利用驱动蛋白运动分析法构建多组分脂质纳米管网络

本方案可简单地大规模生成脂质纳米管网络，其中单个纳米管表现出与母体囊泡相似的相分离行为。该方法的关键优势在于，我们利用分子马达所做的功，以高度并行且无需人为干预的方式实现脂质纳米管的自组装。建立滑动运动实验时，首先将三组双面胶条粘附在载玻片上，每组间隔五毫米。

轻轻将盖玻片压在胶带上，并向已制备的流动池中加入 30 微升浓度为 1 微摩尔的驱动蛋白溶液。五分钟后，向流动池中加入 30 微升浓度为 10 微克/毫升的微管溶液，同时轻轻将实验室擦拭纸贴在流动通道的另一端，以促进溶液置换。再经过五分钟孵育后，每次用 50 微升室温运动缓冲液洗涤流动池一次，重复洗涤一至三次，随后向流动池中加入 30 微升浓度为 10 微克/毫升的链霉亲和素溶液。

10分钟后，加入30微升10X GUV溶液，在室温下孵育30分钟。然后加入2微升100毫摩尔的AMP-PNP溶液，并用封片剂封闭样品室。将流动室转移至倒置显微镜进行成像，并选择合适的滤光片组。

使用100倍油镜先对盖玻片表面进行调焦，然后采集目标网络的图像。接着在ImageJ中打开图像，点击图像、颜色和复合，以叠加红色和绿色通道，生成复合图像。成像后，打开目标图像，点击分析并设置比例尺，以校准显微镜的比例尺。

输入像素到微米的转换系数，然后点击“确定”。使用多点线工具从母体GUV开始追踪纳米管，并按住 Control 和 M 键测量其长度。图像处理工具会将每次新测量的结果保存在结果窗口中。当所有管状结构均测量完毕后，选择“图像”、“调整”、“阈值”，然后点击“应用”以应用阈值。

然后，在目标管上绘制一个已知长度的矩形。为测量该区域的积分密度，点击“分析”并选择“测量”。为了确定脂质在液体纳米管节点中的分布情况，使用线条工具在感兴趣的节点上画一条线，并分别在绿色和红色通道中测量该节点的强度。在此代表性分析中，如所示构建了液体纳米管网络，以形成液体无序相和有序相，以及相分离的囊泡。

例如，由45%饱和脂质和55%不饱和脂质合成的囊泡会分离成共存的液态无序相和固相。然而，如果加入胆固醇，则可观察到液-液共存现象，形成分离成共存的液态有序相和液态无序相的GUVs。此外，在相分离的混合物中还可观察到节点结构。

最重要的是选择合适的曝光时间和中性密度滤光片组，以便在不发生荧光染料光漂白的情况下观察到脂质纳米管。通过调控脂质纳米管的组成及其相变行为，我们可以利用一个简化的模型系统，开始研究连接细胞之间的隧道纳米管的生物物理学特性。