Name: 聚电解质复合微晶体的组装与特性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 学习聚电解质复合微晶体的组装与表征方法，利用盐退火技术实现低分散性纳米颗粒的可重复制备。该方法结合光散射、小角X射线散射和电子显微镜技术，为核酸药物递送提供可靠的纳米载体解决方案。

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我们感谢芝加哥大学软物质表征设施的Phil Griffin和先进电子显微镜设施的Tera Lavoie。我们还感谢阿贡国家实验室先进光子源的Xiaobing Zuo和Soenke Seifert以及美国国家标准与技术研究院层级材料设计中心（CHiMaD）提供的支持。我们感谢Jeff Ting和Michael Lueckheide对本工作的贡献。

作者无任何利益冲突需要披露。

如上所述，本文所述方案主要针对以寡核苷酸作为聚阴离子组分、pLys-PEG 作为阳离子-中性嵌段共聚物的情况而编写，但我们已使用多种其他聚合物（如聚丙烯酸、聚谷氨酸和 PEG-聚（苯乙烯基苄基三甲基铵））进行了测试，认为这些方案通常适用于大多数聚电解质组合。其中一个可能需要优化的参数是退火过程中所用的盐浓度，因为盐浓度应足够高，以确保在退火初期不会形成聚电解质复合物微粒（PCMs）。这一点可通过动态光散射（DLS）实验进行验证，或通过与仅含聚电解质（不含中性嵌段）时的相分离现象进行比较来判断。如果不宜采用盐退火，也可使用热退火，但所得产物的多分散性较大7。用于表征的样品浓度也可能需要优化，因为较大的纳米颗粒比小颗粒散射更多的光，而由于核酸骨架中含有电子密度较高的磷原子，其对 X 射线的散射效率也高于许多其他聚合物。此外，如果任一聚电解质的 pKa 接近工作条件下的 pH 值，则可能需要更严格地控制缓冲液的 pH。
本文介绍了两种光散射技术（即多角度/静态光散射和动态光散射）、小角X射线散射，以及冷冻和常规负染透射电子显微镜技术的实验方...

当带相反电荷的聚电解质在水溶液中混合时，由于反离子释放导致熵增加，溶液会分离为富含聚合物的凝聚相和贫聚合物的上清液1,2,3,4,5，这一现象称为聚电解质复合。如果将中性亲水嵌段连接到一个或两个聚电解质上，则会发生纳米尺度的相分离（图1A）。由此形成的自组装核-壳纳米颗粒根据其与表面活性剂胶束化的类比，被不同地称为聚电解质复合胶束（PCMs）、聚离子复合胶束、嵌段离子体复合物或共凝聚核胶束，尽管该体系的所有组分均为亲水性6,7。由于PCMs能够包载蛋白质和核酸等亲水性分子，并且其嵌段共聚物载体结构具有高度可调性，因此它们成为体内递送治疗分子的有吸引力的候选载体8,9,10,11,12,13。
将治疗性核酸递送至细胞靶点是一项尤为重要的挑战，而相分离复合物（PCMs）在这一领域具有多项优势。治疗性核酸（包括基因DNA、mRNA以及siRNA等寡核苷酸）在改善人类健康方面具有巨大潜力，但其实现潜力需克服众多生物学和物理屏障14,15,16。裸露的核酸易被血清和细胞内的核酸酶降解，在循环系统中被迅速清除，且其强烈的负电荷使其在无辅助情况下难以穿透细胞膜。目前克服这些障碍的方法包括昂贵的化学修饰以防止核酸酶破坏，和/或通过疏水相互作用将核酸封装到各种脂质纳米颗粒中15,17,18。尽管这些方法在局部注射和肝脏靶向方面已被证明有效，但在全身性应用时仍存在毒性、免疫原性以及生物分布有限等显著局限性16。相比之下，PCMs利用核酸的负电荷将其浓缩于相分离的核心内，而中性的外壳则提供空间位阻以抵抗降解，并可作为平台整合配体以增强靶向性或细胞摄取11,19。体外和动物研究表明，PCMs能够有效递送多种核酸载荷20,21,22,23,24，但我们目前尚难以根据组成聚合物的性质准确预测PCM的尺寸、形状和稳定性等特性，这限制了其更广泛的应用。
我们课题组及领域内其他研究者近期的工作已开始通过建立核酸与各类阳离子-中性聚合物形成的相容性复合材料（PCM）的结构-性能关系，甚至在某些情况下的结构-性能-功能关系，来解决这一问题7,25,26,27。这些研究中呈现出两个一致的主题：一是必须建立严格可控且可重复的PCM组装方案，二是应采用多种技术手段对所得纳米颗粒进行表征。聚电解质（尤其是像核酸这类电荷密度较高的分子）之间相互作用非常强烈，混合时似乎极易陷入动力学捕获状态，导致PCM制备物对实验操作中的微小变化高度敏感，并表现出较高的多分散性和批次间重复性差的问题。此外，研究表明PCM会因其组分在原子级构型上的差异而呈现出多种多样的形状和尺寸，而单一的表征技术很难全面捕捉这种多样性；特别是某些常用技术（如动态光散射，DLS）在数据解析时还需对粒子形状作出假设，进一步增加了表征难度。
本文讨论了用于PCM的材料设计与选择，重点关注寡核苷酸和阳离子-中性嵌段共聚物。随后，我们描述了一种盐退火方案，该方法先使用高盐浓度，再通过缓慢透析以避免PCM组装过程中的动力学捕获。在高盐条件下混合聚电解质，此时静电吸引力被屏蔽，然后缓慢降低盐浓度，使聚电解质逐步达到能量上最有利的构型，这一过程类似于热退火中的缓慢冷却。采用该方案，我们通常能够实现寡核苷酸PCM极低的多分散性和高度的可重复性7,26。最后，我们介绍了如何利用四种不同的测量技术，在从外部形貌到内部结构的极宽尺度范围内对PCM进行表征：动态光散射（DLS）、多角度光散射（MALS）、小角X射线散射（SAXS）以及透射电子显微镜（TEM）。我们希望这些实验方案能够帮助更多研究人员有效探索这类有趣纳米粒子的性能。
聚合物的选择与制备 
相变材料（PCM）的性质在很大程度上受到其组成聚合物的物理和化学特性的影响，因此聚合物的选择是设计过程中的关键步骤。目前研究最为充分的用于核酸相变材料的嵌段共聚物是线性二嵌段共聚物，例如聚赖氨酸-聚乙二醇（pLys-PEG），但相变材料也可在聚电解质与多种亲水性中性-带电聚合物之间形成，且可实现高通量制备28。所选带电基团的类型会显著影响离子配对的稳定性及胶束的形态26，并且已有研究表明，相变材料的尺寸随带电嵌段长度的增加而增大5,7,26（图2），从而使得相变材料的性质可根据特定应用需求进行调控。对于线性二嵌段共聚物，我们发现带电嵌段应至少含有10个电荷，并在目标pH条件下具有较强的电荷密度。较长的带电嵌段更有利于与寡核苷酸（如siRNA）形成相变材料，因为较短的嵌段难以有效复合这类分子21。我们已成功观察到嵌段长度达200的相变材料形成，文献中亦有报道更长聚合物的情况。中性嵌段的选择具有更大的灵活性24，但实践经验表明，过短的中性嵌段易导致聚集而非纳米颗粒的形成，且中性嵌段的最小长度随带电嵌段长度的增加而提高。对于pLys-PEG体系，当pLys长度低于约50时，PEG的分子量至少需达到3,000–5,000；随着带电嵌段长度进一步增加，所需的中性嵌段长度也相应增加。中性嵌段长度的增加会导致相变材料尺寸增大，尤其是壳层厚度的增加，这是由于中性聚合物的空间位阻效应所致。
本论文介绍了一种利用冻干的高纯度pLys-PEG和已知量的寡核苷酸制备聚电解质复合物（PCM）的实验方案，该方案也可轻松适用于其他体系。我们已成功将其应用于多种带电多肽，包括聚精氨酸和聚谷氨酸，以及多种合成聚电解质，如聚丙烯酸和聚（苯乙烯基三甲基氯化铵）。我们还描述了如何以聚电解质电荷的化学计量比制备PCM，但该比例易于调整。我们发现使用电荷浓度单位（c.c.）进行操作最为简便，该单位也可自然适用于未完全带电的聚合物。如果任一聚合物的特性不明确，则需谨慎准确测定其链长或质量，并确保除透析过程中为电荷中和所必需的盐分外，不存在过量盐分。在计算浓度时，也应考虑任何残留水分的影响。核酸浓度可通过在260 nm处的吸光度方便地定量，且在计算电荷浓度（c.c.）时应考虑其末端是否存在磷酸基团。
使用寡核苷酸作为多聚阴离子时，其杂交状态和化学结构有助于决定自组装的倾向性以及所形成 PCM 的特性5,7,26。在利用 PCM 进行递送时，若需满足生物学功效的要求，则优化这些因素将提高形成目标结构的可能性。用于分析杂交特性的有用工具包括用于核酸的 MATLAB 函数、NUPACK29 和 IDT OligoAnalyzer。我们建议对候选序列进行分析，以了解其与以下三种对象结合的强度：1）自身形成的发夹结构；2）同一序列的另一拷贝（自二聚体）；3）系统中存在的其他寡核苷酸。特定序列的 DNA 和 RNA 熔解温度也可通过最近邻法30,31进行计算。核酸的热退火（步骤 2.3）可使单个核苷酸中残留的任何二级结构发生变性，并促进达到平衡状态的折叠。
相变材料的表征与分析 
目前有多种技术可用于纳米颗粒的表征，包括静态光散射和动态光散射、电子或中子的小角散射以及电子显微技术。本文中，我们提供了两种光散射技术——小角X射线散射，以及两种电子显微技术的实验方案。
DLS 通过测量样品布朗运动引起的散射光强度在单一角度上的时间波动自相关性来进行分析。对这些数据进行拟合可获得球形胶束的流体动力学半径和多分散性（图3）。多角度光散射（MALS）则测量多个角度下的静态散射光强度。这种角度依赖性可反映纳米粒子的形状，但由于可见光的检测极限约为50 nm以上，因此对较小的纳米粒子效果有限。这两种技术均基于折射率差异，主要描述纳米粒子的外部尺寸。
小角X射线散射（SAXS）使用X射线作为散射探针，其较短的波长使得可在约0.1–100 nm的范围内进行测量。通过拟合观测到的散射强度与散射角的关系（通常以动量转移q表示），可以获得关于PCM形貌（即尺寸和形状）以及内部结构的信息。如果具备绝对强度校准，并且散射强度可外推至零角度，则还可估算PCM的质量和聚集数32，这使得SAXS成为一种极为多用途且有价值的方法。小角中子散射（SANS）在相似的长度尺度范围内具有灵敏性，但仅在专用设施中可用，因此本文将不对其进行详细讨论33,34,35。
近年来，台式SAXS仪器已经问世，但我们发现，对于PCM表征而言，同步辐射光源更为合适，因为其更高的强度使得对这些低对比度样品的数据采集速度显著加快。我们从用户的角度，提供了一份在先进光子源（美国阿贡国家实验室）12-ID-B光束线上采集PCM SAXS数据的简要方案。该方案应适用于大多数同步辐射光源，但在提出实验计划前，强烈建议咨询当地工作人员。我们还提供了一套使用Irena36的数据归约与分析方案，Irena是一组为Igor Pro编写的免费宏工具。Irena包含多种灵活的形状因子，可用于建模SAXS数据，并支持构建多组分模型，以描述PCM复杂的散射谱（见代表性结果部分的图4）。Irena还提供全面的在线文档和教程。在尝试以下操作之前，我们建议先熟悉这些资料，尤其是教程&#34;使用两个主要散射体群体对SAXS数据进行建模&#34;。
X射线散射实验中，辐射损伤是一个需要关注的问题，但可采取多种措施将其降至最低。特别是，我们建议使用带有注射泵和流动样品的流动池装置，而非密封毛细管。这种方法还能显著简化背景扣除。此外，建议对流动样品进行多次短时间曝光，而不是一次长时间曝光，以限制样品中任一体积所承受的辐射通量，并可通过比较各次曝光数据来识别可能的损伤。
与通常需要通过拟合来解析的散射技术不同，透射电子显微镜（TEM）通过将电子束穿过样品并在闪烁屏上投射图像，直接提供纳米颗粒在实空间中的可视化图像（图5）。本文介绍了两种TEM技术的操作方案。冷冻透射电镜（Cryo TEM）将胶束样品快速冷冻成一层薄的非晶态冰，以最少的外来物质保持其结构构象，适用于半径约为10–100 nm的胶束。负染透射电镜（Negative stain TEM）则是在样品干燥于载网表面后，用重金属盐（如铀）包围样品；由于染色剂密度较高，其对电子的散射强于样品本身，从而增强对比度，形成样品的负像。推荐使用冷冻透射电镜获取高质量图像，但该方法成本较高、耗时较长，且可能对比度不足。当存在此类限制时，应采用负染样品。各类示例见于图5。
这些技术各自报告了纳米颗粒的不同方面，具有不同的优势和局限性。光散射技术易于获得，通常是最快的方法，但在尺寸和形貌分辨率方面存在显著限制。小角X射线散射（SAXS）可在较宽的长度尺度范围内提供信息，并具有相对较高的通量，但需要专用设备采集数据，同时需要建模来解析结果。透射电子显微镜（TEM）图像易于解释，但可能存在对比度不足的问题，且本质上通量较低。我们的经验表明，结合多种表征技术可显著增加对相变材料（PCM）特性的了解，并简化单独使用任一技术所获得数据集的解释。例如，SAXS和TEM主要检测PCM的致密核心，而光散射则反映纳米颗粒的整体尺寸。因此，结合这些方法可实现对核心和冠层尺寸的同时测量。TEM获取实空间图像的能力可提供真实数据，有助于为建模SAXS数据选择合适的形态因子，从而解决原本可能存在的歧义。本文描述了这四种技术的实验方案，并在讨论部分给出了利用这些技术表征未知样品的示例流程。

<table><tbody><tr><td>70 mm 圆形滤纸</td><td>Whatman</td><td>1001-070</td><td>制网过程中用于吸液的滤纸</td></tr><tr><td>碳膜透射电镜载网</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>CF200-Cu</td><td>透射电镜载网</td></tr><tr><td>DAWN</td><td>Wyatt Technology</td><td>DAWN</td><td>多角度激光散射仪（MALS）</td></tr><tr><td>DNA 寡核苷酸</td><td>Integrated DNA Nanotechnologies Inc</td><td></td><td>定制寡核苷酸</td></tr><tr><td>带网格碳膜透射电镜载网</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>LC200-Cu</td><td>透射电镜载网</td></tr><tr><td>甲氧基-聚（乙二醇）-嵌段-聚（L-赖氨酸盐酸盐） PEG5k - PLKC50</td><td>Alamanda Polymers Inc</td><td>mPEG5K-b-PLKC50</td><td>示例嵌段共聚物</td></tr><tr><td>Milli-Q</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td>超纯水</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>用于测定核酸浓度</td></tr><tr><td>负作用镊子</td><td>Dumont</td><td>N7</td><td>用于载网制备的镊子</td></tr><tr><td>Parafilm &quot;M&quot;</td><td>Bemis Company Inc</td><td>PM996</td><td>实验室封口膜</td></tr><tr><td>Quantifoil 多孔碳膜透射电镜载网</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Q210CR1.3</td><td>透射电镜载网</td></tr><tr><td>研究级测角仪与激光散射系统</td><td>Brookhaven Instruments</td><td>BI-200SM</td><td>动态光散射/多角度激光散射仪（DLS/MALS）</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL</td><td>Thermo Scientific Pierce Protein Biology</td><td>87723</td><td>透析盒</td></tr><tr><td>小体积比色皿</td><td>Brookhaven Instruments</td><td>BI-SVC</td><td>用于 DLS/MALS 的比色皿</td></tr><tr><td>Solarus 950 高级等离子体系统</td><td>Gatan</td><td>Solarus 950</td><td>用于透射电镜载网处理的等离子体系统</td></tr><tr><td>Talos 透射电镜</td><td>FEI</td><td>Talos</td><td>用于冷冻样品的透射电镜</td></tr><tr><td>Tecnai Spirit 透射电镜</td><td>FEI</td><td>Spirit</td><td>用于干燥样品的透射电镜</td></tr><tr><td>甲酸铀酰</td><td>SPI-Chem</td><td>16984-59-1</td><td>用于透射电镜样品的负染色</td></tr><tr><td>Vitrobot</td><td>FEI</td><td>Vitrobot</td><td>用于冷冻载网制备的玻璃化机器人</td></tr></tbody></table>

聚电解质复合胶束的组装与表征

Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles

由带电聚合物在水溶液中自组装形成的核-壳纳米粒子——聚电解质复合胶束（PCMs），为研究聚电解质相互作用的物理机制提供了有力平台，同时也为解决治疗性寡核苷酸在体内的递送难题提供了有前景的方案。建立PCMs结构与性能之间的可预测关系一直具有挑战性，部分原因在于纳米粒子自组装过程中存在强烈的动力学陷阱。本文讨论了用于构建PCMs的聚合物选择标准，并提供了基于盐退火的实验方案，可实现可重复、低多分散性的纳米粒子组装。我们还介绍了利用光散射、小角X射线散射和电子显微镜对PCMs进行表征的方法。

为了说明上述表征方法，我们展示了由不同长度和化学组成的寡核苷酸与嵌段共聚物组装而成的 PCM 的典型结果（图 1）。图 2 示例展示了 PCM 核心尺寸（由 SAXS 和 TEM 测定，图 4 和 图 5）随带电嵌段长度变化的情况。图 3 显示了由相对较长的嵌段共聚物与较短的单链寡核苷酸形成的球形 PCM 的 DLS 数据及其拟合结果。图 4 说明了如何通过结合多种空间相关性模型（外表面、核内散射、螺旋间有序排列）准确拟合复杂的 SAXS 强度谱，并展示了如何利用 MALS 将散射测量扩展到更长的尺度范围。最后，图 5 展示了不同形貌 PCM 的代表性电子显微镜数据。
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我们提供了设计、组装和表征聚电解质复合胶束的实验方案及代表性数据，这类核-壳纳米颗粒由聚电解质与亲水性带电-不带电嵌段共聚物形成。

聚电解质复合胶束（PCMs）是由带电聚合物在水溶液中自组装形成的核-壳纳米颗粒，提供了一种强大的……

本方法详细描述了聚电解质复合胶束的设计、组装及表征全过程。聚电解质复合胶束是一类由带相反电荷的聚合物通过自组装形成的纳米颗粒。聚电解质自组装面临的主要挑战包括避免动力学陷阱以及对纳米颗粒进行有效表征。我们所介绍的盐退火技术可实现胶束的可重复组装，并获得尺寸和形貌分散性均较低的纳米颗粒。本文还介绍了包括光散射、小角X射线散射和电子显微镜在内的多种表征方法。递送治疗性核酸是纳米医学领域长期存在的挑战。这些聚电解质复合胶束利用核酸的强负电荷，将其包裹在胶束核心内，而中性聚合物冠层可保护核酸免受核酸酶降解和免疫反应的影响。该组装方法应适用于任何类型的带电聚合物。我们已使用多种聚阴离子和聚阳离子对它们进行了测试，该表征方法应适用于所有自组装纳米颗粒，包括表面活性剂纳米颗粒及其他由疏水作用驱动的体系。首先将寡核苷酸溶液在70摄氏度下孵育5分钟。孵育结束后，在室温下冷却15分钟，以对核酸进行热退火，然后加入40 µL浓度为20 mM带电荷的嵌段共聚物。立即涡旋震荡溶液，并在室温下孵育5分钟。进行盐退火时，向寡核苷酸溶液中加入氯化钠溶液，使其终浓度为1摩尔，并以最大速度涡旋震荡10秒。室温孵育混合物10分钟，然后将其加载至透析盒中。上样前，使用永久性记号笔标记 cartridge，并将其在缓冲液中浸泡至少两分钟，以充分水化膜。通过逆时针旋转取下帽盖，使用加样枪头将样品加入。轻轻挤压膜以排出多余空气，然后重新盖上帽盖。将 cartridge 置于含有 1X PBS 0.5 摩尔氯化钠的透析液中，确保其漂浮且两侧膜均暴露于透析液中。24 小时后，将 cartridge 转移至 1X PBS 中，再浸泡 24 小时。最后一次透析完成后，从透析液中取出 cartridge，打开盖子，并使用加样枪头吸取样品以回收样本。将样品放入干净的1.5毫升微量离心管中，冷藏保存至准备使用。根据论文中的说明，在DLS仪器中制备样品，然后至少采集一分钟的数据，确保在整个采集时间内计数率保持恒定。检查自相关数据。长时间基线应平坦，自相关曲线应平滑且散射最小。通过采集更多数据可改善数据中的噪声。要使用 Irena 进行数据降减和分析，请首先导入胶束的背景数据集。将样品和背景数据一同在双对数坐标系中作图，计算样品与背景的比值，并验证高 Q 区域的渐近行为。在此 Q 范围内计算平均比值，并使用数据处理宏命令将背景乘以该比值进行缩放。然后将扣除背景后的信号对 Q 作图，并以新文件名保存数据，注意不要覆盖原始数据。打开建模宏，然后加载并绘制扣除背景后的数据。为了获得聚电解质复合胶束（PCM）外表面的近似模型，在数据控制中选择流动至中等Q范围，确保包含存在的振荡。在模型控制中，选择第一个散射群体，并确保它是唯一正在使用的群体。为模型选择尺寸分布，选择所需的分布类型，并选定形状因子。本示例采用柔性圆柱体，需在用户自定义形状因子中手动添加。下载并添加柔性圆柱体的形状因子，然后输入参数一和参数二对应的函数名称及初始值，分别对应圆柱体的长度和库恩长度。这些圆柱体的长度超过了SAXS可分辨的范围，因此将圆柱体长度参数固定为一个较大的值。通过在尺度、平均尺寸和宽度字段中输入数值，设置搜索的初始参数。然后点击“计算模型”以绘制出相应的形貌因子。找到合理的参数后，单击“拟合模型”以对数据进行非线性最小二乘拟合。接下来，对相变材料核心内单个聚合物的散射进行建模。调整数据控件，选择出现额外散射的 Q 范围，该范围通常位于中等到较高区间。添加第二个散射群体，并确保它是唯一正在使用的群体。为模型选择统一层级，调整GDA参数G和RG，以确保模型不会在低Q值区域预测过强的散射，然后使用光标间拟合PB宏功能获得这些参数的初始估计值。对于形状因子，对统一层级模型进行非线性拟合。如果存在衍射峰，则在感兴趣的 Q 范围内为衍射峰添加第三个模型。在获得各个散射组分的近似拟合值后，同时开启全部三个模型，并优化整体拟合结果。最后，检查每个参数值是否保持在合理的物理范围内，并通过选择“存储到文件夹”来保存拟合结果。该实验步骤的结果应得到一个复合模型，能够很好地描述大尺度范围内的小角X射线散射数据。本方案用于设计、组装和表征核酸聚电解质复合胶束（PCMs）。胶束核心的尺寸主要由嵌段共聚物中带电嵌段的长度决定，而基本不受均聚物长度的影响。通过动态光散射技术获得了由相对较长的嵌段共聚物与短单链寡核苷酸形成的球形 PCM 的数据。自相关函数以单一时间尺度衰减至一个平坦值，从而在反演拉普拉斯尺寸分布（repIS 尺寸分布）中产生单一的粒径峰。复杂的小角 X 射线散射（SAXS）强度谱可以通过结合多种空间相关模型进行精确拟合，而多角度光散射可用于将散射测量扩展到更长的长度尺度。具有不同形貌的PCM也可通过电子显微镜成像，以验证其核半径和形状是否与SAXS数据拟合所得的数值一致。在拟合SAXS数据时，重要的是要考虑到每一个散射特征，并结合透射电子显微镜（TEM）等互补方法，以确保所使用的形貌因子是正确的。

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