Name: 通过RNA-Seq分析，人类原主角细胞的体外分化特征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 29 s
Description: 了解通过接触抑制诱导人原代角质形成细胞体外分化的方法，并利用RNA测序进行分子特征分析。该方案适用于大规模表观基因组研究，为皮肤生物学和再生医学提供重要技术支持。

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本研究由荷兰科学研究组织（NWO/ALW/MEERVOUD/836.12.010，H.Z.）（NWO/ALW/开放竞争/ALWOP 376，H.Z.，J.G.A.S.）；拉德堡德大学研究员项目（H.Z.）；以及中国国家留学基金管理委员会资助项目 201406330059（J.Q.）提供支持。

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<li>Podnar, J., Deiderick, H., Huerta, G., Hunicke-Smith, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-Generation+Sequencing+RNA-Seq+Library+Construction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Next-Generation Sequencing RNA-Seq Library Construction.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 106, 21(2014).</li>
<li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., Lonnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), 75(2017).</li>
<li>Oyola, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+Illumina+next-generation+sequencing+library+preparation+for+extremely+AT-biased+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Optimizing Illumina next-generation sequencing library preparation for extremely AT-biased genomes.</a> BMC Genomics. 13, 1(2012).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+enzymes+for+amplifying+sequencing+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimal enzymes for amplifying sequencing libraries.</a> Nature Methods. 9 (1), 10-11 (2011).</li>
<li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms%3A+comparison+of+Ion+Torrent%2C+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13, 341(2012).</li>
<li>Ross, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+measuring+bias+in+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterizing and measuring bias in sequence data.</a> Genome Biology. 14 (5), 51(2013).</li>
<li>Soneson, C. ARMOR. , Available from: 
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<li>Sande, S. F. snakemake-workflows. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows">https://github.com/vanheeringen-lab/snakemake-workflows</a> (2019).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本研究描述了一种诱导人角质形成细胞分化并利用RNA-seq分析对其进行后续表征的方法。在现有文献中，许多关于人角质形成细胞分化的研究采用另外两种方法：高钙浓度或添加血清&#160;作为诱导分化的手段2,3,23。此前有研究报告对这三种不同方法进行了细致比较3，结果表明这些方法可能代表了角质形成细胞分化的不同生物学过程。在同一项研究中，作者指出，由血清诱导的分化细胞具有较高的增殖潜能，并表达KRT16和SKALP/PI3等基因，这些基因在银屑病皮肤中表达，但在正常表皮中不表达，因此血清诱导的分化模型可用于银屑病的研究。相比之下，接触抑制联合生长因子去除的方法能够诱导KRT1和KRT10的表达，这两种角蛋白通常在表皮中表达，更接近正常的角质形成细胞分化过程。高钙诱导所引发的基因表达谱介于血清诱导与接触抑制之间，是特异性最低的方法。在分化过程中采用RNA-seq分析进一步证实，接触抑制联合生长因子去除的方法可诱...

来源于人体皮肤的原代角质形成细胞常被用作细胞模型来研究表皮生物学1,2,3,4。表皮的分层结构可通过角质形成细胞的分化进行模拟，既可在二维浸没式单层培养条件下实现，也可在三维气液界面类器官模型中建立2,3,5,6,7。尽管三维模型在评估表皮结构与功能方面的重要性日益增加，但由于二维分化模型操作简便，且能够获得大量用于分析的细胞，目前仍被广泛使用。
已采用多种条件在二维培养中诱导角质形成细胞分化，包括添加血清、高浓度钙、较低温度以及抑制表皮生长因子受体2,3。这些方法均已通过一系列角质形成细胞分化标志基因得到验证，并证明在评估角质形成细胞分化（包括在病理条件下）方面是有效的。然而，当检测特定的标志基因组合时，这些诱导条件在分化效率和动力学方面也显示出差异2,3。
其中一种方法涉及角质形成细胞的接触抑制以及培养基中生长因子的耗尽8。研究表明，当细胞达到完全密度时，角质形成细胞可自发地发生分化。&#160;在培养基中去除生长因子可进一步促进分化。已有研究显示，结合接触抑制和生长因子耗尽的方法，可在使用多种表皮标志物时，产生具有与正常复层表皮相似基因表达模式的分化角质形成细胞3，表明该模型适用于研究正常角质形成细胞的分化过程。最近，已有两项利用该模型对角质形成细胞分化进行的全面基因表达分析被报道9,10。研究人员在分子水平上验证了该模型，并证明其可用于研究正常及病变状态下的角质形成细胞分化。
本方案描述了以下操作步骤 体外 分化方法及利用RNA-seq对分化细胞进行分子分析。本文还展示了分化第0天（增殖阶段）、第2天、第4天和第7天（分别为早期、中期和晚期分化）细胞转录组的表征。结果显示，分化的角质形成细胞表现出与表皮分层过程中细胞高度相似的基因表达模式。为检验该方法是否可用于研究皮肤病理过程，我们采用相同的实验与分析流程，对来源于外胚层发育不良、并指（趾）畸形及唇腭裂（EEC）综合征患者的、携带转录因子p63突变的角质形成细胞进行了研究11,12本方案重点介绍角质形成细胞的体外分化以及随后对RNA-seq数据进行的生物信息学分析。完整实验流程中的其他步骤，如RNA提取、RNA-seq样本制备和文库构建，已有充分文献记录，尤其在使用多种常见商用试剂盒时易于操作，因此这些步骤在本方案中仅作简要描述。实验数据显示，该流程适用于研究健康与病变角质形成细胞在表皮分化过程中发生的分子事件。

<table><tbody><tr><td>生物分析仪 2100</td><td>Agilent</td><td>G2929BA</td><td></td></tr><tr><td>牛脑垂体提取物（BPE）</td><td>Lonza</td><td></td><td>bulletKit 的组成部分</td></tr><tr><td>CFX96 实时系统</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>qPCR 仪器</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>表皮生长因子（EGF）</td><td>Lonza</td><td></td><td>bulletKit 的组成部分</td></tr><tr><td>乙醇胺 &gt;= 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>高灵敏度 DNA 芯片</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>氢化可的松</td><td>Lonza</td><td></td><td>bulletKit 的组成部分</td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>Lonza</td><td></td><td>bulletKit 的组成部分</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green 试剂盒</td><td>BioRad</td><td>170-8886</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA 合成试剂</td><td>Bio rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>KAPA 文库定量试剂盒</td><td>Roche</td><td>07960255001</td><td>低浓度测量试剂盒</td></tr><tr><td>含 RiboErase 的 KAPA RNA HyperPrep 试剂盒</td><td>Roche</td><td>KK8540</td><td>RNAseq 试剂盒</td></tr><tr><td>KGM Gold 角质形成细胞生长培养基 bulletKit</td><td>Lonza</td><td>192060</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>deNovix</td><td>DS-11 FX（型号）</td><td>Nanodrop 和 Qbit 用于 DNA 和 RNA 测量</td></tr><tr><td>NEXTflex DNA 条形码 -24</td><td>Illumnia</td><td>NOVA-514103</td><td>6 bp 长引物</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>RNA Pico 芯片</td><td>Agilent</td><td>5067-1513</td><td></td></tr></tbody></table>

通过rna-seq分析表征人原代角质形成细胞的体外分化

Characterization of In Vitro Differentiation of Human Primary Keratinocytes by RNA-Seq Analysis

人原代角质形成细胞常被用作研究表皮分化及相关疾病的体外模型。已有文献报道了在二维（2D）浸没培养条件下，通过不同诱导方式实现角质形成细胞体外分化的实验方法。本文所述方法为通过接触抑制诱导角质形成细胞进行二维体外分化，并继而通过RNA-seq进行分子表征的实验流程。简言之，角质形成细胞在添加生长因子的特定角质形成细胞培养基中培养，直至完全汇合。细胞间的紧密接触可诱导分化，同时通过去除培养基中的生长因子进一步促进分化过程。RNA-seq分析结果显示：1）分化后的角质形成细胞在分化过程中表现出独特的分子特征；2）其动态基因表达模式与表皮分层过程中的细胞高度相似。与正常角质形成细胞分化相比，转录因子p63突变的角质形成细胞表现出形态学改变及分子特征异常，与其分化缺陷表现一致。综上所述，本实验方案详细描述了二维体外角质形成细胞分化及其分子表征的步骤，重点介绍了RNA-seq数据的生物信息学分析流程。由于RNA提取及RNA-seq操作已有详尽文献记录，故本方案不重点阐述该部分。该体外角质形成细胞分化实验及生物信息学分析流程可用于研究健康与疾病状态下角质形成细胞表皮分化过程中的分子事件。

正常角质形成细胞分化及RNA-seq分析 
本实验采用来自五名个体的角质形成细胞系进行分化及RNA-seq分析。图1总结了分化过程及RNA-seq分析结果的实验流程。图1A展示了正常角质形成细胞体外分化过程及分化过程中细胞形态变化的概览。主成分分析（PCA）显示，处于分化过程中的角质形成细胞具有相互关联但又明显不同的整体基因表达谱（图1B）。通过k均值聚类对高变基因进行聚类，以可视化分化过程中基因表达的动态变化和表达模式（图1C）。
每个基因簇由角质形成细胞分化标志基因代表（例如，KRT5 代表增殖期，KRT1 和 KRT10 代表早期和中期分化，IVL/LOR/FLG 代表晚期分化）。对高变异性基因簇进行基因本体（GO）注释分析（图1C）显示，这...

本文介绍了一种通过接触抑制实现人原代角质形成细胞体外分化的逐步实验流程，并通过RNA-seq分析在分子水平对其进行表征。

通过RNA-Seq分析表征人原代角质形成细胞的体外分化

人原代角质形成细胞常被用作研究表皮分化及相关疾病的体外模型。已有文献报道……

本方案包含两个部分。首先，通过接触抑制在体外建立角质形成细胞单层二维分化的方法；其次，利用RNA测序对其进行分子表征。二维体外分化方法简单且易于操作，可用于研究表皮分化，尤其适用于需要大量细胞的情况，例如表观基因组学分析。对于具备基本生物信息学技能的研究人员而言，详细的RNA-seq分析流程清晰且透明，可适用于任何批量RNA-seq分析。首次执行分化方案时，请注意接种密度可能较难掌握。建议尝试多种接种密度，以确定最适合您细胞系的接种条件。首先，根据文稿说明配制角质形成细胞生长培养基（KGM），以及各500毫升的增殖培养基和分化培养基。以每平方厘米5,000至20,000个细胞的密度接种原代角质形成细胞，并加入足量增殖培养基以覆盖细胞。接种后两天，用增殖培养基更换培养液。定期在显微镜下观察细胞，并每隔一天更换一次培养基。当细胞融合度达到90%时，更换为成肌分化培养基以诱导分化。如需收集细胞进行后续RNA分析，先用DPBS洗涤细胞两次，然后加入裂解缓冲液。在分化第0天、第2天、第4天和第7天收集细胞。RNA提取后，将合成双链cDNA，并构建RNA-seq文库用于下一代测序。测序完成后，下载测序读长并将其比对至人类基因组。下载并安装 R 软件包后，从 readspergene.out.tab 文件生成计数表，并编写一个样本数据文件，包含所有文件名、分化天数及其他相关样本信息。示例请参见补充代码文件。然后使用计数表和样本数据生成一个包含计数数据和样本数据的 DESeq2 对象。对于基因表达标准化，可使用 DESeq2RLD 或 VST 标准化方法对 DESeq2 对象中的计数表进行标准化。其中 RLD 标准化更推荐使用，但 VST 标准化速度更快。使用 R 中的 dist 函数，根据标准化的读段计数强度绘制样本距离图，然后基于样本距离进行 hclust 聚类分析。接着，利用 pheatmap 函数绘制热图。最后，使用 deseq2 的 plotPCA 函数对标准化的读段计数强度进行主成分分析（PCA），并生成 PCA 图。主成分分析（PCA）是探索性数据分析中的一种工具，可用于可视化不同样本之间的距离和关联关系。使用 rowVars 函数进行高变异性基因表达分析，该函数通过按不同时间点样本间的方差排序，提取前 500 个高变异性基因。这些基因在分化各天的标准化表达强度中具有最高的标准差。对高变基因进行k均值聚类，以根据不同的表达模式对其进行分组。使用pheatmap包将基因在热图中可视化。热图中绘制的强度值为DESeq2标准化后的强度值减去中位数后的结果。生成一个表达的背景基因列表，包含在单个样本中计数超过10的所有基因，并列出每个簇中的基因。最后，使用GOrilla进行基因本体（Gene Ontology）分析。将背景基因列表作为背景基因集，将各簇中高变基因列表作为目标基因集，然后点击搜索富集的GO术语。此外，更高级的 R 用户可以使用 clusterProfiler 软件包来自动化进行基因本体（GO）富集分析。RNA-seq 分析采用了来自五名个体的角质形成细胞系进行分化研究。主成分分析显示，处于分化过程中的角质形成细胞具有相互关联但又明显不同的整体基因表达谱型。通过聚类高度可变基因以可视化分化过程中的基因表达动态和模式。每个基因簇均以角质形成细胞分化标志基因为代表，基因本体注释显示各簇基因功能存在明显差异。在第二项实验中，比较了来自健康对照者的角质形成细胞与携带P63突变患者的细胞系之间的细胞形态及基因表达差异。主成分分析显示，对照细胞系明显遵循分化模式，而突变细胞在分化过程中的基因表达模式则与增殖或未分化细胞的基因表达模式大体相似。在聚类分析中，1号聚类中的基因在对照细胞中呈下调，在携带R204W和R279H突变的患者细胞中部分下调，但在携带R304W突变的细胞中仍保持高表达。基因本体分析表明，这些基因可能在细胞增殖中发挥作用。第二组基因在对照细胞中首先被引入，随后表达下调。这些基因可能参与角质形成细胞的分化过程，因为该组基因在表皮分化和角化功能方面显著富集。第三组基因仅在对照细胞分化的末期被诱导表达，表明它们可能在表皮最外层中发挥作用。在分析RNA-seq数据时，预先了解预期结果非常重要。这将有助于您解读质量控制结果和PCA图，并评估您的研究结果是否合理。我们的方法可用于研究表皮生物学以及其他生物系统中的基因转录。

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科研

JoVE Journal

Genetics

遗传学

通过RNA-Seq分析，人类原主角细胞的体外分化特征

单细胞基因表达检测对于理解干细胞异质性至关重要。...

通过定量RT-PCR对单个人类胚胎干细胞进行基因表达谱分析

对人类诱导多能干细胞（iPS细胞）、由人类诱导多能干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞（iPS-RPE）以及胎儿视网膜色素上皮细胞（fetal...

人类诱导多能干细胞、由诱导多能干细胞衍生的视网膜色素上皮细胞及胎儿视网膜色素上皮细胞的microRNA表达谱

本视频展示了在转染后对分离的鸡胚脊髓样本进行全转录组分析的基本步骤 在卵内...

电穿孔鸡胚脊髓中差异基因表达的RNA-Seq分析

采用RNA测序和生物信息学分析方法，鉴定小鼠EML细胞中Lin-CD34+和Lin-CD34-亚群内显著差异表达的转录因子。这些转录因子可能在调控自我更新的Lin-CD34+细胞与部分分化的Lin-CD34-细胞之间的转换过程中发挥重要作用。...

通过RNA测序分析鉴定调控EML造血前体细胞自我更新与分化的关键因子

本论文提供了从拔取的毛发中分离和培养人角质形成细胞，并通过附加体型载体进一步生成无整合的人诱导性多能干细胞（hiPSCs）的逐步操作流程。...

利用毛发来源的角质形成细胞生成无整合的人诱导性多能干细胞

本文介绍一种利用骨形态发生蛋白4（bone morphogenic protein...

体外 人多能干细胞向滋养层细胞的分化

人类皮肤作为抵御外部环境的第一道防线。本文介绍一种从成人皮肤中分离原代人角质形成细胞的方法。这些分离得到的角质形成细胞可用于多种实验体系，是研究皮肤生物学中分子机制的理想模型。 体外.

成年皮肤来源人原代角质形成细胞的分离与培养

本文介绍一种从成人皮肤组织中高效分离原代人角质形成细胞的方案。该方法通过在接种培养基中使用ROCK抑制剂Y-27632，使表皮细胞与真皮细胞自发分离，从而简化了传统操作步骤。...

一种简化且高效的人类原代角质形成细胞从成人皮肤组织中的分离方法

鉴定基因与调控元件之间的物理相互作用具有挑战性，但染色体构象捕获技术为此提供了便利。该4C-seq方案的改进通过减少PCR模板的过度扩增，减轻了PCR偏好性，同时通过增加限制性内切酶消化步骤，提高了测序读段的可比对性。...

利用下一代测序技术对染色体构象捕获环化文库（4C-seq）进行基因调控序列的高通量鉴定

本方案展示了如何从细胞培养基中纯化细胞外microRNA，用于小RNA文库构建及下一代测序。文中描述了多种质量控制检查点，帮助读者了解在处理低丰度样本（如exRNA）时的预期结果。...

分离、测序与分析人源间充质干细胞的细胞外微小RNA

本文介绍了一种在三维悬浮培养体系中系统培养表皮球体的实验方案。该方案可广泛应用于多种上皮组织类型，并可用于多种人类疾病和病理状态的建模研究。...

建立高通量表皮球体培养系统以模拟角质形成细胞干细胞可塑性

了解通过接触抑制诱导人原代角质形成细胞体外分化的方法，并利用RNA测序进行分子特征分析。该方案适用于大规模表观基因组研究，为皮肤生物学和再生医学提供重要技术支持。

通过RNA-Seq分析表征人原代角质形成细胞的体外分化

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