以乌苏图病毒为例验证全基因组纳米孔测序

我们利用病毒基因测序来探究病毒的来源及其传播方式。为了能够实时使用这些数据（例如在疫情暴发期间），我们必须准确了解所提供数据的精确程度。这些技术的主要优势在于成本相对较低、速度快，并且能够实现实时碱基编码，可用于现场测序。

该方法可用于及时生成序列数据，例如用于确定多种病原体的来源。对于初次使用者而言，该技术可能较为复杂，需要具备基本的 Unix 知识，尤其是在安装不同软件包时。

本方法的可视化将帮助用户确定其特定测序方案的错误率，并解答科研问题。测序运行在连接至 MinIT 的 MinION 上启动。

在 Nanopore 平台上完成测序后，将数据加载到 Porechop 中。为防止污染并提高准确性，使用 require_two_barcodes 标志，并按照所示命令输入。去多重后，使用 cutadapt 去除引物序列以及长度短于 75 个核苷酸的序列，具体命令如所示。

使用 Minimap2 将去多重化的序列读段比对到不同参考株的面板上。然后使用 Samtools 生成一致性序列。对于基于参考序列的比对，必须使用生成的一致性序列进行 blast 搜索，以鉴定最接近的参考株。

然后以最接近的参考菌株作为参考序列，重复基于参考的比对。为了确定为补偿Nanopore测序错误谱所需的测序深度，选择比对到一个扩增子的序列，并使用Minimap2将Nanopore测序读段比对至该扩增子。使用Samtools仅筛选比对到Amplicon26的读段，并按照所示命令将bam文件转换为fastq格式。

例如，随机选择 200 条序列读长的子集，重复一千次。将所有随机选出的序列读长比对至 Amplicon26。使用 KMA 软件，依据 BC nano 标志所示的 Nanopore 测序优化参数，对序列读长进行比对并立即生成一致性序列。

要检查生成的共识序列，请使用所示命令。要显示统计信息文件（stats dot txt）中“错误率：错配碱基/比对”标题下的错误率，请使用所示命令。要显示“每循环插入缺失数”标题下的插入缺失数量，请使用所示命令。

使用新型流动池结合碱基颜色翻转技术，40倍测序深度的结果与Illumina测序结果一致。30倍测序深度的错误率为0.02%，相当于每测序585,000个核苷酸出现一个错误。而20倍测序深度则相当于每测序63,529个核苷酸出现一个错误。

10 倍的测序深度会导致每 3,312 个测序的核苷酸中出现一个错误，这意味着每四个乌苏图病毒基因组中就有超过 3 个核苷酸被错误识别。当测序深度超过 30 倍时，则不会观察到插入缺失突变（indels）。

20倍的测序深度可检测到1个插入缺失位点，而10倍的测序深度则可检测到29个插入缺失位点。需要牢记最重要的一点是，尽管软件更新并不总是显而易见，但其更新频繁，可能对结果产生影响。目前有多种可用的软件选择。

我们已经演示了最常用的程序。但不同的软件以及同一软件的不同版本可能会导致不同的结果。我们向您展示了一个示例，说明如何检查我们生成的序列数据的质量。

这对于可靠的疫情应对至关重要。