Name: 心脏靶向肽转导效率的活体成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: 学习利用荧光成像技术评估细胞穿透肽在CD1小鼠模型中的心脏靶向转导效率。该方法通过活体与离体成像结合组织学分析，实现单只动物的多维度数据采集，显著减少实验动物使用量并提高研究效率。

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M.Z. 和 K.S.F. 获得美国心脏协会科学家发展奖（17SDG33411180）以及匹兹堡大学临床与转化科学研究所通过匹兹堡创新挑战赛（PInCh®）授予的资助。

在开展本出版物中所述的任何动物实验之前，匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会已批准本研究中所有指定的动物实验方案。
注意：本实验方案详细介绍了如何利用离体光学荧光成像进行离体生物分布研究，随后通过将器官包埋于石蜡中、切片并进行荧光显微镜观察，以开展体内生物分布研究。尽管本方案以CTP为例，但该方法可适用于任何荧光标记的细胞穿透肽（CPP）。
1. 体内成像
<ol>
	<li>采用固相合成技术9,10，由使用L-氨基酸的多肽合成机构合成CTP，其N端标记Cy5.5，C端酰胺封端以提高稳定性。 
	注意：所有合成的CPPs在使用前应通过高效液相色谱（HPLC）和/或基质辅助激光解吸/电离（MALDI）进行表征11。</li>
	<li>用二甲基亚砜（DMSO）配制1 mM或10 mM的CTP储备液，分装后于-80 °C避光保存。 
	注意：多肽以冻干粉末形式递送。冻干粉末可在-20 °C避光及防潮条件下长期储存（6个月至2年）。若在DMSO中分装储存，应避免反复冻融。</li>
	<li>称重并使用氯胺酮/赛拉嗪溶液（氯胺酮100 mg/kg，赛拉嗪20 mg/kg），按每克组织重量2 µL的剂量，通过肌内注射（后腿）或腹腔注射（左下腹）对6周龄CD1雌性小鼠进行麻醉。 
	注意：氯胺酮/赛拉嗪溶液应在使用当天新鲜配制。未使用的氯胺酮/赛拉嗪应按规定妥善处置，并在记录本中记录使用量与废弃量，因为氯胺酮属于管制药品。麻醉效果通常在5−7分钟内达到，通过脚趾夹捏无反应来评估。</li>
	<li>计算Cy5.5-CTP的剂量为10 mg/kg，用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释至不超过200 µL，使用胰岛素注射器通过眼后静脉或尾静脉注射（图1A）。</li>
	<li>让多肽在体内循环预设的时间，时间为15分钟至6小时不等。</li>
	<li>根据机构动物护理与使用委员会（IACUC）规定，采用高浓度CO2吸入法处死小鼠，并用剪刀打开胸腔（图1B）。</li>
	<li>用剪刀在右心房侧壁自由缘处剪一小口，使用26 G针头注入3 mL 10%磷酸缓冲福尔马林，以同时实现灌注固定小鼠器官和清除红细胞的目的（图1C）。</li>
	<li>解剖取出心脏、肺、肝、肾、脾、大肠、小肠、膀胱、卵巢/睾丸和脑组织，分别放入12孔板的各个孔中，用于离体光学成像（图1D）。</li>
	<li>启动图像采集软件，点击初始化按钮以准备系统进行样本成像。打开成像向导，选择荧光模式，然后选择滤光片组合，再从染料列表中选择Cy5.5染料，以应用580 nm激发和620 nm发射滤光片。选择手动设置曝光参数，将载物台位置设为B，曝光时间设为1秒，F/stop设为8，binning设为小。 
	注意：激发和发射滤光片的选择取决于所用标记物。可手动输入所用标记物的激发和发射波长，使软件自动分配相应的滤光片。确保计数值在600–60,000之间，以避免信号饱和。根据所用系统不同，可能提供自动采集优化功能。若系统具备补偿功能可用于比较不同设置下获取的图像，则可使用自动设置；若无补偿功能，则需确定、保存并一致地在所有样本中使用相同设置。</li>
	<li>当系统完全初始化后，将感兴趣的器官按需排列于12孔板中，并将其放入光学成像室，确保样本按期望方式排列。选择“采集”，然后选择图像保存位置。有关小鼠的信息可填写至弹出的“编辑图像标签”窗口中。</li>
	<li>成像完成后，将样本从成像室中取出，置于闪烁瓶中，加入至少为组织体积20倍的10%磷酸缓冲福尔马林溶液，在室温（RT）下避光保存。</li>
	<li>将图像单位设为“辐射效率”进行定量分析，选择4×3 ROI网格，并调整使每个孔均匀对应ROI中的一个方格，然后点击“测量”。打开网格ROI测量标签页，选择“导出”，并将测量结果保存为.cvs文件。</li>
</ol>
2. 组织学
注意：按照步骤 1.1−1.8 获取不同器官。或者，可将已成像的相同器官立即置于福尔马林中，并按以下所述进行切片处理。
<ol>
	<li>将每个器官单独置于10%中性缓冲福尔马林磷酸盐溶液中，固定时间至少48小时，然后进行组织学处理。</li>
	<li>器官在固定48小时后，将其转移至组织处理与包埋盒中，并放入组织处理机（图1E）。</li>
	<li>设置组织处理机依次以70%乙醇脱水30分钟，80%乙醇30分钟，95%乙醇30分钟，95%乙醇30分钟，100%乙醇15分钟，100%乙醇20分钟，最后再用100%乙醇处理20分钟。</li>
	<li>用二甲苯透明处理2次，每次30分钟。</li>
	<li>将透明后的组织在60 °C条件下，用石蜡浸透4次，每次30分钟。</li>
	<li>使用金属模具进行石蜡包埋。将熔化的石蜡（保持在65 °C）注入模具中，然后转移至冷板上。当模具底部的石蜡开始凝固时，将器官放入石蜡中（图1F）。</li>
	<li>在模具上方放置一个标记好的包埋盒作为支撑，并用熔化的石蜡完全覆盖。冷却至完全凝固。随后将蜡块置于-20 °C冰箱中过夜，使石蜡进一步收缩，便于脱模。 
	注意：蜡块现在可在避光条件下室温保存。</li>
	<li>准备一个盛有蒸馏水的38 °C水浴。设置切片机刀片角度为6°，切片厚度为10 µm。</li>
	<li>将组织蜡块安装到切片机上，开始切片直至获得含组织的切片。然后将蜡块正面朝下放入水中5分钟，或直至组织吸收一定水分（例如，当蜡块中出现组织的浅白色轮廓时[图1G]）。 
	注意：应频繁更换刀片，以确保切片质量。</li>
	<li>将蜡块放置于平整的冰块上10分钟，然后以与步骤2.9相同的方向重新装回切片机。开始切片，并使连续切片形成每段包含6−10片的长带状切片。丢弃质量不佳的石蜡切片带，直至获得足够长度且质量良好的切片带，能够覆盖一张载玻片。通过调整切片速度、组织湿润程度和水浴温度，优化切片过程，避免组织切片发生剪切或皱褶。 
	注意：若切片中出现组织脱落形成的孔洞、撕裂或严重皱褶和折叠，应予以丢弃。</li>
	<li>使用钝头镊子小心夹取质量合格的切片带，使其漂浮于38 °C水浴表面。让切片在水面上自然展平，注意不要停留过久，以免石蜡溶解导致切片撕裂。</li>
	<li>将展平的切片转移至洁净的载玻片表面。将载玻片放入65 °C烘箱中30分钟，以熔化石蜡。 
	注意：这些载玻片可在避光条件下室温保存。</li>
	<li>用二甲苯脱蜡3次，每次10分钟。</li>
	<li>依次用100%乙醇水化5分钟，95%乙醇5分钟，70%乙醇5分钟，50%乙醇5分钟，最后用1×三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBS）冲洗5分钟（图1H）。让载玻片自然干燥过夜。 
	注意：只要避光保存，这些载玻片可长期在室温下储存。</li>
	<li>使用含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂125 µL封片，DAPI为一种核荧光探针（图1I）。封片后在室温下避光干燥过夜。 
	注意：干燥后的载玻片可长期在4 °C、避光条件下保存。</li>
	<li>使用荧光显微镜观察并成像。 
	注意：应避免图像过饱和，因为饱和图像无法用于定量分析。可通过降低曝光时间和增益设置来避免饱和。在比较样本时，应保持成像参数一致。注意控制曝光时间，避免组织荧光淬灭。</li>
</ol>

<ol><li>Green, M., Loewenstein, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+functional+domains+of+chemically+synthesized+human+immunodeficiency+virus+tat+trans-activator+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Autonomous functional domains of chemically synthesized human immunodeficiency virus tat trans-activator protein.</a> Cell. 55 (6), 1179-1188 (1988).</li>
<li>Frankel, A. D., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+uptake+of+the+tat+protein+from+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus.</a> Cell. 55 (6), 1189-1193 (1988).</li>
<li>Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+helix+of+the+Antennapedia+homeodomain+translocates+through+biological+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (14), 10444-10450 (1994).</li>
<li>Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+transduction%3A+delivery+of+a+biologically+active+protein+into+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse.</a> Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).</li>
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<li>Leblond, F., Davis, S. C., Valdes, P. A., Pogue, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-clinical+whole-body+fluorescence+imaging%3A+Review+of+instruments%2C+methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Pre-clinical whole-body fluorescence imaging: Review of instruments, methods and applications.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology. 98 (1), 77-94 (2010).</li>
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<li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 185 (7), 1135-1148 (2009).</li>
</ol>

M.Z. 和 Paul D. Robbins（美国明尼苏达州明尼苏达大学）拥有一项关于心脏靶向肽作为心脏载体的专利（心脏特异性蛋白靶向结构域，美国专利号 9,249,184）。M.Z. 还担任初创公司 Vivasc Therapeutics Inc. 的首席科学官和董事会成员，并持有该公司大量未来股权。

动物模型在临床前药物开发的各个阶段都至关重要，从新型细胞穿透肽（CPP）的鉴定、生物分布研究、转导机制探讨，到最终利用这些新型CPP作为载体递送货物并测试其功效。目前有多种常用方法可用于评估生物分布，例如组织学、核医学成像（SPECT和PET）以及活体光学成像12。由于小型动物SPECT和PET设备的可及性有限，且放射性标记药物偶联物的制备需要放射化学专家的技术支持，核成像方法可能较为繁琐。相比之下，荧光标记操作更为简便，且成本较低。本文所述方案允许多种方法快速分析生物分布。离体全器官荧光光学成像可实现不同组织和处理组之间荧光信号的即时比较，能够以半定量方式确定器官摄取情况及目标器官达到峰值摄取的时间。定量组织学分析需要对组织进行更为复杂的处理、切片、成像和数据分析，但可提供更详细的微观信息，是当前的标准技术之一。值得注意的是，由于不同器官在不同激发波长下所表现出的自发荧光在两种技术之间存在显著差异，因此无法在这两种技术之间进行直接的定量比较。
本方案的一个重要部分是为候选 CPP 实验选择合适的荧光染料进行标记。一个潜在的问题是光谱重叠，当需要使用多种荧光染料时，这可能带来干扰。DAPI 荧光封片剂与 Cy5.5 的光谱不重叠。然而，在某些需要多种荧光染料的应用中，必须仔细考虑光谱重叠的风险。根据所用系统的不同，荧光染料的选择可能受到限制。因此，了解系统的性能至关重要。由于较短波长在组织中具有较高的吸收率，荧光光学系统最好使用远红光或近红外荧光染料13。增强型绿色荧光蛋白（EGFP）范围内的荧光染料存在明显局限性，因其激发波长在脑和肝组织中会产生显著的组织自发荧光。根据实验条件的不同，某些荧光染料应尽量避免使用。一些水溶性有机荧光染料与脂双层有较强的相互作用，可能导致假阳性结果。因此，建议采取措施确定荧光染料是否对目标组织具有强亲和力14。另一个需要考虑的因素是选择合适的荧光染料偶联方法，这可能是影响实验结果的重要参数。可通过肽链 N-末端与染料（如 Cy5.5-NHS）的羧基之间形成共价键，将 CPP 在 N-末端或 C-末端进行荧光标记。需格外注意，大多数 CPP 的转导机制尚未完全阐明，而在一端进行偶联可能比另一端更显著地影响其摄取机制。另一种标记 CPP 的方法是通过在 N-末端进行生物素化，进而与荧光标记的链霉亲和素偶联。该策略的优势在于可使用不同荧光标记的链霉亲和素偶联物。然而，该策略的一个潜在局限是生物素-链霉亲和素复合物体积较大，可能干扰转导过程。
荧光光学成像系统是一种高效比较不同器官和处理条件下荧光信号的有效策略，但无法提供组织中荧光物质绝对浓度的定量测量。这主要是由于组织内部的光散射效应所致，而组织在大小、密度、血管分布上的天然差异以及荧光散射的可变性进一步加剧了这一问题。此外，组织自发荧光也可能产生影响，其来源包括胶原蛋白等天然存在的生化物质，或食物中的叶绿素等饮食来源13。
组织学是最常用的生物分布检测方法，可潜在用于准确测量和比较不同组织在不同时间点的摄取情况。该方法通过将所有组织切片制成相同厚度，避免了光散射问题15。此方法的一个主要优势在于切片后可额外添加荧光标记进行免疫组织化学分析。尽管增加另一种荧光染料可能使成像更加困难，但使用荧光标记有助于定位穿膜肽（CPP）在特定细胞内区室（如溶酶体或线粒体）中的分布。在共聚焦显微镜实验中，可利用抗体检测转导后的候选穿膜肽是否与目标结构共定位，从而评估该穿膜肽作为递送载体的潜力。该方法的一个局限性在于，从器官样本制备切片的过程可能耗时较长、劳动强度大，且容易引入人为误差12,15。在对切片进行成像时，应注意避免对同一位置长时间照射，以防止光漂白。根据荧光染料的敏感性，一定程度的光漂白难以完全避免。在整个实验流程的每一步中，均应采取措施保护样本免受环境光影响，并妥善保存16。我们建议将切片在 4 °C、避光条件下保存，以供后续成像使用。
目前有多种可用于测定候选细胞穿透肽（CPP）生物分布的方法，这些方法需要专用设备，虽然能够产生可比的结果，但可能需要更复杂的CPP标记。本文所述的方案采用两种兼容的方法，能够在活体系统中高效地获取生物分布数据，同时允许从同一样本中获得关于肽段在细胞内化过程的更深入信息，从而将研究所需的动物数量减少一半。这些方法被用于生成上述数据，结果表明，两种方法可在同一只动物中依次使用，并展示了各自所产生的数据质量。我们的结果还凸显了这两种技术之间在定量层面无法直接进行结果关联的问题。

细胞质膜是一种半透性屏障，对维持细胞完整性和存活至关重要，其功能是通过调控物质进入细胞来调节细胞内部环境。尽管质膜对细胞存活至关重要，但它同时也构成了向细胞递送物质的障碍。1988年，人类免疫缺陷病毒的转录反式激活因子（Tat）蛋白被发现能够进入培养细胞并促进病毒基因表达1,2，介导这一转导功能的结构域被限定在第三个α螺旋中一段富含精氨酸和赖氨酸的13个氨基酸区域3。因此，这类分子被命名为细胞穿透肽（CPPs）。随后的研究进一步表明，Tat肽能够携带功能性β-半乳糖苷酶进入多种细胞类型4。自首次报道以来，已发现的细胞穿透肽数量显著增加。这些转导结构域是天然存在或人工合成的短肽，通常由6−20个氨基酸组成，能够携带功能性分子有效穿过细胞膜。这些被携带的分子可包括其他小肽、全长蛋白质、核酸、纳米颗粒、病毒颗粒、荧光分子以及放射性同位素5。早期发现的CPPs并不具有细胞特异性，例如Tat可被多种细胞摄取，甚至能够穿越血脑屏障4，因而限制了其治疗应用潜力。为了筛选具有细胞特异性的CPPs，研究人员采用噬菌体展示技术，利用大型商业化噬菌体文库进行筛选6。我们团队通过组合使用体外和体内噬菌体展示方法，鉴定出一种名为心脏靶向肽（CTP）的CPP7，这是一种由12个氨基酸组成的非天然肽段（NH2-APWHLSSQYSRT-COOH），在经外周静脉注射后15分钟内对心脏组织的摄取达到峰值8。通过与肌动蛋白（一种细胞内标志物）进行免疫荧光共定位，并排除层粘连蛋白（一种细胞膜标志物）的信号，我们证实CTP在静脉注射后可被小鼠心肌细胞内化7。此外，我们将双标记的CTP与人诱导多能干细胞来源的跳动心肌细胞共孵育，该CTP的C端标记6-羧基荧光素，N端通过酯键连接罗丹明，而该酯键仅可被细胞内酯酶裂解。共聚焦显微镜观察显示，在孵育15分钟内，罗丹明信号迅速在跳动的心肌细胞中积累8。
本文介绍了两种互补的方法，可用于追踪穿膜肽（CPP）的生物分布并验证其在组织中的特异性内化，以CTP为例进行说明。在这些方法中，CTP被合成，并在其N端用氰胺5.5（CY5.5）进行荧光标记，C端则进行酰胺封端以提高肽的稳定性。所采用的两种方法分别为活体荧光光学成像系统和组织切片的荧光显微镜观察。这两种方法在研究荧光标记穿膜肽的生物分布、摄取和清除方面都非常有用。与单光子发射计算机断层扫描（SPECT）或正电子发射断层扫描（PET）等其他方法相比，使用这些方法评估生物分布的优势在于无需耗时的放射性标记过程，而荧光标记相对简便，且在所有肽合成机构中均为常规操作。活体成像可快速获得在活体系统背景下的生物分布数据，而组织切片则通过保留形态学细节，提供关于肽在细胞内的摄取和定位的更深入信息。本方案可广泛应用于多种器官和组织，如心脏、肺、肝、肾、脑、脾、胃、大肠、小肠、骨骼肌、骨、睾丸/卵巢以及眼睛。

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<table><tbody><tr><td>10% 磷酸盐缓冲福尔马林</td><td>ThermoFisher</td><td>SF100-4</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris 缓冲盐溶液（TBS）</td><td>ThermoFisher</td><td>BP2471-1</td><td></td></tr><tr><td>12 孔细胞培养板</td><td>ThermoFisher</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>1x TBS 溶液</td><td></td><td></td><td>将 10x TBS 用去离子水按 1:10 稀释。该溶液可在室温下保存。</td></tr><tr><td>20 mL 闪烁瓶</td><td>Wheaton</td><td>334173</td><td></td></tr><tr><td>26G 针头</td><td>Becton Dickinson</td><td>305110</td><td></td></tr><tr><td>28G 0.5 mL 胰岛素注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>3 mL 注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>CD1 小鼠</td><td>Charles River</td><td>022</td><td>6 至 12 周龄白色雌性小鼠</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>ThermoFisher</td><td>12-544-14</td><td></td></tr><tr><td>Cy5.5-CTP-酰胺</td><td></td><td></td><td>通过多肽合成制备，与 Cy5.5 荧光染料偶联，并通过 HPLC 纯化。冻干粉末用 DMSO 重悬至 10 mM 浓度。重悬后，于 -80 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>Dapi Fluoromount G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>99150-20</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>超精细 Bonn 剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>盐酸氯胺酮 100 mg/mL</td><td>KetaVed</td><td>NDC 50989-161-06</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮/赛拉嗪溶液</td><td></td><td></td><td>将盐酸氯胺酮与赛拉嗪按 1:1 混合，配制成含 50 mg/mL 氯胺酮和 10 mg/mL 赛拉嗪的储备液。该溶液需在每次使用前新鲜配制。</td></tr><tr><td>Leica RM2235 旋转式切片机</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>ThermoFisher</td><td>B9992000TN</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast X-TRA</td><td>Sigma</td><td>P3808-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Perkin Elmer Lumina S5 IVIS</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS148588</td><td></td></tr><tr><td>Sparkle 光学镜头清洁剂</td><td>ThermoFisher</td><td>NC0090079</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek 组织处理/包埋盒</td><td>ThermoFisher</td><td>NC9499605</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP 组织处理仪</td><td>Tissue-Tek</td><td>VIP 5A-F1</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪 20 mg/mL</td><td>AnaSed</td><td>NDC 59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>ThermoFisher</td><td>X5-4</td><td></td></tr></tbody></table>

体内成像评估心脏靶向肽的转导效率

In Vivo Imaging of Transduction Efficiencies of Cardiac Targeting Peptide

自从25年多前首次描述蛋白质转导结构域（也称为细胞穿透肽）以来，人们一直高度关注开发这类肽作为递送诊断和治疗物质的新型载体，尤其是具有细胞特异性的肽。我们以往利用噬菌体展示技术的研究发现了一种新颖的、非天然存在的、由12个氨基酸组成的肽，由于该肽在体内能够转导正常心肌组织，并且在静脉注射后仅15分钟即可观察到最高摄取水平，因此我们将其命名为心脏靶向肽（CTP）。我们通过注射带有荧光染料Cy5.5标记的CTP，使其在体内循环不同时间后，对实验动物实施安乐死，随后固定并切片多个器官，再结合荧光显微镜成像，开展了详细的生物分布研究。在本论文中，我们详细描述了这些实验流程，以及使用活体成像系统对离体器官进行的离体成像方法。我们以CTP为例，提供了开展转导实验及生物分布研究的详细方法与操作规范。

采用本方案，我们通过眶后注射的方式，对三只小鼠给予每公斤体重10 mg剂量的Cy5.5-CTP（图1A）。在肽段循环15分钟后，使用CO2安乐死小鼠，通过胸骨正中切口打开胸腔，剪开右心房，并用3 mL 10%磷酸盐缓冲福尔马林对小鼠进行灌注固定（图1B,C）。固定后，取出心脏、肺、肝、肾、脾和脑组织，将其置于12孔板中，用于离体光学荧光成像（图1D 和 图2A）。另取三只未注射的对照小鼠，同样进行灌注、解剖和成像（图1B−D 和 图2B）。由于成像软件将荧光信号转换为辐射效率（即相对荧光单位），因此可对每组器官获得的荧光数据进行比较。该数据可用于生成各目标器官的定性图像和定量结果（图2C），以支持不同时间点的生物分布研究。不同器官在不同激发波长下的自发荧光情况如图3A−E所示。较短的激发波长（如增强型绿色荧光蛋白EGFP）引起的自发荧光较强，尤其在肝脏和脑组织中，明显高于远红光（Cy5.5）或近红外（Cy7）激发波长下的自发荧光水平（图3）。成像后的器官在室温下用10%磷酸盐缓冲福尔马林固定至少48小时，随后转移至组织处理与包埋盒中（图1E）。器官经组织处理机脱水和石蜡包埋，在充满石蜡的模具中定位后，置于-20 °C载物台上冷冻，并在-20 °C下过夜保存（图1F）。随后对样本进行切片（图1G），并通过溶液置换处理使组织复水（图1H）。制备好的切片使用DAPI荧光封片剂封片（图1I）。通常在室温下干燥过夜后，使用荧光显微镜进行成像。图中展示了来自一只小鼠各器官的代表性图像（图4A）。不同器官的图像均采用相同的成像参数获取，以便在不同小鼠间进行比较和定量分析（图4B）。
<img alt="组织学工作流程：组织提取、固定、包埋、切片和玻片制备。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60895/60895fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 1"> 
图 1：用于离体光学荧光成像和切片的小鼠器官采集。 （A）通过眼后静脉注射 CTP-Cy5.5 的野生型小鼠。（B）解剖小鼠，打开胸腔并剪开右心房，用于灌注固定。（C）向心脏注入 3 mL 10% 磷酸盐缓冲福尔马林溶液，对动物进行灌注固定。（D）采集目标器官，并置于 12 孔板中进行荧光光学成像。（E）将心脏装入包埋盒，并使用组织处理机进行处理。（F）将心脏包埋于石蜡中。（G）在切片机上对心脏进行切片。（H）通过一系列溶液置换对玻片进行脱蜡处理。（I）使用 DAPI 封片剂将切片封固于载玻片上。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60895/60895fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="器官样本的荧光成像；辐射效率热图；比较柱状图数据。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60895/60895fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：经处理与对照组器官的代表性图像。 （A）接受 10 mg/kg CTP-Cy5.5 处理的小鼠的器官。（B）未处理对照组小鼠的器官。（C）各组器官荧光信号的定量分析。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60895/60895fig2v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="器官生物分布检测；辐射效率；荧光成像；突出显示肝脏、脑组织。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60895/60895fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3：在不同激发-发射波长下成像的未经处理小鼠器官，用于展示较长波长如何减少自发荧光。 （A）Cy7：740−790。（B）Cy5.5：660−710。（C）Cy5：620−670。（D）Cy3：520−570。（E）EGFP：480−520。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60895/60895fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="不同时间点器官中Cy5的荧光显微镜图像及强度柱状图；CTP与RAN对比" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60895/60895fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：小鼠静脉注射后心脏、肺、肝和肾的转导情况。 野生型小鼠注射10 mg/kg的Cy5.5-CTP或随机肽（RAN-Cy5.5）后，在指定时间点处死。（A）心脏组织的转导峰值出现在15分钟，随后荧光信号随时间推移逐渐减弱。肺部可见部分毛细血管摄取，肝脏转导显著，肾小球毛细血管也有明显转导，后者提示存在肾脏排泄机制。（B）荧光强度定量分析显示，CTP-Cy5.5在心脏中的摄取显著高于RAN-Cy5.5。比例尺 = 500 µm。本图改编自Zahid等人的研究8。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60895/60895fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的高清版本。</a>

我们描述了利用离体成像系统评估穿膜肽转导效率的实验方案，并以心脏靶向肽为例，后续结合石蜡包埋、切片及共聚焦荧光显微镜进行分析。在本方案中，单个实验动物可用于对相同器官进行两种类型的成像评估，从而将研究所需的动物数量减少一半。

自从25年多前首次描述蛋白质转导结构域（也称为细胞穿透肽）以来，该领域一直受到广泛关注……

本实验方案使我们能够通过两种独立但互补的方法来追踪生物分布，并确认目标肽在组织中的特异性内化。利用该方案，我们可以最大化单只动物所获取的数据，并获得定量的轴向荧光成像数据。此外，我们还可获取定性的显微镜图像。从多肽合成机构获得固相合成的C端酰胺封端、N端标记Cy5.5的CTP后，用二甲基亚砜配制浓度为1毫摩尔或10毫摩尔的CTP储备液，分装后于-80摄氏度避光保存。实验当天，将Cy5.5标记的CTP以每千克体重10毫克的剂量溶于200微升磷酸盐缓冲液（PBS）中，装入胰岛素注射器。称量小鼠体重后，将肽段通过静脉注射给予麻醉后的6周龄雌性CD1小鼠。让肽在体内循环至预设的实验时间后，使用高流量CO2安乐死小鼠，用剪刀打开胸腔，并在右心房侧壁自由缘处剪一小口。使用配备26号针头的5毫升注射器，经左心室心尖部灌注3毫升10%磷酸盐缓冲福尔马林，以固定组织并清除红细胞。随后将心脏、肺、肝、肾、脾、大肠、小肠、膀胱、卵巢或睾丸以及脑组织分别收集至12孔板的各个孔中，用于离体光学成像。对于CTP转导图像的活体成像，启动图像采集软件并点击“初始化”以准备成像系统。打开成像向导，选择“荧光”和“滤光片组合”。点击“名称”、“染料”、“氰化物”和“Cy5”以设置激发和发射参数。然后单击“手动设置”，将曝光时间设为1秒，像素合并设为小，光圈值（F/Stop）设为8，视野设为15厘米。单击“采集”并设置用于保存样本的文件夹。在“编辑图像标签”窗口中添加相应的实验信息，然后单击“确定”。采集的图像将显示出来。将单位设置为辐射效率。双击图像，然后点击“校正”和“自适应荧光背景扣除”。调整阈值，使紫色仅覆盖目标器官。或者，右键单击并选择裁剪区域，绘制一个包含所有目标样本的方框。当所有图像采集完成后，将样本转移至含有10%磷酸盐缓冲福尔马林的闪烁小瓶中，液体体积至少为组织体积的20倍，并将组织在室温下避光保存至少48小时。为定量分析图像，将单位设置为辐射效率，将感兴趣区域设置为四乘三。调整感兴趣区域框，使其均匀覆盖所有孔，然后单击“测量感兴趣区域”。接着单击“网格化感兴趣区域测量”以匹配感兴趣区域的各个单元格，再单击“导出”按钮，将数据保存为文本文件或CSV文件。当器官在至少48小时后充分固定时，将样品转移至组织处理与包埋盒中，并将包埋盒放入组织处理机中进行后续处理。按照说明，将组织处理器设置为使用乙醇对组织进行脱水，随后用二甲苯处理两次，每次30分钟，以进行透明化处理，再通过四次30分钟的石蜡处理进行石蜡浸润。最后一次石蜡处理完成后，从组织处理机中取出组织。将组织分别放入金属模具中，并在每个模具内衬以熔融的石蜡。将模具置于冷板上。当模具底部的石蜡开始凝固时，将器官放入石蜡中。待所有器官放置完毕后，在模具上方放置一个带有标签的包埋盒作为支撑，并用熔融石蜡完全填满模具。将石蜡冷却至完全凝固，然后将组织块于零下20摄氏度保存过夜。次日早晨，设置切片机的刀片角度为6度，切片厚度为10 µm，并将组织块安装至切片机上。开始切片，直至获得含组织的切片，随后将组织块切面朝下置于38摄氏度的蒸馏水浴中5分钟，或直至组织吸收一定水分。当组织块中出现细的白色组织轮廓时，将组织置于平坦的冰块上冷却10分钟，然后以与之前装入时相同的方向放回切片机中。开始切片，使截断的切片形成每段包含6至10个切片的长条状连续切片带。为确保成功获取组织切片，请保持组织块湿润。若切片质量较差或开始下降，将组织块放回冰上。丢弃质量不佳的石蜡带，直至获得足够长度且质量良好的切片带，能够覆盖载玻片。使用钝边工具将优质切片转移至38摄氏度水浴中，让切片漂浮在蒸馏水表面，直至其完全展平。将展平的切片漂浮于洁净载玻片表面，并在65°C烘箱中熔蜡30分钟。为脱蜡，将样本用二甲苯处理三次，每次10分钟。最后一次二甲苯处理后，按所示步骤用梯度乙醇进行5分钟的逐级水化，最后在Tris缓冲盐水中浸泡5分钟。将载玻片室温避光过夜干燥后，用盖玻片和125微升含DAPI的封片剂封片，并在避光条件下继续过夜干燥，随后进行荧光显微镜成像。固定后，将实验组和对照组动物的心脏、肺、肝、肾、脾和脑组织置于12孔板中，用于离体光学荧光成像。将信号值转换为辐射效率后，可对每组器官的荧光数据进行定量分析。需要注意的是，不同器官在不同激发波长下表现出不同程度的自发荧光。与远红光或近红外激发波长相比，较短的激发波长（如增强型绿色荧光蛋白对应的波长）在肝脏和脑组织中通常伴随更高水平的自发荧光。对各器官组织切片进行福尔马林固定和石蜡包埋，可实现对目标细胞标志物的免疫荧光化学分析，并可在每种组织内定量分析目标免疫细胞或基质细胞的数量。调整成像参数以避免信号饱和，并记录所用参数设置，然后在同一批实验的其他样本中应用相同的采集参数，以确保一致性和准确性。如果候选的细胞穿透肽与特定结构或目的蛋白发生共定位，也可对组织切片进行免疫组织化学染色。

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