Name: 使用滑动运动蛋白运动度测定法制造多组分脂质纳米管网络 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: 学习利用滑动运动蛋白运动度测定法制造多组分脂质纳米管网络。该方法借助分子马达实现脂质纳米管的高效自组装，无需人工干预，可研究膜动力学与相分离行为。

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本工作由美国能源部基础能源科学办公室材料科学与工程部（BES-MSE）提供支持。驱动蛋白的合成和荧光显微镜实验是通过位于美国能源部（DOE）科学办公室下属的科学用户设施——集成纳米技术中心的一个用户项目（ZIM）完成的。

1. 微管蛋白储备溶液的制备
注意：在整个实验过程中，应始终佩戴安全护目镜、手套和实验服。
<ol>
	<li>配制 5x BRB80 缓冲液：将 24.19 g PIPES（哌嗪-N,N′-双[2-乙磺酸]）和 0.38 g EGTA（乙二醇双[β-氨基乙醚]四乙酸）加入 1 L 玻璃瓶中。加入 1 mL 1 M MgCl2，用 KOH 调节 pH 至 6.9，再加入去离子水定容至 500 mL。</li>
	<li>配制 100 mM GTP 储存液：称取 52 mg GTP，溶于 1 mL 蒸馏水中。将 100 mM 溶液分装为每份 20 µL，于 -20 °C 保存。</li>
	<li>配制 GPEM 溶液：取 200 µL 5x BRB80、10 µL 100 mM GTP 溶液、100 µL 100% 甘油和 600 µL 去离子水混合。将 GPEM 溶液分装为每份 100 µL，于 -20 °C 保存。</li>
	<li>通过将市售的冻干微管蛋白小瓶（分别含生物素标记、荧光标记和未标记微管蛋白各一瓶）用预冷（4 °C）的 GPEM 溶液重悬，配制微管溶液，使其储存浓度为 5 mg/mL。</li>
	<li>通过混合 4 µL 生物素标记微管蛋白、4 µL 荧光标记微管蛋白和 24 µL 未标记微管蛋白（浓度均为 5 mg/mL），以 1:1:6 的比例在终体积 32 mL 中进行微管聚合。将混合物置于冰上。将微管蛋白混合液分装为每份 2 µL，于 -80 °C 保存备用。 
	注意：高效的聚合反应要求微管蛋白浓度等于或高于临界浓度（5 mg/mL）14。此处选择的微管蛋白比例经过优化，可确保生物素化微管蛋白的浓度足以高效结合链霉亲和素和 GUVs，同时荧光标记微管蛋白的浓度也足以满足显微镜表征的需求。</li>
</ol>
2. 巨单层囊泡（GUVs）的制备
<ol>
	<li>琼脂糖薄膜制备 
	注意：本方案改编自 Greene 等人15。
	<ol>
		<li>在 250 mL 锥形瓶中，将 1 g 琼脂糖溶于 100 mL 去离子水中，配制成 1% w/v 溶液。使用标准微波炉加热琼脂糖溶液 1–2 分钟。 
		注意：琼脂糖完全溶解后，溶液将变为半透明。使用前让溶液冷却至 65–75 °C。</li>
		<li>使用剪切过的 1,000 µL 移液枪头，将 300–400 µL 琼脂糖溶液转移至 25 mm × 25 mm 玻璃盖玻片上。用戴手套的手指夹住盖玻片边缘，再用另一支 1,000 µL 移液枪头将熔化的琼脂糖均匀涂布于整个盖玻片表面。 
		注意：保持琼脂糖温度在 65–75 °C 可使其在盖玻片表面更易均匀铺展。</li>
		<li>将涂有琼脂糖的盖玻片置于 37 °C 培养箱中干燥至少 2 小时，直至琼脂糖变为透明。将盖玻片琼脂糖涂层面向上放置于洁净表面（如无尘纸或石蜡膜）上，在室温（RT）下保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>脂质配方
	<ol>
		<li>从 -20 °C 冰箱中取出溶解于氯仿中的脂质，置于化学通风橱中，使其恢复至室温（RT）。</li>
		<li>使用以下公式计算配方中各组分脂质所需脂质储备液体积： 
		<img alt="脂质体积计算公式，V_lipid = mol% * n * M^-1，用于生化分析。" src="/files/ftp_upload/60899/60899eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"> 
		其中：Vlipid 为所用脂质体积，mol % 为脂质组分的摩尔百分比，n 为配方中脂质总摩尔数，M 为脂质储备液的摩尔浓度。 
		注意：例如，若配方中含有 45 mol% 的 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰胆碱（DOPC），其储备液浓度为 12.72 mM，配方中总脂质为 1 微摩尔，则所需 DOPC 储备液体积为： 
		<img alt="V&lt;sub&gt;lipid&lt;/sub&gt; 计算公式，以微升为单位的脂质体积科学公式。" src="/files/ftp_upload/60899/60899eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 2"></li>
		<li>在化学通风橱中，将各脂质按计算所得比例混合于玻璃小瓶中。</li>
		<li>将 30 µL 脂质溶液滴加至置于预热加热板（温度设定高于配方中饱和脂质组分的熔点，例如，若脂质的 Tm 为 40 °C，则加热板设为 50 °C）上的琼脂糖涂层盖玻片表面。</li>
		<li>使用 18 G 针头的长边以环形运动方式将溶液在琼脂糖薄膜上均匀涂布，直至氯仿完全挥发，形成均匀的脂质层。操作时用戴手套的手指夹住盖玻片边缘。 
		注意：操作时应小心避免针头损伤琼脂糖层。</li>
		<li>将带有琼脂糖层和脂质膜的盖玻片放入铝箔包裹的培养皿中，膜面朝上，并将培养皿置于真空干燥器中至少 2 小时，以去除残留溶剂。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在此期间，通过将 1.92 g 蔗糖溶于 10 mL 去离子水中，配制 560 mM 蔗糖溶液。 
	注意：蔗糖溶液的浓度取决于 GUVs 稀释所用缓冲液的渗透压。通常，蔗糖溶液的渗透压应比 GUVs 稀释所用缓冲液（特别是运动缓冲液，见步骤 3.11）高出不超过 10%。</li>
	<li>GUV 形成
	<ol>
		<li>将粘附腔室轻轻按压在脂质膜朝上的脂质涂层盖玻片上，使粘附腔室与盖玻片紧密贴合，形成密封。</li>
		<li>向腔室内加入 400 µL 560 mM 蔗糖溶液（按步骤 2.3 配制）。</li>
		<li>将盖玻片放入湿度 chamber 中，并盖上盖子。</li>
		<li>将湿度 chamber 置于预热的加热板上，加热板温度设定高于配方中饱和脂质组分的熔点。</li>
		<li>让囊泡形成至少 1 小时后再进行回收。 
		注意：可使用 40 倍空气物镜通过荧光显微镜观察囊泡形成情况。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 运动性检测用储备液与试剂的制备
<ol>
	<li>酪蛋白母液的制备
	<ol>
		<li>取3 g干燥酪蛋白加入50 mL圆锥形离心管中，加入30 mL 1× BRB80缓冲液，旋转混匀直至溶液变得黏稠。在15,000 × g 条件下离心30分钟。</li>
		<li>将上清液转移至另一支50 mL圆锥形离心管中，弃去沉淀。先用1 µm注射式滤器过滤溶液，收集滤液至50 mL圆锥形离心管中；再用0.2 µm滤器过滤，收集滤液至另一支50 mL圆锥形离心管中。</li>
		<li>使用紫外-可见分光光度计和石英比色皿，测定280 nm处的吸光度，以确定蛋白浓度。</li>
		<li>使用以下公式计算酪蛋白浓度（单位为mg/mL）： 
		<img alt="蛋白浓度公式，紫外-可见光谱分析，浓度测定方程" src="/files/ftp_upload/60899/60899eq3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="方程3"></li>
		<li>用1× BRB80缓冲液将溶液稀释至20 mg/mL，分装为100 µL每份，于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过将2 mg葡萄糖氧化酶与1 mL 1× BRB80缓冲液混合，配制2 mg/mL葡萄糖氧化酶母液。分装为100 µL每份，于-20 °C保存。</li>
	<li>通过将0.8 mg过氧化氢酶与1 mL 1× BRB80缓冲液混合，配制0.8 mg/mL过氧化氢酶母液。分装为100 µL每份，于-20 °C保存。</li>
	<li>将0.3 g D-葡萄糖悬浮于1 mL去离子水中，配制2 M葡萄糖溶液。分装为100 µL每份，于-20 °C保存。</li>
	<li>将0.015 g DTT溶于1 mL去离子水中，配制100 mM DTT母液。分装为100 µL每份，于-20 °C保存。</li>
	<li>将0.055 g二钠ATP溶于1 mL 100 mM MgCl2溶液中，配制100 mM Mg-ATP母液。分装为100 µL每份，于-20 °C保存。</li>
	<li>将0.055 g AMP-PNP溶于1 mL 100 mM MgCl2溶液中，配制100 mM Mg-AMP-PNP溶液，分装为100 µL每份，于-20 °C保存。</li>
	<li>将25.03 mg Trolox加入1 mL甲醇中，配制100 mM Trolox溶液，于-20 °C保存。</li>
	<li>将1 mg链霉亲和素加入100 µL BRB80缓冲液中，配制10 mg/mL链霉亲和素溶液，分装为2 µL每份，于-80 °C保存。</li>
	<li>将200 µL 5× BRB80、20 µL酪蛋白溶液、10 µL MgATP溶液、10 µL Trolox、5 µL紫杉醇溶液和765 µL去离子水混合，配制BRB90CAT缓冲液，于4 °C保存。</li>
	<li>将192 µL BRB80CAT缓冲液、2 µL D-葡萄糖溶液、2 µL葡萄糖氧化酶溶液、2 µL DTT溶液和2 µL过氧化氢酶溶液混合，配制运动缓冲液，于4 °C保存。</li>
	<li>用BRB80CAT缓冲液稀释浓缩的驱动蛋白母液，配制1 µM驱动蛋白溶液（例如，将2 µL 50 mM驱动蛋白溶液加入98 µL BRB80CAT缓冲液中），于4 °C保存。</li>
	<li>将10 µL稳定化微管加入90 µL室温BRB80CAT缓冲液中，稀释为10 µg/mL微管溶液，于室温保存。</li>
	<li>将0.1 µL 10 mg/mL链霉亲和素溶液加入99.9 µL运动缓冲液中，配制10 µg/mL链霉亲和素溶液，于4 °C保存。</li>
	<li>将5 µL GUV母液加入55 µL运动缓冲液中稀释，配制12× GUV溶液，于4 °C保存。</li>
	<li>微管蛋白聚合为微管
	<ol>
		<li>从-80 °C冰箱中取出先前制备的2 µL微管蛋白分装液（步骤1.5制备），置于37 °C水浴中孵育30分钟。</li>
		<li>将1.71 mg紫杉醇溶于1 mL无水DMSO中，配制2 mM紫杉醇溶液，分装为10 µL每份，于-20 °C保存。</li>
		<li>现配BRB80T缓冲液：将99.5 µL 1× BRB80与0.5 µL 2 mM紫杉醇混合。将100 µL BRB80T缓冲液在水浴中预热至37 °C。</li>
		<li>30分钟后，将100 µL预热的BRB80T缓冲液加入微管蛋白分装液中，以稳定微管。于室温保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 裸藻运动性检测（GMA）
<ol>
	<li>通过在载玻片上粘贴两条双面胶带，使两者间隔5 mm，制备一个流动室。重复此过程，直至每条胶带叠加至三层。</li>
	<li>将盖玻片置于胶带上方，然后用镊子或笔轻轻按压盖玻片与胶带的接触面，以确保充分粘合。 
	注意：通道尺寸应为宽5 mm、长25 mm、高300 mm。</li>
	<li>将30 µL的1 mm驱动蛋白溶液（按步骤3.12制备）用移液器加入流动室中，孵育5分钟。 
	注意：酪蛋白在盖玻片/载玻片表面形成双层结构，有助于驱动蛋白尾部与表面的结合。</li>
	<li>将30 µL的10 µg/mL微管蛋白溶液（按步骤3.13制备）用移液器加入流动室中，同时在流动通道的另一端轻轻按压实验室擦拭纸，以促进溶液置换。孵育5分钟。</li>
	<li>在室温下用1×运动缓冲液（按步骤3.11制备）清洗流动室1–3次。 
	注意：此时可使用40倍空气物镜进行荧光显微镜观察，以确认微管的结合与运动情况。微管呈现为长度达数十微米的荧光细丝，在表面以约0.5 μm/s的速度移动（滑行）（图1）。</li>
	<li>将30 µL的10 µg/mL链霉亲和素溶液（按步骤3.14制备）用移液器加入流动室中，同时在流动通道的另一端轻轻按压实验室擦拭纸，以促进溶液置换。孵育10分钟。</li>
	<li>将30 µL的12× GUV溶液（按步骤3.15制备）通过流动方式加入流动室中，同时在流动通道的另一端轻轻按压实验室擦拭纸，以促进溶液置换。孵育30分钟。</li>
	<li>加入2 µL的100 mM AMP-PNP溶液（按步骤3.7制备）以终止运动，随后用密封剂密封流动室。</li>
</ol>
5. LNT 网络表征
<ol>
	<li>将流动池转移至倒置显微镜下进行成像。</li>
	<li>根据所用荧光脂质或微管蛋白的波长选择合适的滤光片组。例如，当使用Texas Red标记的脂质时，采用560 nm/25 nm激发滤光片和607 nm/36 nm发射滤光片。</li>
	<li>使用100倍油镜聚焦到盖玻片表面。</li>
	<li>利用荧光显微镜对LNT网络进行成像。 
	注意：LNT是从较大囊泡延伸出的线性结构。LNT远小于GUV，且荧光信号较弱。因此，必须相应调整曝光时间和对比度以清晰成像LNT。这些调整可能导致GUV过度曝光，因此建议独立表征GUV的膜层数和相分离情况。</li>
	<li>将显微镜聚焦于感兴趣的网络区域，并采集标准图像或拼接图像。</li>
	<li>调整曝光时间及中性密度滤光片，以实现对LNT的成像并尽量减少GUV的饱和曝光。同时在红色和绿色通道中采集图像。 
	注意：此处红色通道用于观察Texas Red标记的脂质，绿色通道用于观察微管（例如Oregon Green标记的脂质和HiLyte488染料）。</li>
	<li>通过叠加红色和绿色通道生成复合图像（图1）。</li>
	<li>LNT网络的表征：测量LNT长度
	<ol>
		<li>使用ImageJ等图像分析软件打开所采集的图像。</li>
		<li>利用“设定标尺”功能对显微镜图像进行尺度校准，输入像素与毫米之间的换算系数，然后点击确定。 
		注意：该换算系数取决于显微镜、物镜和相机，可通过显微镜校准载玻片获得，通常以像素/毫米表示。</li>
		<li>使用多点直线工具从母体GUV开始测量纳米管的长度。按住Ctrl + M以记录长度。</li>
		<li>继续按照上述步骤测量各个独立纳米管的长度。图像处理工具会将每次新测量的结果保存在结果窗口中。</li>
		<li>每次绘制完线条后按住Ctrl + D，以便追踪已测量的纳米管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>测量LNT厚度（图2）
	<ol>
		<li>在ImageJ中打开图像，然后在图像选项卡下选择阈值功能。</li>
		<li>点击应用以应用阈值。</li>
		<li>在目标纳米管上绘制一个已知长度的矩形（黑色像素值为0，红色像素值为255）。</li>
		<li>测量该区域的积分密度。</li>
		<li>将密度除以LNT的长度（以像素为单位），得到厚度（以像素为单位）。 
		注意：只有在成像参数和阈值设置完全一致的情况下，不同图像间的厚度测量结果才可相互比较。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>确定LNT节点中的脂质分布情况（图3）
	<ol>
		<li>在ImageJ中打开图像。</li>
		<li>使用直线工具在目标节点上画一条线。</li>
		<li>在Oregon Green和Texas Red两个通道中测量该节点的强度。</li>
		<li>将直线移至LNT上，并在Oregon Green和Texas Red两个通道中测量LNT的强度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

桑迪亚国家实验室是一家由国家技术 &amp;#38; Engineering Solutions of Sandia, LLC.（霍尼韦尔国际公司全资子公司），根据合同号DE-NA-0003525，为美国能源部国家核安全管理局提供服务。本文所述为客观技术成果与分析。文中可能表达的任何主观观点或意见，并不代表美国能源部或美国政府的观点。

LNT网络是用于体外研究膜特性和生物分子（如跨膜蛋白）转运的有用工具。此外，使用复杂的脂质配方构建LNT网络可实现更具生物学相关性的研究。以往的构建研究要么采用1）简单的脂质配方和多层囊泡，要么采用2）更为繁琐的运动技术，从含有复杂脂质配方的GUVs中构建网络。本文所述方法能够高效地利用复杂脂质配方和GUVs，结合廉价的试剂与设备，大规模制备LNT网络。因此，该方法可用于研究多种生物学过程，包括相分离和膜蛋白运输。本实验方案采用一种体外模型，其中LNT的组成可被最优调节，以模拟其生物学对应结构（例如高尔基体）。
本文所述方法中LNT网络的形成具有多种优势。例如，使用冻干微管蛋白可快速、简便地聚合微管，并且在紫杉醇稳定后，微管在室温下至少可稳定保持1–2周16。因此，微管可被便捷地用于驱动LNT的挤出及大规模网络的形成1,2。此外，基于先前方案稍作修改后，可快速制备由多种脂质组分（即不饱和脂质、饱和脂质和胆固醇）组成的G...

脂质纳米管（LNT）网络的制备在体外研究非平衡态脂质结构方面正受到越来越多的关注1,2,3。细胞利用脂质小管进行蛋白质4和核酸5的扩散性运输，以及细胞间的通讯6,7。内质网和高尔基体尤其引人关注，因为这些膜结合细胞器是脂质和蛋白质合成的主要场所，也是这些重要生物分子在细胞质内运输的关键部位8,9。这些细胞器的膜由多种脂质组成，包括鞘脂、胆固醇和磷脂10，这些成分最终决定了其功能特性。因此，为了更真实地模拟并研究这些细胞器，需要利用含有日益复杂脂质配方的囊泡在体外构建LNT11。
巨大单层囊泡（GUVs）被广泛用于研究脂质膜行为，因为它们可以通过包含胆固醇、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰丝氨酸（PS）和磷脂酰肌醇（PI）的复杂配方可靠地合成12,13。本文描述了一种利用滑动运动测定法（GMA）从具有不同脂质配方的GUVs制备脂质纳米管（LNTs）的方法，在该方法中，LNTs的挤出依赖于驱动GUVs的驱动蛋白马达和微管丝所做功。在此系统中，吸附在表面的驱动蛋白马达推动生物素化的微管，将ATP水解产生的化学能转化为有用功（具体而言，即从生物素化囊泡中挤出LNTs）11。所形成的LNT网络为研究脂质相差异对LNT形态变化的影响提供了一个模型平台。
简而言之，将驱动蛋白分子溶于含酪蛋白的溶液中并引入流动池，使驱动蛋白吸附在流动池的玻璃表面。随后，将含有ATP的生物素化微管溶液注入流动池，使其与驱动蛋白结合并启动运动。接着，向流动池中引入链霉亲和素溶液，使其非共价结合至微管上。最后，将含有生物素化脂质的GUVs（大单层囊泡）引入流动池，使其与链霉亲和素包被的微管结合，并在15–30分钟内延伸出脂纳米管（LNT），形成大规模网络结构。该方法利用常规实验室设备和试剂，以较低成本即可制备出大范围、具有分支结构的LNT网络11。

<table><tbody><tr><td>100x/1.4 数值孔径油浸物镜</td><td>Olympus</td><td>1-U2B836</td><td>奥林巴斯 UPlanSApo 100x/1.40 油镜 无限远校正，RMS 螺纹&lt;br/&gt; 工作距离 0.12 mm</td></tr><tr><td>3.0 ND 滤光片</td><td>奥林巴斯</td><td></td><td>中性密度滤光片</td></tr><tr><td>AMP-PNP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2647</td><td>(&amp;beta;,&amp;gamma;-咪唑代腺苷5&amp;prime;三磷酸</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td>腺苷-5'-三磷酸二钠盐水合物 BioXtra</td></tr><tr><td>Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 滤光片组</td><td>Semrock</td><td>LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000</td><td>&lt;br/&gt; BrightLine Pinkel滤光片组，专为DAPI、FITC、TRITC、Cy5优化 &amp;Cy7 及其他类似荧光染料，使用基于 LED 的光源照射</td></tr><tr><td>酪蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22090</td><td>微生物学用酪蛋白水解物</td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td>牛肝过氧化氢酶</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>288306</td><td>无水氯仿含有0.5–1.0%乙醇作为稳定剂</td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Avanti</td><td>700000P</td><td>胆固醇（绵羊毛， &gt;98%）（粉末）</td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>D-(+)-葡萄糖粉末，BioReagent，适用于细胞培养，适用于昆虫细胞培养，适用于植物细胞培养 &amp;ge;99.5%</td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375C</td><td>1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（溶于氯仿）</td></tr><tr><td>DOPE-Biotin</td><td>Avanti</td><td>870282C</td><td>1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(生物素基)（钠盐）</td></tr><tr><td>DPPC</td><td>Avanti</td><td>850355P</td><td>1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱（粉末）</td></tr><tr><td>DPPE-生物素</td><td>Avanti</td><td>870285P</td><td>1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(生物素基)（钠盐）</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43816</td><td>DL-二硫苏糖醇溶液 1 M</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>EGTA，乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸，乙二胺四乙酸的乙二醇醚，乙二醇醚二胺四乙酸</td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6125</td><td>来自黑曲霉的葡萄糖氧化酶&lt;br/&gt; II型， &amp;ge;10,000 单位/克 固体（未添加氧气）</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher</td><td>G33</td><td>甘油（Certified ACS），Fisher Chemical</td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>鸟苷-5′&amp;prime;三磷酸钠盐水合物</td></tr><tr><td>IX-81 奥林巴斯显微镜</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td>奥林巴斯IX81倒置显微镜</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1050121000</td><td>氢氧化钾</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>1.00 M 氯化镁溶液</td></tr><tr><td>Orca Flash 4.0 数字相机</td><td>Hamamatsu</td><td>C13440-20CU</td><td>ORCA-Flash 4.0 V3 数字CMOS相机</td></tr><tr><td>俄勒冈绿-DHPE</td><td>Invitrogen</td><td>O12650</td><td>俄勒冈绿 488 1,2-二十六酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺</td></tr><tr><td>紫杉醇</td><td>ThermoFisher</td><td>P3456</td><td>紫杉醇（Taxol 等效物）— 仅用于研究用途</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757</td><td>1,4-哌嗪二乙磺酸，哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)，哌嗪-N,N&amp;prime;-双(2-乙烷磺酸)</td></tr><tr><td>Texas Red-DHPE</td><td>Invitrogen</td><td>T1395MP</td><td>Texas Red 1,2-二十六酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺，&lt;br/&gt; 三乙基铵盐</td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813</td><td>(&amp;plusmn;6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸</td></tr><tr><td>微管蛋白，生物素</td><td>细胞骨架</td><td>T333P</td><td>微管蛋白（生物素标记）猪脑来源</td></tr><tr><td>微管蛋白，Hy-Lite 488</td><td>细胞骨架</td><td>TL488M</td><td>微管蛋白（荧光 HiLyte 488 标记）猪脑来源</td></tr><tr><td>微管蛋白，未标记</td><td>细胞骨架</td><td>T240</td><td>微管蛋白 猪脑</td></tr></tbody></table>

利用驱动蛋白运动分析法构建多组分脂质纳米管网络

Fabricating Multi-Component Lipid Nanotube Networks Using the Gliding Kinesin Motility Assay

脂质纳米管（LNT）网络是一种体外模型系统，可用于研究分子运输和脂质生物物理学，与真核细胞中广泛存在的脂质小管具有相关性。然而，体内LNT是高度非平衡结构，其组装、维持和重组需要化学能和分子马达的参与。此外，体内LNT的组成十分复杂，包含多种不同的脂质种类。传统的LNT挤出方法既耗时又费力，且需要借助光镊、微珠和微移液管等工具，从巨型脂质囊泡中强行拉出纳米管。本文介绍了一种滑动运动分析法（GMA）的操作方案，该方法利用驱动蛋白驱动的微管运动，可从巨型单层脂质囊泡（GUVs）快速生成大规模的LNT网络。使用该方法可由多种脂质配方形成LNT网络，模拟生物LNT的复杂性，使其在脂质生物物理学和膜相关运输的体外研究中具有更高的应用价值。此外，该方法可在短时间内（&#60;30分钟）利用常规实验室设备可靠地生成LNT网络。通过调整用于构建网络的GUVs的脂质组成，还可调控LNT网络的长度、宽度及脂质分布等特性。

使用所述方案制备了LNT网络（图4），该方案利用驱动蛋白介导的微管运输，从GUV中挤出LNT。简言之，采用蔗糖溶液通过琼脂糖凝胶再水化法制备GUV，微管在GPEM溶液中聚合，并在BRB80T缓冲液中稳定。随后，将驱动蛋白引入流动池，在盖玻片表面形成一层具有活性的驱动蛋白层。接着引入微管，并加入链霉亲和素溶液，以促进生物素化脂质与GUV之间的结合（GUV随后被引入）。
在流动池中加入所有组分后，允许 LNTs 形成 30 分钟，随后引入 AMP-PNP 以终止运动。然后使用 100 倍油镜在落射荧光显微镜下对 LNTs 进行成像。由于 LNTs 可能较大，也可使用较低倍率的物镜以捕获更大的 LNTs。LNT 网络的特征是由 GUVs 延伸出的细长、网状突起相互连接而成。LNTs 的数量和分支程度受多种因素影响，包括微管在表面的密度、链霉亲和素浓度以及存在的 GUVs 数量。
该方法可生成由固相、液态无序相和液态有序相组成的GUVs和LNTs，以及在多种不同组分条件下呈现...

本方案描述了一种利用驱动蛋白滑动运动与巨大单层脂质囊泡相结合来制备脂质纳米管网络的方法。

脂质纳米管（LNT）网络是一种体外模型系统，可用于研究分子运输和脂质生物物理学，其相关性广泛涉及……

本方案可简单地大规模生成脂质纳米管网络，其中单个纳米管表现出与母体囊泡相似的相分离行为。该方法的关键优势在于，我们利用分子马达所做的功，以高度并行且无需人为干预的方式实现脂质纳米管的自组装。建立滑动运动实验时，首先将三组双面胶条粘附在载玻片上，每组间隔五毫米。轻轻将盖玻片压在胶带上，并向已制备的流动池中加入 30 微升浓度为 1 微摩尔的驱动蛋白溶液。五分钟后，向流动池中加入 30 微升浓度为 10 微克/毫升的微管溶液，同时轻轻将实验室擦拭纸贴在流动通道的另一端，以促进溶液置换。再经过五分钟孵育后，每次用 50 微升室温运动缓冲液洗涤流动池一次，重复洗涤一至三次，随后向流动池中加入 30 微升浓度为 10 微克/毫升的链霉亲和素溶液。10分钟后，加入30微升10X GUV溶液，在室温下孵育30分钟。然后加入2微升100毫摩尔的AMP-PNP溶液，并用封片剂封闭样品室。将流动室转移至倒置显微镜进行成像，并选择合适的滤光片组。使用100倍油镜先对盖玻片表面进行调焦，然后采集目标网络的图像。接着在ImageJ中打开图像，点击图像、颜色和复合，以叠加红色和绿色通道，生成复合图像。成像后，打开目标图像，点击分析并设置比例尺，以校准显微镜的比例尺。输入像素到微米的转换系数，然后点击“确定”。使用多点线工具从母体GUV开始追踪纳米管，并按住 Control 和 M 键测量其长度。图像处理工具会将每次新测量的结果保存在结果窗口中。当所有管状结构均测量完毕后，选择“图像”、“调整”、“阈值”，然后点击“应用”以应用阈值。然后，在目标管上绘制一个已知长度的矩形。为测量该区域的积分密度，点击“分析”并选择“测量”。为了确定脂质在液体纳米管节点中的分布情况，使用线条工具在感兴趣的节点上画一条线，并分别在绿色和红色通道中测量该节点的强度。在此代表性分析中，如所示构建了液体纳米管网络，以形成液体无序相和有序相，以及相分离的囊泡。例如，由45%饱和脂质和55%不饱和脂质合成的囊泡会分离成共存的液态无序相和固相。然而，如果加入胆固醇，则可观察到液-液共存现象，形成分离成共存的液态有序相和液态无序相的GUVs。此外，在相分离的混合物中还可观察到节点结构。最重要的是选择合适的曝光时间和中性密度滤光片组，以便在不发生荧光染料光漂白的情况下观察到脂质纳米管。通过调控脂质纳米管的组成及其相变行为，我们可以利用一个简化的模型系统，开始研究连接细胞之间的隧道纳米管的生物物理学特性。

fabricating-multi-component-lipid-nanotube-networks-using-gliding

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

使用滑动运动蛋白运动度测定法制造多组分脂质纳米管网络

由功能化微管在表面附着的驱动蛋白马达上滑行所构成的分子穿梭系统，可作为一种纳米级运输系统。本文描述了一种典型穿梭系统的组装方法。...

驱动蛋白动力分子穿梭车的货物装载

在本视频中，我们进行一项体外运动分析实验，以研究肌动蛋白与肌球蛋白之间的相互作用。通过荧光显微镜观察固定在表面的肌球蛋白分子上肌动蛋白丝的滑动运动。...

滑动肌动蛋白丝检测：一种体外运动检测法，用于研究肌动蛋白丝在固定化肌球蛋白上的易位

本文介绍了一种用于测量生物大分子持久长度或弯曲刚度的方法。该方法利用驱动蛋白驱动的微管滑动实验，通过实验手段测定单个微管的持久长度，并可适用于基于肌动蛋白的滑动实验。...

使用滑动实验测量生物大分子的弯曲刚度

我们报道了一种利用碳纳米管对含有自组装纳米结构内核的脂质颗粒进行动力学稳定化的智能应用。制备此类脂质颗粒仅需较低浓度的碳纳米管，因而可将其应用于药物递送等生物医学领域。...

碳纳米管稳定的内源性自组装脂质颗粒的简便制备

固相支撑、无蛋白质的双层磷脂膜（DLBM）可转化为复杂的动态脂质纳米管网络，可作为内质网的二维自下而上模型。...

人工脂质纳米管网络的自发生长与重组：内质网的自下而上模型

我们提出一种构建分子穿梭装置的方案，其中表面附着的驱动蛋白马达推动带有染料标记的微管。驱动蛋白与表面之间的弱相互作用使其能够可逆地附着于表面，从而形成一种纳米尺度系统，该系统在保持功能完整性的同时，展现出组分的动态组装与解聚行为。...

组装由可逆附着驱动蛋白驱动的分子穿梭器

本实验方案的目的是在DNA折纸纳米结构上组装分子马达的集合体，并利用全内反射荧光显微镜观察该集合体的运动行为。...

在DNA折纸纳米结构上构建动力蛋白与驱动蛋白马达复合体用于单分子观测

双向有丝分裂驱动蛋白-5 Cin8 在运动过程中会聚集形成不断分裂和融合的簇状结构。聚集形成簇状结构还会改变 Cin8 的运动速度和方向性。本文介绍了一种利用纯化的 Cin8-GFP 进行运动性检测的实验方案，以及对 Cin8...

来自 S. cerevisiae 细胞的双向驱动蛋白-5 Cin8 单分子及分子簇的运动特性

本方案描述了支撑脂双层的形成，以及细胞骨架丝和马达蛋白的添加，用于通过荧光显微镜研究重建的膜锚定细胞骨架网络的动力学。...

在支撑脂双层上重建膜锚定的最小肌动蛋白皮层

本文介绍了可调控的三维共缠结肌动蛋白丝与微管复合网络的构建与表征方法。该复合材料在肌球蛋白II和驱动蛋白马达的驱动下发生主动重构和弹道运动，并可通过调节肌动蛋白、微管、马达蛋白和被动交联分子的相对浓度进行调控。...

重构与表征具有可调马达驱动动力学和力学性能的微丝-微管复合物

本文介绍了利用纯化蛋白制备准二维（2D）缠结、交联及液晶状肌动蛋白组装体的方法。...

调控基于肌动蛋白的活性组装体的收缩性与变形模式 体外从二维活性网络到液晶液滴

学习利用滑动运动蛋白运动度测定法制造多组分脂质纳米管网络。该方法借助分子马达实现脂质纳米管的高效自组装，无需人工干预，可研究膜动力学与相分离行为。

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