li>快速冲洗后，将附着水凝胶的盖玻片放置于培养皿内的石蜡膜上，并用无菌无尘纸小心吸除水凝胶表面的液体。 
	注意：若水凝胶表面残留 PBS，会导致基底膜基质蛋白溶液透过模板发生泄漏；而过度干燥则会使水凝胶在移除模板时因与模板粘附过强而破裂。</li>
	<li>将模板置于水凝胶上方，并用灭菌无尘纸轻轻按压，确保模板与水凝胶之间紧密密封（图 3F）。</li>
	<li>小心地将步骤 6.3 中配制的稀释基底膜基质蛋白溶液 200 µL 加至表面（图 3G），然后在培养箱中（37 °C）过夜孵育。 
	注意：当模板与水凝胶接触紧密且基底膜基质蛋白溶液浓度适当时，溶液将被限制在模板上方并保持原位（图 3H）。在优化条件下可缩短孵育时间，理论上可缩短至 30 分钟至 2 小时。</li>
	<li>次日，将水凝胶转移至 6 孔板中，并完全浸没于 PBS 中。 
	注意：建议在 PBS 浸没条件下剥离模板，以防止水凝胶撕裂或粘附在模板上。</li>
	<li>使用灭菌镊子小心移除模板，避免撕裂水凝胶。用 DMEM 充分重悬，将图案化水凝胶放回培养箱，并过夜培养以检测是否存在污染。</li>
	<li>若培养基保持澄清，水凝胶即可用于细胞接种。应优化细胞接种密度和孵育时间，以满足不同应用中细胞贴附的需求。 
	注意：对于 hiPSC-CMs 的单细胞图案化，建议接种后过夜培养。推荐接种细胞数为：每孔 30,000、60,000 和 90,000 个细胞。接种过多细胞会导致每个图案区域出现多个细胞。建议在接种前使用细胞筛过滤，去除非单细胞团块。</li>
	<li>次日观察细胞贴附与铺展情况，并更换培养基以清除未贴附的细胞。</li>
</ol>
9. 使用后模板的清洗
<ol>
	<li>为去除使用过的模板上残留的基质蛋白，将模板浸入酶溶液（材料表）中，在 37 °C 下孵育 10 分钟。 
	注意：应根据所用的基质蛋白选择相应的酶。对于富含胶原蛋白的基质蛋白溶液，使用胶原酶。建议在酶溶液中进行 10–15 分钟的超声处理。</li>
	<li>吸除溶液，并更换为 10% 次氯酸钠溶液，在室温下孵育 10 分钟。</li>
	<li>用 PBS 洗涤 3 次。</li>
	<li>置于 70% 乙醇中，4 °C 保存备用。</li>
</ol>

<ol><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+Defined+and+Small+Molecule-Based+Generation+of+Human+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).</li>
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<li>Ribeiro, A. J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractility+of+single+cardiomyocytes+differentiated+from+pluripotent+stem+cells+depends+on+physiological+shape+and+substrate+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).</li>
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<li>Toepke, M. W., Beebe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+absorption+of+small+molecules+and+consequences+in+microfluidic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications.</a> Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).</li>
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<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+PDGF+pathway+links+LMNA+mutation+to+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy.</a> Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).</li>
<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+diastolic+dysfunction+in+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+from+hypertrophic+cardiomyopathy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients.</a> European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).</li>
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<li>Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+with+enhanced+protein+conjugation+efficiency+reveal+stiffness-induced+YAP+localization+in+stem+cells+depends+on+biochemical+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues.</a> Biomaterials. 202, 26-34 (2019).</li>
<li>Théry, M., Pépin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+distribution+of+stress+fibres+in+response+to+the+geometry+of+the+adhesive+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility%22%5BJournal%5D)">Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment.</a> Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).</li>
<li>Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+cues+for+directing+the+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

我们介绍一种无需光刻的基于掩膜板的微图形化方法，该方法可有效实现贴壁细胞的图案化。在本实验方案中，我们通过在具有生理或病理相关组织硬度的聚丙烯酰胺水凝胶或基于硅的弹性体基底上，对基底膜基质蛋白进行微图形化，形成特定岛状结构，从而实现不同长宽比的人诱导多能干细胞来源心肌细胞（hiPSC-CMs）的图案化。该方法相对简单，易于操作，适用于所有研究人员，包括那些在光刻和微加工技术方面经验有限的研究者。本方法避免了软光刻技术中制备印章以及微接触印刷技术中将蛋白质从印章模具转移至目标基底所面临的主要挑战。本方案提供了一套完整的工作流程：1）以经济高效的方式创建具有特定面积和形状的定制化掩膜板；2）制备具有目标硬度的水凝胶基底；3）在水凝胶基底上高效共价结合细胞外基质（ECM）蛋白。
传统的软光刻方法已被用于在不同材料的基底（如基于硅的材料和玻璃盖玻片）上图案化各种形状的细胞外基质（ECM）蛋白，包括三角形和星形13,14。在本研究中，我们仅展示了矩形图案，因为心肌细胞在生理和...

人诱导多能干细胞（hiPSCs）的出现以及随后建立的将其定向分化为不同类型细胞的实验方案，使得在分子水平和患者特异性层面上研究发育过程和疾病成为可能，特别是利用患者来源的诱导多能干细胞衍生的心肌细胞（iPSC-CMs）来建模心肌病1,2。然而，使用iPSC系统及其他体外模型研究发育和生理功能的一个主要局限在于缺乏结构化的微环境。在体内，细胞受到细胞外基质（ECM）以及邻近细胞的物理约束。这些微环境特定的生化组成和刚度决定了细胞的空间分布以及可用于细胞黏附的因子。这反过来影响细胞内信号通路、基因表达和细胞命运决定。例如，被微图形化为成年样杆状结构的iPSC-CM在收缩能力、钙离子流动、线粒体排列、电生理特性以及横小管形成方面均显著改善3。因此，微环境的特性在调控细胞功能中起着关键作用。
以往的微图形化技术在很大程度上依赖于光刻技术（图1A）。在该技术中，将一层光敏聚合物（即光刻胶）从溶液中旋涂于平坦的基底上，形成厚度约为1 μm的薄膜。随后，通过含有目标图形的掩膜将紫外（UV）光照射到光刻胶上。紫外（UV）光照射会通过改变光刻胶在其对应显影液中的溶解度，从而在化学上改变光刻胶的性质，将掩膜上的图形转移到基底上。许多微图形化方法都结合了光刻技术，因为它能够对细胞图形的设计实现纳米级至微米级的精确控制。然而，光刻胶的旋涂过程对杂质极为敏感，因为即使是最微小的灰尘颗粒也会干扰溶液在基底上形成均匀薄膜的过程。因此，光刻操作必须在无污染的环境中进行，而这类设施的维护成本高昂，且需要专门的技术知识才能使用。此外，光刻过程中使用的化学试剂通常对细胞具有毒性，并可能使重要的生物分子变性。因此，光刻技术在制备适用于常规生物学应用的微图形方面存在显著障碍。
1994年，Whitesides 及其同事4通过开创一系列称为软光刻（soft lithography）的技术，克服了与光刻技术相关的一些挑战。在软光刻中，使用由聚二甲基硅氧烷（PDMS）——一种透明、类似橡胶的材料——制成的微结构表面，来生成细胞外基质（ECM）蛋白的图案4。常见的软光刻技术包括微接触印刷（microcontact printing）和微流控图案化（microfluidic patterning）。在目前最常用的软光刻方法——微接触印刷中，涂覆有ECM蛋白的PDMS印章将蛋白材料转移到印章与表面接触的区域（图1B）。在微流控图案化中，PDMS表面设计有微结构，当印章压在基底上时，会形成一系列微通道网络，液体可通过这些通道输送到目标区域（图1C）5。与光刻技术相比，软光刻具有多项优势。一旦主模板晶圆完成微加工，PDMS印章便可轻松复制，无需进一步使用洁净室设施。此外，软光刻过程中不使用有机溶剂，因此可利用聚苯乙烯等常用于细胞培养的聚合物材料。最后，软光刻的微图案化不仅限于平面表面。因此，与光刻技术相比，软光刻提高了微图案制备的可及性和功能性6。然而，软光刻也存在显著缺点。例如，仍需使用光刻技术进行初始蚀刻步骤，以完成印章的微加工。此外，使用PDMS印章进行微图案化时，蛋白向基底转移的质量可能存在变异6。为避免这些差异，必须在蛋白转移过程中优化并保持施加于PDMS印章的压力一致性，否则可能导致PDMS模具特征尺寸的变形和失真6。此外，由于小分子吸收问题，PDMS的重复使用也存在重大顾虑7。
为避免使用软光刻和PDMS印章，本文介绍了一种基于模板的、无需光刻的单细胞微图案化方法，可克服与光刻和软光刻相关的诸多障碍。该方法采用聚丙烯酰胺水凝胶作为基底，通过模板实现细胞外基质（ECM）蛋白的定点整合，从而实现单个hiPSC-CMs的选择性接种。该技术与经典细胞培养条件下常用的聚合物材料高度兼容。此外，经过适当的清洗和维护，模板可重复使用，并且在微加工过程中具有抗降解和抗蛋白吸附的特性。最后，该图案化过程技术上稳健、成本低廉、可定制，并且无需专业的生物工程技能即可操作。这种基于模板的微图案化技术已在我们近期发表的多种心肌病建模研究中得到广泛应用8,9,10。

<table><tbody><tr><td>2-氨基乙基甲基丙烯酸盐酸盐（粉末）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>516155</td><td></td></tr><tr><td>丙烯酰胺溶液 40%（溶液）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-4058-100mL</td><td></td></tr><tr><td>台式紫外灯 365 nm</td><td>UVP</td><td>UVP 95-0042-07, XX-15L</td><td></td></tr><tr><td>BioFlex 培养板</td><td>FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC</td><td></td><td>含硅弹性体基底的 6 孔板</td></tr><tr><td>双丙烯酰胺溶液 2%（溶液）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1533-25mL</td><td></td></tr><tr><td>Corning 盖玻片，方形，No. 2，W &amp;times; L 22 mm &amp;times; 22 mm</td><td>Sigma</td><td>CLS285522</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure（2-羟基-4&amp;prime;-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮）（粉末）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>410896</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>基底膜基质蛋白溶液</td></tr><tr><td>二甲基亚砜，99.7+%，超干燥，AcroSeal，ACROS Organics</td><td>Acros Organics</td><td>326881000</td><td></td></tr><tr><td>Millex（13 mm）Durapore 膜滤器单元</td><td>Millipore</td><td>SLGV013SL</td><td></td></tr><tr><td>Millipore 50 mL Steriflip（0.22 &amp;micro;m）</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>模板</td><td>Potomac</td><td>定制设计</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SANPAH</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1217702</td><td>用于模板清洗的酶</td></tr></tbody></table>

使用激光切割模板的简易无光刻单细胞微图案化技术

Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils

微图形化技术已广泛应用于细胞生物学领域，用于在单细胞分辨率下研究控制细胞形态和大小对细胞命运决定的影响。目前最先进的单细胞微图形化技术涉及软光刻和微接触印刷，尽管该技术功能强大，但需要具备微加工方面的专业工程技能和相关设施支持。这些限制促使人们寻求一种更易获取的技术方法。本文介绍了一种简单且无需光刻的替代方法：基于模板的单细胞图形化技术。我们提供了详细的分步操作流程，包括模板设计、聚丙烯酰胺水凝胶制备、基于模板的蛋白质引入，以及细胞接种与培养。这种简单的方法可用于排列多达2,000个细胞的阵列。我们展示了来源于单个人诱导多能干细胞（hiPSC）的心肌细胞在不同细胞形态下的图形化结果，从1:1的正方形到7:1的类似成人心肌细胞的矩形。这种基于模板的单细胞图形化技术无需光刻，技术稳健、操作便捷、成本低廉，最重要的是，即使缺乏生物工程背景的研究人员也能轻松掌握和应用。

已成功制备出包含方形或矩形阵列的模板（图4A）。按照本方案，我们获得了图案化的基质蛋白岛（图4B 和 图5A）以及细胞（图4C）。基质蛋白溶液浓度不适宜会导致图案化效果不佳（图5B）。使用模板的正面至关重要。若使用模板的背面，由于激光切割方向的影响，基质蛋白岛的尺寸会增大（图6A、B）。虽然矩形图案的宽度未发生显著变化（图6C），但使用模板背面时其高度显著增加，导致预期的长宽比降低（图6D、E）。我们将基于模板的图案化技术应用于硅弹性体基底（图7</stro...

本方案介绍了一种无需光刻技术的微图形化方法，操作简便，适用于生物工程背景有限的研究人员。该方法利用定制的激光切割掩膜，将细胞外基质蛋白微图形化为特定形状，以调控细胞形态。本文以诱导多能干细胞来源的心肌细胞为例，演示了微图形化的操作流程。

微图案技术已广泛应用于细胞生物学，用于研究控制细胞形态和大小对单个细胞命运决定的影响……

我们将介绍一种基于模板的、无需光刻的单细胞微图形化方法，该方法克服了与光刻和软光刻相关的诸多障碍。这些模板可重复使用，且该过程成本低廉、可定制。该方法为非工程领域研究人员开辟了新途径，使其能够在多种生理和病理条件下研究细胞形态和面积诱导的机械转导。此外，该方案可实现数千个细胞的微图形化，可用于在培养皿中进行高通量药物筛选和疾病建模。视频演示将有助于植入两个关键步骤：从水凝胶上脱离盖玻片，以及在放置掩膜前充分干燥水凝胶。按照论文所述，在一个新的50毫升聚丙烯离心管中配制聚丙烯酰胺水凝胶溶液。接下来，配制5%光引发剂溶液：将组分溶解于700微升100%乙醇中。这些组分不溶于水，因此务必通过涡旋充分溶解。加入300微升PBS，最终体积为1毫升。在冰上操作，使用预冷的 DMEM F12 培养基或 1× PBS 将基底膜基质蛋白储备液稀释至优化的稀释比例。置于冰上保存，以备后续使用。处理基底膜基质时，务必始终在冰上操作，并使用预冷的溶液以及冷藏过的移液器吸头和离心管。将紫外台式灯放置于生物安全柜中。随后，放入先前制备好的已灭菌石蜡膜。如果石蜡膜未完全干燥，使用真空抽吸系统去除任何残留液体。使用已灭菌的镊子，将六个已灭菌的盖玻片分别放置于每个培养皿中的石蜡膜上。为制备紫外光交联型聚丙烯酰胺终溶液，将光引发剂溶液与聚丙烯酰胺水凝胶前体溶液混合稀释。使用孔径为0.22微米的50毫升滤器装置对溶液进行灭菌处理。然后将200 µL的紫外光交联型聚丙烯酰胺终溶液分别加入六个培养皿中的每一片玻璃盖玻片上。使用已灭菌的镊子，小心地用另一片盖玻片覆盖每一片盖玻片，使溶液层夹在两片盖玻片之间。将含有盖玻片的培养皿置于紫外灯下，培养皿盖保持打开状态。将白色纸张覆盖在非白色表面上，以最大限度减少紫外光强度的损失。为防止紫外线辐射，需用铝箔包裹光源。将聚丙烯酰胺水凝胶进行五分钟的光聚合。 使用剃刀刀片小心地分离每一对盖玻片。用 PBS 填充含有六个水凝胶盖玻片复合物的储液槽。用 PBS 冲洗五分钟之后，将水凝胶盖玻片复合物重新放回培养皿中的石蜡膜上。从–80摄氏度保存条件下取出一管 Sulfo-SANPAH。向管中加入1,200微升预冷的PBS，通过上下吹打混匀。将200微升稀释后的 Sulfo-SANPAH 滴加到培养皿中的石蜡膜上。将水凝胶盖玻片复合物覆盖在 Sulfo-SANPAH 上，使水凝胶与 Sulfo-SANPAH 接触。接着，将水凝胶盖玻片复合物置于紫外灯下，照射 5 分钟以激活 Sulfo-SANPAH。若 Sulfo-SANPAH 颜色由橙色变为棕色，表明激活和结合成功，需在 10 分钟内进行后续步骤。用新鲜的 PBS 补充分离的一次性聚丙烯储液槽。将活化的水凝胶盖玻片复合物转移至储液槽中，短暂冲洗以去除未结合的 Sulfo-SANPAH。将水凝胶盖玻片复合物放置在培养皿中的石蜡膜上，并用无菌无绒擦拭布小心吸干。将模板放置在每个水凝胶盖玻片复合物的顶部。为确保模板与复合物之间形成紧密密封，用经高压灭菌的无绒擦拭纸轻轻吸去多余水分。小心地将稀释的基底膜基质蛋白溶液滴加到每个水凝胶盖玻片复合物上，每片加入200微升。将构建物在 37 摄氏度下孵育过夜。第二天，将复合物转移至六孔板中。通过观察基质蛋白溶液是否保留在模板上方，可轻松验证水凝胶与模板之间是否形成紧密密封。未能形成紧密的密封会导致蛋白质溶液迅速从孔洞中泄漏。将复合物完全浸入磷酸盐缓冲液（PBS）中。使用已灭菌的镊子，小心地将模板从水凝胶上剥离，避免撕裂水凝胶。吸去孔中的 PBS，用 DMEM 重新填充各孔。将培养板在 37 摄氏度下孵育过夜。从孵箱中取出培养板后，检查 DMEM 的状态。如果DMEM不浑浊，则水凝胶盖玻片复合物已可直接用于细胞接种。已制备出含有方形和矩形阵列的模板。利用这些模板制备了微图案化水凝胶基底，并获得了基质蛋白岛。也获得了细胞岛。例如，由人诱导多能干细胞衍生的心肌细胞形成的细胞岛。基质蛋白浓度在生成适当图案的过程中起着关键作用。最佳浓度可导致蛋白质的均匀分布。基质蛋白溶液浓度不理想会导致图案化效果不佳。必须使用模板的正面。如果使用模板的背面，由于激光切割方向的原因，基质蛋白岛的尺寸会增大。尽管使用模板的背面并未显著影响矩形图案的宽度，但其高度显著增加，导致预期的长宽比降低。基于模板的图案化技术已应用于硅弹性体基底。通过低倍镜下心脏肌钙蛋白T的免疫细胞化学染色，以及高倍镜下肌节蛋白α-肌动蛋白的染色，观察硅基弹性体基底上图案化的心肌细胞。基于模板的图案化技术还被用于在不同硬度的水凝胶上并排构建两个心肌细胞的图案。人类诱导性多能干细胞的发现及其相应的分化方案，使得这一模型成为体外研究肿瘤发生和疾病发病机制的理想人类模型。然而，使用iPS系统的一个主要局限性在于缺乏具有特定生化组成和刚度的微环境结构，而这种结构对于与细胞相互作用至关重要。图案化技术可与牵引力显微镜和免疫细胞化学检测相结合，用于表征心肌细胞的结构与功能。在更接近生理形态的条件下分析iPS诱导的细胞类型（在本例中为心肌细胞），为在培养皿中研究具有挑战性的心肌细胞行为提供了新的机会。该技术还可应用于许多其他系统，例如高内涵筛选板。其形状和基底可根据具体应用需求轻松调整。

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Developmental Biology

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使用激光切割模具实现简单的无光刻单细胞微模式

开发了一种微冲压光刻技术，用于在聚合物基底的顶面、侧壁和底面生成微米及亚微米级图案。该方法克服了导电聚合物图案化以及侧壁图案制备的难题，可实现多种结构的快速制造，且无需使用强腐蚀性化学试剂。...

用于在聚合物基底上生成微米及亚微米级图案的微孔冲压光刻技术

本文描述了一种在显微镜腔室中构建黏附性梯度和可溶性梯度的方法，用于活细胞迁移研究。该人工构建的环境结合了抗污表面与黏附轨迹以及溶液梯度，从而可确定不同导向信号之间的相对重要性。...

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用于三维增材微制造的微砌筑技术

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斑马鱼胚胎单细胞的分离与表征

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