Name: 成人心脏纤维细胞和肌纤维细胞的分离与表征 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 学习从小鼠心脏中分离高纯度成纤维细胞和肌成纤维细胞的方法，用于研究伤口愈合和纤维化机制。该技术结合免疫荧光、RT-PCR和流式细胞分选进行细胞表征，可应用于心脏组织修复生物学研究。

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作者感谢 Ivo Kalajzic 博士提供 αSMA-GFP 小鼠。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家普通医学科学研究所资助（资助号 R01GM118300，S.S.），美国国立卫生研究院下属的国家生物医学成像与生物工程研究所资助（资助号 R21EB019509，P.P.Y.），以及美国心脏协会科学家发展奖资助（资助号 17SDG33630187，S.S.）。流式细胞术分析在范德堡大学医学中心（VUMC）流式细胞术共享资源平台完成，该平台由范德堡英格拉姆癌症中心（P30 CA68485）和范德堡消化疾病研究中心（DK058404）提供支持。

本研究严格遵守美国国立卫生研究院《实验动物护理和使用指南》中的建议。范德堡大学机构动物护理和使用委员会已批准该实验方案（方案编号：M1600076-01）。
1. 心脏解剖
<ol>
	<li>溶液配制
	<ol>
		<li>KHB缓冲液
		<ol>
			<li>使用磁力搅拌器，将9.4 g Krebs-Henseleit缓冲液（KHB）粉末缓慢溶解于900 mL去离子水（DDI水）中。 
			注意：若搅拌过快或时间过长，缓冲液可能发生沉淀。在成纤维细胞分离过程中，KHB缓冲液必须保持低温。</li>
			<li>加入2.9 mM CaCl2和24 mM NaHCO3。用dH2O定容至1 L，并调节pH至7.2–7.3。</li>
			<li>使用无菌滤器（0.22 µm）过滤后，于4 °C保存，最长可保存4周。在分离过程中需保持冰上或4 °C保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>胶原酶消化液
		<ol>
			<li>在成纤维细胞分离当天配制消化液。根据心脏数量确定所需消化液体积，每1个心脏需5 mL消化液。</li>
			<li>按照生产商说明书配制胶原酶混合物（见材料表）和DNase I。</li>
			<li>配制20 mL总消化液体积时，向一个空的50 mL锥形管中加入17.5 µL DNase I、180 µL 1 M HEPES和500 µL胶原酶。</li>
			<li>加入适量含Ca2+和Mg2+的Hank's平衡盐溶液（HBSS），使总体积达到20 mL。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>红细胞（RBC）裂解缓冲液
		<ol>
			<li>根据心脏数量确定所需总体积（每心脏5 mL），用dH2O将10倍浓度的RBC裂解储备液稀释至1倍工作浓度。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>成纤维细胞培养基：含10% FBS的DMEM F-12
		<ol>
			<li>向含L-谷氨酰胺和HEPES的DMEM-F12培养基中加入10% FBS，再加入10 U/mL青霉素/链霉素、2.5 µg/mL抗真菌剂和2.5 µg/mL支原体预防剂（见材料表）。4 °C保存。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>心脏解剖
	<ol>
		<li>在冰上准备6孔板，每孔加入2 mL冷KHB缓冲液，用于解剖过程中存放心脏。使用经高压灭菌的手术剪和镊子。</li>
		<li>对12周龄或更年老的小鼠采用异氟烷过量麻醉处死，随后进行颈椎脱位。</li>
		<li>另可选择：为分离活化成纤维细胞，通过冠状动脉结扎法在12周龄小鼠中诱导心肌梗死10。损伤后8–10天处死小鼠。</li>
		<li>用70%乙醇喷洒小鼠体表，使其腹面朝向操作者。固定或约束四肢以避免干扰操作。</li>
		<li>切开腹部皮肤和肌肉，注意避免刺破肝脏。沿纵轴向胸骨方向剪开，并小心打开胸腔，避免刺伤心脏。继续剪开肋骨以暴露心脏。</li>
		<li>用镊子轻轻将心脏从胸腔中提起，剪除附着在心脏外表面的肺组织或其他多余组织。取下心室并放入含冷KHB缓冲液的6孔板中一个孔内。以相同方式继续解剖其余心脏，直至所有样本均被分离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>心脏的酶解离
	<ol>
		<li>用镊子在KHB缓冲液中反复挤压并搅动心脏，以去除多余血液。将心脏转移至洁净无菌的10 cm2培养皿中。使用单刃刀片迅速将心脏切成小块。</li>
		<li>加入1 mL胶原酶消化液，继续剪切直至组织块足够小，可用1 mL移液器转移。用1 mL移液器将组织块转移至50 mL锥形管中。用2 mL胶原酶消化液洗涤培养皿两次。 
		注意：剪去移液器吸头尖端一部分有助于收集较大的组织块，防止其卡在吸头中。</li>
		<li>将锥形管在37 °C孵育30分钟，同时进行摇动或振荡。必要时固定管子。用5 mL移液器重悬10次，使内容物均匀，然后将锥形管在37 °C继续孵育15分钟，同时旋转或振荡。</li>
		<li>用10 mL移液器重悬10次至均匀。将40 µm细胞筛预先润湿：在新的50 mL锥形管上放置细胞筛，加入1–2 mL KHB缓冲液润湿滤膜。向消化悬液中加入25 mL KHB缓冲液，重悬后通过已润湿的40 µm细胞筛过滤。根据需要更换滤膜。 
		注意：当过滤速度变慢时，可轻轻敲击管壁，或用1 mL移液器从滤膜下方吸取悬液，以帮助细胞悬液通过部分堵塞的40 µm细胞筛。</li>
		<li>在400 × g、4 °C条件下离心10分钟。弃去上清液，将沉淀用1倍RBC裂解缓冲液（每心脏5 mL）重悬，在室温（RT）孵育2分钟。</li>
		<li>在400 × g、室温条件下离心10分钟。弃去上清液，然后用1 mL KHB缓冲液重悬沉淀进行洗涤。</li>
		<li>加入9 mL KHB缓冲液，通过已润湿的40 µm细胞筛过滤至新的50 mL锥形管中。在400 × g、室温条件下离心10分钟。</li>
		<li>弃去上清液，将沉淀用1 mL成纤维细胞培养基或PBS重悬，并计数细胞数量。可通过以下三种不同方法之一进行成纤维细胞的进一步分离。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 从单细胞悬液中分离成纤维细胞
<ol>
	<li>成纤维细胞分离：差速贴壁法图1)
	<ol>
		<li>在6孔板的每个孔中加入2 mL成纤维细胞培养基，轻轻摇晃培养板使液体覆盖孔底。</li>
		<li>将每颗心脏的细胞重悬于1 mL培养基中。每孔接种1 mL细胞悬液，理论上每孔接种一颗心脏的细胞。例如，六颗心脏应重悬于6 mL培养基中，随后将1 mL细胞悬液接种至六个孔中，每孔1 mL。</li>
		<li>轻轻混匀培养板以均匀分散细胞。每孔再加入1–2 mL培养基，使每孔总体积达到5 mL，于37 °C孵育4 h。</li>
		<li>成纤维细胞将在4小时后通过选择性贴壁分离。移除未贴壁和死亡的细胞，弃去培养基。用2 mL PBS洗涤贴壁细胞，每孔加入2–4 mL无菌成纤维细胞培养基。于37 °C培养至细胞融合，每2–4天更换一次培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成纤维细胞分离：利用GFP报告基因小鼠模型进行FACS图1)
	<ol>
		<li>FACS 缓冲液
		<ol>
			<li>配制15 mL含5%胎牛血清（FBS）的无钙dPBS溶液2+ 和 Mg2+. 冰上或4°C保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>FC阻断剂溶液
		<ol>
			<li>配制 0.5 µL FC 阻断剂（纯化的抗小鼠 CD16/CD32）于 25 µL FACS 缓冲液中（1:50 稀释）。每份样本需 25 µL FC 阻断剂溶液。置于冰上或 4 °C 保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>样品制备与抗体染色 
		注意：抗体稀释液可预先配制，但可能存在光照或温度暴露的风险。
		<ol>
			<li>在FACS缓冲液中配制7AAD或Ghost染料Violet 510，浓度为所需稀释度的2倍。参见 表1 用于抗体及其稀释比例。</li>
			<li>将500,000个新鲜分离的细胞重悬于25 µL FC阻断剂溶液中，以防止FC抗体区域与FC受体发生非特异性结合。室温孵育5分钟。</li>
			<li>向终体积为25 µL的细胞悬液中加入7AAD或Ghost Dye Violet 510抗体。冰上避光孵育30–60分钟。</li>
			<li>用1 mL FACS缓冲液重悬洗涤。500 x g离心 g 4°C 下离心 5 分钟。</li>
			<li>将沉淀重悬于推荐的流式细胞术上样体积的FACS缓冲液（300 µL）中，转移至流式细胞术检测管。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>荧光激活细胞分选（FACS） 
		注意：GFP-αSMA 报告小鼠由 Ivo Kalajzic 博士提供11该小鼠在α平滑肌细胞（αSMA）启动子驱动下表达GFP。αSMA已被用作活化成纤维细胞（肌成纤维细胞）的标志物。12.
		<ol>
			<li>为分离活化成纤维细胞（表达αSMA的肌成纤维细胞），通过冠状动脉结扎法在12周龄GFP-αSMA小鼠中诱导心肌梗死。损伤后8–10天处死小鼠。</li>
			<li>从损伤小鼠心脏制备单细胞悬液后，分选αSMA阳性 用绿色荧光蛋白（GFP）标记的成纤维细胞。使用未染色且未受损的成纤维细胞在补偿后设定GFP通道的背景信号。</li>
			<li>活GFP门控阳性 通过7AAD染色排除法对细胞进行门控阴性/GFP阳性 细胞或Ghost Dye Violet 510阴性/GFP阳性 细胞并分选表达GFP的αSMA细胞阳性 肌成纤维细胞。用成纤维细胞培养基收集细胞。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成纤维细胞分离：基于磁珠的成纤维细胞分离图1)
	<ol>
		<li>平衡缓冲液 
		注意：分离过程中务必使用新鲜配制的缓冲液。
		<ol>
			<li>在 PBS 中配制 0.5% BSA 和 2 mM EDTA。将容器盖子连接真空装置，同时搅拌溶液以对缓冲液进行脱气。 
			注意：搅拌可去除溶液中的过量气体，随后通过真空将气体排出，以防止使用时气泡堵塞分离柱。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>磁性标记：CD45+ 造血细胞
		<ol>
			<li>离心分离小鼠心脏的细胞，500 x g g 5 分钟后，弃去上清液。</li>
			<li>将细胞沉淀重悬于1 mL平衡缓冲液中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
			<li>离心细胞悬液，操作同上，然后将细胞沉淀重悬于每1 × 10⁶个细胞90 μL平衡缓冲液中7 总细胞数。加入10 μL CD45+ 每 1 × 10 磁珠7 总细胞。充分混匀，于 4°C 孵育至少 15 分钟。</li>
			<li>用每 1 × 10⁶ 个细胞加入 2 mL 平衡缓冲液洗涤细胞7 总细胞数，然后在500 x g 4°C 下 10 分钟</li>
			<li>移去上清液，使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将细胞重悬至最多 1 x 107 2 mL 平衡缓冲液中的总细胞数。如果超过 107 如有细胞存在，按比例线性调整缓冲液体积。将细胞通过40 μm滤器，以防止细胞聚集体堵塞分离柱基质。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>磁分离：CD45+ 造血细胞
		<ol>
			<li>将分离柱置于合适分离器的磁场中，并用至少3 mL的PBS平衡柱子。</li>
			<li>收集流穿液（FT）中的未标记细胞，用 3 mL 平衡缓冲液洗涤柱子 3 次，每次洗涤液均与 FT 一同收集。从分离器上取下柱子，将其置于一个 15 mL 圆锥管上。</li>
			<li>冲洗磁标记的CD45+ 用移液管将5 mL平衡缓冲液加入柱中，并使用随柱提供的推杆 firmly 推动细胞。</li>
			<li>将洗脱液以及流穿液/洗涤组分在 500 x g使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>磁性标记与分离：CD31+ 内皮细胞
		<ol>
			<li>重复 CD45 实验步骤+ 磁性标记与分离（第2.3.2–2.3.3节），但使用CD31+ 磁珠用于与CD45的FT和洗涤组分孵育+ 分离</li>
		</ol>
		</li>
		<li>磁性标记与分离：MEFSK4+ 成纤维细胞
		<ol>
			<li>重复 CD45 实验步骤+ 使用MEFSK4抗饲养层-APC抗体替代磁珠进行磁性标记。离心CD31的FT和洗涤部分+ 500 × g 离心分离 g 5 分钟后，去除上清液。将细胞沉淀重悬于 1 mL 平衡缓冲液中，使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
			<li>每 1 × 10⁶ 细胞加入 10 µL MEFSK4 抗饲养层-APC 抗体7 细胞。在 4 °C 下孵育至少 15 分钟。</li>
			<li>洗涤MEFSK4抗体结合的细胞，每1 x 10⁶个细胞加入5 mL平衡缓冲液7 总细胞数，然后在500 x g 5 分钟。</li>
			<li>移除上清液，加入与所用MEFSK4抗饲养层-APC抗体相同体积的抗-APC磁珠，重悬细胞。在4 °C条件下冰浴孵育15分钟。</li>
			<li>以 500 x g 离心 g 10分钟。弃上清，每1 × 10⁶细胞加入2 mL平衡缓冲液重悬7 总细胞，并按照前文所述方法进行磁分离（第2.3.3节）。磁分离后的MEFSK4阳性CD45阴性/CD31阴性 成纤维细胞可用于纯度分析及其他下游应用。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 分离的成纤维细胞群体的纯度和功能分析
<ol>
	<li>FACS 群体纯度分析：αSMA-GFP 细胞分析（图 2）
	<ol>
		<li>将新鲜分离的细胞重悬于 25 µL Fc 封闭液中，以防止抗体非特异性结合。室温孵育 5 分钟。</li>
		<li>可选：向细胞悬液中加入 25 µL 7AAD 或 Ghost dye violet 510。冰上避光孵育 30–60 分钟。</li>
		<li>用 1 mL FACS 缓冲液重悬洗涤。在 500 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
		<li>将沉淀重悬于 50 µL FACS 缓冲液中。直接向细胞悬液中加入 CD31-PE、CD45-APC 和 AN2/NG2 抗体。冰上孵育 15 分钟（表 1）。</li>
		<li>用 1 mL FACS 缓冲液重悬洗涤。在 400 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
		<li>向使用未偶联一抗标记的细胞中加入驴抗大鼠 AlexaFluor 405 二抗。冰上孵育 30 分钟。</li>
		<li>用 1 mL FACS 缓冲液重悬洗涤。在 400 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
		<li>将沉淀重悬于推荐的流式细胞术样本体积的 FACS 缓冲液中（300 µL），转移至标记好的流式管中进行流式分析。 
		注：分离的成纤维细胞中 MEFSK4 抗原表达的 FACS 分析详见第 3.3 节。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成纤维细胞纯度分析：免疫荧光（图 3A）
	<ol>
		<li>将每孔 30,000 个原代成纤维细胞（P0-P1）接种于置于 24 孔板中的盖玻片上，培养至融合度达 80%。或者，通过细胞离心涂片仪在 400 × g 条件下将分选后的 CD45+ 和 CD31+ 细胞（每孔 30,000 个细胞）浓缩并直接、均匀地沉积于 24 孔板中的盖玻片上。</li>
		<li>用冷丙酮固定细胞 15 分钟。用 PBS 洗涤 3 次。</li>
		<li>用 10% 山羊血清封闭载玻片。载玻片与一抗在 4°C 过夜孵育（表 2）。</li>
		<li>用 PBS 洗涤载玻片 3 次。加入二抗孵育 2 小时（表 2）。</li>
		<li>对载玻片进行复染，并用含一滴 DAPI 的抗荧光淬灭封片剂封片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FACS 群体纯度分析：MEFSK4 探测（图 3B）
	<ol>
		<li>将新鲜分离的细胞重悬于 25 µL FC 封闭液中，以防止抗体非特异性结合。室温孵育 5 分钟。</li>
		<li>可选：向细胞悬液中加入 25 µL 7AAD 或 Ghost dye violet 510。冰上避光孵育 30–60 分钟。</li>
		<li>用 1 mL FACS 缓冲液重悬洗涤。在 500 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
		<li>将沉淀重悬于 50 µL FACS 缓冲液中。直接向细胞悬液中加入 MEFSK4 抗体。冰上孵育 15 分钟（表 1）。</li>
		<li>用 1 mL FACS 缓冲液重悬洗涤。在 400 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
		<li>向细胞中加入大鼠 IgG-APC（表 1）。冰上孵育 30 分钟。</li>
		<li>用 1 mL FACS 缓冲液重悬洗涤。在 400 × g 条件下离心 5 分钟。</li>
		<li>将沉淀重悬于推荐的流式细胞术样本体积的 FACS 缓冲液中（300 µL），转移至流式管中进行流式分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成纤维细胞纯度分析：半定量实时 RT-PCR（图 3C）
	<ol>
		<li>RNA 提取与半定量实时 PCR</li>
		<li>在完成成纤维细胞富集后，使用 RNA 提取试剂盒（见 材料表）提取 RNA，并遵循制造商说明书操作。</li>
		<li>使用 cDNA 合成试剂盒（见 材料表）完成第一链 DNA 合成，并遵循制造商说明书操作。</li>
		<li>进行半定量实时 PCR5。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成纤维细胞功能分析：胶原凝胶收缩实验（图 4）
	<ol>
		<li>胶原溶液
		<ol>
			<li>在 DMEM 中配制 20 mM HEPES 和 44 mM NaHCO3。每 1 mL 含 HEPES 和 NaHCO3 的 DMEM 中加入 1.67 mg I 型大鼠胶原。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>含 TGFβ 的 DMEM
		<ol>
			<li>在 DMEM 中配制 10% FBS，并添加抗生素和抗真菌剂。加入 TGFβ 至终浓度为 1 ng/mL。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>细胞/胶原混合物制备与铺板
		<ol>
			<li>制备细胞悬液（P3-P5），并计算获得 3.3 × 105 个细胞所需的体积。</li>
			<li>将含 3.3 × 105 个细胞的悬液加入适量胶原溶液中，使总体积达到 1 mL。 
			注：此时 I 型大鼠胶原浓度应为 1.5 mg/mL。</li>
			<li>在 48 孔板中，每孔接种 300 µL 细胞-胶原混合物（约 1 × 105 个细胞/孔）。37 °C 孵育 15–20 分钟，直至形成凝胶。</li>
			<li>使用 30 G 针头帮助将凝胶从孔壁分离。每孔加入 600 µL 含 TGFβ 和 FBS 的 DMEM。在 24 小时和 48 小时时使用反射式扫描仪成像。 
			注：所有免疫荧光实验均在配备三种激光器（405 nm、488 nm 和 640 nm）的流式细胞仪上进行。数据采集使用流式数据采集软件（材料表）。进一步的数据分析使用流式数据分析软件完成。AlexaFluor 405 和 Ghost Dye Violet 510 由 405 nm 激光激发，分别通过 450/50 BP 和 525/50 BP 滤光片收集。GFP 和 PE 由 488 nm 激光激发，分别通过 530/30 BP 和 575/26 BP 滤光片收集。APC 或 AlexaFluor 647 由 640 nm 激光激发，通过 670/14 BP 滤光片收集。所有细胞分选实验均在配备四种激光器（405 nm、488 nm、561 nm 和 640 nm）的流式细胞仪（材料表）上进行。7-AAD 使用 561 nm 激光激发，通过 670/14 BP 滤光片收集。GFP 和 Ghost Dye Violet 510 使用与上述相同的激光/滤光片组合进行检测。所有分选实验均采用 100 µm 喷嘴和 17 psi 压力设置，以提高目标细胞后续培养的存活率。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

成纤维细胞是一类具有异质性的细胞，可通过多种标志物进行鉴定。已用于鉴定成纤维细胞的蛋白标志物包括盘状结构域受体2（DDR2）、纤连蛋白、波形蛋白、I型和III型胶原以及Thy115,16,17,18,19,20。其中，波形蛋白可用于鉴定未受损状态下静息的心脏成纤维细胞，而成纤维细胞特异性蛋白1、αSMA和periostin则可用于识别损伤诱导的活化成纤维细胞，其中αSMA是检测活化成纤维细胞最常用的标志物6,12,21。此外，Tcf21和MEF2K4蛋白近年来也...

心脏成纤维细胞是一类起源于间充质的细胞，在维持心脏电传导和机械力方面发挥重要作用，同时在稳态条件下维持心脏结构1。在心脏损伤后，这些细胞被激活、增殖，并产生细胞外基质（ECM）蛋白2。许多临床前研究揭示，成纤维细胞是维持受损心脏结构完整性的关键细胞调节者3，同时也是导致细胞外基质蛋白不受控制地生成和沉积的主要效应细胞，最终引起僵硬瘢痕形成和心力衰竭4。成纤维细胞是一类异质性细胞群体，这使得区分其修复性功能与促纤维化的不良适应特性变得具有挑战性。近期研究已明确心肌损伤后两种不同成纤维细胞亚型的功能异质性，提示有可能分离出不同的成纤维细胞亚型，并研究其在伤口愈合中的作用5。
获得纯的成纤维细胞群体对于明确其在修复和纤维化中的功能作用至关重要。然而，由于多种成纤维细胞标志物也会识别其他细胞类型，因此难以分离出高度纯化的成纤维细胞群体6。已有若干精巧的研究设计出有效方法，用于从无损伤和受损心肌组织中分离心脏成纤维细胞。其中最常用且最为成熟的方法是通过酶消化组织后，利用选择性贴壁法富集成纤维细胞7。
此外，已有研究成功描述了基于细胞表面抗原对成纤维细胞进行荧光激活细胞分选（FACS）的方法8。在该研究中，经过酶消化后，从小鼠心脏中分选出间充质细胞，其表型为谱系阴性（Lin: Ter119−CD45−CD31−）且gp38阳性（gp38+）。通过检测这些细胞共表达col1α1及其他间充质标志物，证实gp38+ve细胞即为成纤维细胞。尽管大多数组织消化过程可在培养皿中解剖出心室后完成，但最近一项研究探索了通过直接针头酶灌注左心室来分离心肌细胞和包括成纤维细胞在内的非心肌细胞的方法9。在此情况下，成纤维细胞随后通过选择性贴壁法进行分离。
本方案描述了使用三种方法分离和富集成纤维细胞。第一种是已建立的方法，即在酶消化后利用成纤维细胞的选择性贴壁特性进行分离。第二种方法主要用于分离损伤诱导的表达α-平滑肌肌动蛋白的肌成纤维细胞。第三种方法涉及对酶消化后的心脏细胞悬液，依次通过磁性去除造血细胞和内皮细胞。在去除这些细胞后，利用磁珠根据抗原MEFSK4的存在来分离成纤维细胞/肌成纤维细胞。最近，MEFSK4被描述为静息态和活化态成纤维细胞均表达的抗原，使其成为成纤维细胞鉴定与分离的合适标志物。当然，此处描述的所有方法均有其独特的局限性。因此，强烈建议通过流式分析、免疫染色和半定量实时PCR检测所分离细胞群体的纯度。然而，这些方法可进一步拓展，并可在将成纤维细胞和肌成纤维细胞群体用于关键实验之前，加入其他标志物以排除其他污染细胞群体。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗真菌剂（两性霉素B溶解型；Fungizone）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9528</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸盐缓冲液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>胶原酶混合液（Liberase Blendzyme 3 TH）</td><td>Roche Applied Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>双蒸水（DDI water）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>去离子水（DI water）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>含L-谷氨酰胺和HEPES的DMEM-F12培养基</td><td>Life technologies</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I（20U/mL）</td><td>BioRad</td><td>7326828</td><td></td></tr><tr><td>不含Ca²⁺和Mg²⁺的杜氏磷酸盐缓冲液（dPBS）</td><td>Gibco</td><td>13190-144</td><td></td></tr><tr><td>70%乙醇</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FC阻断剂（纯化抗小鼠CD16/CD32）</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Life technologies</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>10%山羊血清</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>含Ca²⁺和Mg²⁺的Hank's平衡盐溶液（HBSS）</td><td>Corning</td><td>21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-Ci</td><td></td></tr><tr><td>Krebs-Henseleit缓冲液粉末</td><td>Sigma</td><td>K3753</td><td></td></tr><tr><td>支原体预防剂（Plasmocin）</td><td>Invivogen</td><td>ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>1×磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10×红细胞裂解缓冲液</td><td>Miltenyi</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>Slow-fade封片剂</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TGF&amp;beta;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝染液（0.4%）</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ⅰ型大鼠胶原蛋白</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7AAD（储备液：DMSO中1 mg/mL溶液）</td><td>Molecular Probes</td><td>A1310</td><td>稀释比例 = 1:1000；RRID =</td></tr><tr><td>CD45-APC</td><td>BD Bioscience</td><td>559864</td><td>稀释比例 = 1:200；RRID = AB_398672</td></tr><tr><td>CD31-PE</td><td>BD Bioscience</td><td>553373</td><td>稀释比例 = 1:200；RRID = AB_394819</td></tr><tr><td>CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>稀释比例 = 1:250；RRID = AB_394816</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>553076</td><td>稀释比例 = 1:250；RRID = AB_394606</td></tr><tr><td>COL 1&amp;alpha;1</td><td>MD Bioproducts</td><td>203002</td><td>稀释比例 = 1:1000；RRID =</td></tr><tr><td>Ghost dye violet 510（配制：DMSO中1 μL/测试）</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>13-0870</td><td>稀释比例 = 1:1000；RRID =</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11029</td><td>稀释比例 = 1:200；RRID = AB_138404</td></tr><tr><td>山羊抗兔Cy3</td><td>Southern Biotech</td><td>4050-02</td><td>稀释比例 = 1:200；RRID = AB_2795952</td></tr><tr><td>山羊抗兔FITC</td><td>Jackson Immunoresearch Laboratories</td><td>711-165-152</td><td>稀释比例 = 1:200；RRID = AB_2307443</td></tr><tr><td>山羊抗大鼠Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11006</td><td>稀释比例 = 1:200；RRID = AB_2534074</td></tr><tr><td>山羊抗大鼠Alexa Fluor 647</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A21247</td><td>稀释比例 = 1:200；RRID = AB_141778</td></tr><tr><td>Periostin</td><td>Santa Cruz</td><td>SC67233</td><td>稀释比例 = 1:100；RRID = AB_2166650</td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V2258</td><td>稀释比例 = 1:200；RRID = AB_261856</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-平滑肌肌动蛋白（&amp;alpha;SMA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2547</td><td>稀释比例 = 1:1000；RRID = AB_476701</td></tr><tr><td>成纤维细胞特异性蛋白1（FSP1）</td><td>Millipore 07-2274</td><td>07-2274</td><td>稀释比例 = 1:100；RRID = AB_10807552</td></tr><tr><td>CD45磁珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>CD31磁珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-087-418</td><td></td></tr><tr><td>抗饲养细胞-APC（MEFSK4）</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-900</td><td>稀释比例 = 1:100；RRID = AB_2660619</td></tr><tr><td>抗-APC磁珠</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>大鼠IgG-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-103-034</td><td>稀释比例 = 1:100；RRID = AB_2661598</td></tr><tr><td>驴抗大鼠Alexa Fluor405</td><td>Abcam</td><td>ab175670</td><td>稀释比例 = 1:100</td></tr><tr><td>抗-AN2/NG2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-455</td><td>稀释比例 = 1:11；RRID = AB_2651235</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;其他材料&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m滤器</td><td>Thermo Scientific</td><td>723-2520</td><td></td></tr><tr><td>10 cm²细胞培养皿</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>10 mL移液管</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m细胞筛</td><td>Fisherbrand</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>5 mL移液管</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>50 mL锥形管</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>6孔板</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞术管</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>摇床</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>单刃刀片</td><td>PAL</td><td>62-0177</td><td></td></tr><tr><td>手术剪</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP-&amp;alpha;SMA报告基因小鼠</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS分选仪磁铁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS分离柱</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qaigen RNeasy Mini Kit</td><td>Qaigen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>BioRad iScript cDNA合成试剂盒</td><td>BioRad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>48孔板</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30G针头</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>三激光流式细胞仪（BD LSRFortessa）</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>四激光流式细胞仪（BD FACSAria III）</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>流式数据采集软件（BD FACSDiva Software v8.0a）</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>流式数据分析软件（FlowJo Software）</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

成年心脏成纤维细胞与肌成纤维细胞的分离与鉴定

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

心脏在受到损伤后发生的心肌纤维化是一种参与伤口愈合的生理反应。目前已有研究致力于探索并靶向能够减轻纤维化的成纤维细胞亚群。然而，由于缺乏普遍认可的可用于鉴定静息态和活化态成纤维细胞的特异性标志物，成纤维细胞的相关研究仍受到限制。成纤维细胞是一类异质性细胞群体，这使其难以被分离和鉴定。本方案介绍了三种不同的方法，用于从小鼠未受损和受损心脏中富集成纤维细胞和肌成纤维细胞。采用标准化且可靠的成纤维细胞分离方案，将有助于深入研究其在稳态维持以及纤维化调控中的作用。

利用αSMA-GFP报告小鼠展示肌成纤维细胞分离的流式设门方案 
在αSMA-GFP报告小鼠模型中，未受伤心脏未检测到可识别的GFP+细胞；因此，这些样本被用于在补偿后建立GFP通道背景信号的设门依据（图2）。αSMA+细胞根据心肌梗死（MI）后10天损伤左心室中GFP表达的存在情况进行分选。在损伤后的αSMA-GFP小鼠心脏中，少量内皮细胞（GFP+/CD31+细胞；SD = 3.8% ± 0.0164；n = 5）和造血系细胞（GFP+/CD45+细胞；SD = 3.18% ± 0.0112；n = 5）也表达GFP（图2A）。然而，GFP+/CD31-/CD45-细胞不表达周细胞标志物AN2。
未受伤（静息）和受伤（激活，αSMA+GFP+）细胞均表达成纤维细胞标志物 
通过免疫荧...

获得成纤维细胞的纯种群体对于研究其在伤口修复和纤维化中的作用至关重要。本文详细描述了一种从正常和损伤的小鼠心脏中分离成纤维细胞和肌成纤维细胞的方法，并通过免疫荧光、逆转录PCR（RTPCR）、荧光辅助细胞分选以及胶原凝胶收缩实验对细胞的纯度和功能特性进行表征。

损伤后的心脏纤维化是伤口愈合的一种生理反应。已有研究致力于探索并靶向成纤维细胞亚型，以……

该方案可让我们以较高纯度分离出静息状态和损伤诱导激活的成纤维细胞群体。该技术的主要优势在于其具有灵活的可改进性。无论是进行流式分析还是基于磁珠的分离，均可加入针对污染细胞的抗体，从而在分离目标细胞时排除这些杂质细胞。该技术主要用于心肌成纤维细胞的分离，但也可用于从其他组织中分离成纤维细胞。本次实验操作将由我实验室的本科实习生梅岭·梅尔策（Meiling Melzer）和研究助理大卫·贝耶（David Beier）进行示范。为在解剖过程中保存六颗心脏，准备六孔板：向每孔加入两毫升冷KHB，并将板置于冰上。用70%乙醇喷洒动物体表，调整其方向，使腹面朝向实验操作者。固定附肢以防止干扰。在不刺穿肝脏的情况下，切开腹部的皮肤和肌肉。沿胸骨方向垂直剪开，小心打开胸腔，避免刺穿心脏。接下来，继续切开肋骨以暴露心脏。用镊子轻轻将心脏从胸腔中提起，剪除附着在心脏外表面的任何肺组织或多余组织。分离左心室。每次解剖时，将心室置于六孔板的单独孔中。首先用镊子在KHB溶液中反复挤压并搅动心室，以去除多余的血液。然后将心室转移至一个洁净、无菌的10厘米见方的培养皿中。接着，使用单刃刀片将心室迅速切成小块。加入1毫升胶原酶消化液，并继续切碎。当组织块足够小，可用1毫升微量移液器转移时，将其转移至50毫升锥形管中。用两毫升的混合液洗涤平板两次，并将洗涤液转移至离心管中。将离心管孵育30分钟，然后按照文中的描述，使用5毫升移液管重悬细胞。初次重悬后，将细胞孵育15分钟，再使用10毫升移液管再次重悬。然后，将一个40微米的细胞筛置于新的50毫升锥形管上，并用1至2毫升KHB润湿细胞筛以预处理筛子。向消化悬液中加入25毫升KHB，重悬细胞。将悬液通过细胞筛过滤，必要时更换新的细胞筛。将滤液在 400 × g 和 4 °C 条件下离心 10 分钟。弃去上清液，并用 1× 红细胞裂解缓冲液重悬沉淀，每颗心脏使用 5 毫升缓冲液。室温孵育悬浮液 2 分钟后，在室温下以 400 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，然后将沉淀重悬于1毫升KHB中。接着，向悬液中加入9毫升KHB。将悬液通过预润湿的40微米细胞筛网过滤至新的50毫升锥形管中。在室温下，以400 × g离心锥形管10分钟。最后，弃去上清液，并将沉淀物重悬于1毫升成纤维细胞培养基或PBS中。在确定细胞数量后，可通过文中所述的三种不同方法从悬液中分离成纤维细胞。开始通过差速贴壁法进行分离时，向六孔板的每个孔中加入两毫升成纤维细胞培养基。轻轻晃动培养板，使培养基覆盖孔底。如果小鼠心脏细胞悬浮于磷酸盐缓冲液（PBS）中，则离心后将每颗心脏的细胞重悬于一毫升成纤维细胞培养基中。向每个孔中加入一毫升细胞悬液，相当于一个心脏的量。轻轻摇晃培养板以均匀分布细胞。每孔再额外加入一至二毫升成纤维细胞培养基，使每孔总体积达到最多四毫升。在37摄氏度下孵育四小时。由于成纤维细胞会选择性地贴壁于孔板，因此可通过移除并弃去培养基来分离细胞。用两毫升磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤剩余贴壁的细胞，然后每孔加入二至四毫升无菌成纤维细胞培养基。在37摄氏度下孵育至细胞融合，每两到四天更换一次培养基。为开始磁性标记和分离CD45阳性造血细胞，将小鼠心细胞悬液在500 × g下离心5分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1毫升平衡缓冲液中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。再次离心细胞后，将细胞沉淀重悬于平衡缓冲液中。加入CD45阳性磁珠，并充分混匀。在 4 摄氏度下孵育至少 15 分钟。加入平衡缓冲液，在 4 摄氏度下以 500 ×g 离心 10 分钟，洗涤细胞。去除上清液，使用血细胞计数板对细胞进行计数。将沉淀重悬于平衡缓冲液中。将悬液通过40微米滤器，以防止细胞聚集物堵塞分离柱。接着，将分离柱置于合适分离器的磁场中，并用至少3毫升PBS平衡分离柱。将细胞悬液倒入柱中，收集流出液，其中含有未标记的细胞，收集至15毫升锥形管中。用3毫升平衡缓冲液洗涤柱子三次，并将洗涤液与流出液合并。从分离器上取下柱子，将其置于15毫升锥形管上。为洗脱标记的CD45阳性细胞，用移液器将5毫升平衡缓冲液加入柱中，并牢固地推动柱芯。将洗脱液管和流穿液管在500 × g条件下离心。使用血细胞计数板对细胞进行计数。为完成分离，需遵循文稿中关于 CD31 阳性内皮细胞和 MEFSK4 阳性成纤维细胞的操作步骤，这些步骤与 CD45 阳性细胞的分离方案类似。在心肌梗死后，从 α-SMA-GFP 小鼠心脏中分离单个细胞，并对其进行荧光激活细胞分选。一个典型的设门方案显示了 GFP 阳性细胞共同表达 CD31、CD45 或 AN2 的情况。在损伤的小鼠心脏中，仅有少量内皮细胞和造血细胞表达GFP。然而，GFP阳性/CD31阴性/CD45阴性细胞不表达周细胞标志物AN2。GFP阳性细胞表达α-SMA、胶原蛋白一型α一链、periostin和波形蛋白。通过选择性黏附分离的未损伤成纤维细胞表达波形蛋白（vimentin），但不表达α-平滑肌肌动蛋白（alpha-SMA）、periostin 或 I 型胶原α1链（collagen one alpha one）。未损伤成纤维细胞和活化成纤维细胞均表达MEFSK4抗原。通过选择性黏附分离的未损伤成纤维细胞，以及从α-SMA-GFP小鼠中分离并分选的肌成纤维细胞，均表现出收缩胶原的能力。在孵育前必须彻底剪碎组织。在进行磁珠分离之前，必须将细胞悬液通过40微米滤网，以防止细胞聚集。通过本方法纯化的细胞可进一步使用与周细胞特异性抗体结合的磁珠进行纯化，以确保较高的纯度。随着新型珠连抗体以及报告基因转基因小鼠的出现，人们可以利用这些技术分离并研究不同的细胞群体，而不仅仅是成纤维细胞。

isolation-characterization-adult-cardiac-fibroblasts

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

成人心脏纤维细胞和肌纤维细胞的分离与表征

成年心肌细胞是从动物心脏中分离并可培养数天的原代细胞。在此培养期间，可利用腺病毒基因转导表达基因编码的生物传感器（GEBs）或荧光融合蛋白。这两种方法均可通过共聚焦显微镜进行细胞水平的研究。...

成年心肌细胞的分离与遗传操作用于共聚焦成像

本文介绍了使用兰格多夫灌流系统分离成年小鼠心肌细胞的方法。所获得的细胞具有钙耐受性，电生理静息，并可进行培养，以及利用腺病毒或慢病毒感染来调控基因表达。此外，还可利用MMSYS系统和膜片钳技术分析其功能特性。...

成年小鼠心肌细胞的分离、培养与功能表征

从人类肌肉中获得的主要贴壁细胞类型为成肌细胞和成纤维细胞。本实验通过基于CD56抗原的磁性激活细胞分选技术对细胞群体进行富集。随后使用特异性抗体进行免疫标记，并结合图像分析技术，实现对单个细胞胞质和细胞核特征的定量分析。...

人骨骼肌中初级成肌细胞和成纤维细胞的分离与定量免疫细胞化学表征

我们介绍一种用于培养具有肌成纤维细胞表型的小鼠和人食管间质细胞原代培养物的实验方案。培养的细胞呈梭形形态，表达α-SMA和波形蛋白（vimentin），且不表达上皮细胞、造血细胞和内皮细胞的表面标志物。经鉴定的间质细胞可用于上皮-间质相互作用的功能研究。...

从小鼠和人类食管中分离肌成纤维细胞

成纤维细胞的行为涉及一系列临床疾病实体，但由于其内在的异质性，这些行为仍缺乏充分表征。传统的成纤维细胞研究依赖于体外（in vitro）操作，掩盖了其在体（in...

通过FACS分离小鼠皮肤成纤维细胞

已开发并描述了多种从大鼠心脏中分离不同心肌细胞类型的方案。本文介绍了一种优化的方案，可从单次制备中分离出高质量的主要心肌细胞类型（心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞），从而降低实验成本。...

从成年大鼠心脏中同时分离高质量心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞

本文介绍了一种成年大鼠心室心肌细胞（ARVC）的分离与培养方案。分离得到的ARVC可用于短期和长期培养。ARVC的分离与培养在开发心脏疾病新治疗方法方面具有重要作用。...

成年大鼠心肌细胞的分离与培养

本文介绍了一种经过优化的基于兰根多夫（Langendorff）系统的分离方法，用于从与代谢综合征相关且射血分数保留的心力衰竭大鼠模型中分离单个心房心肌细胞。通过手动调节心脏腔室的管腔内压力，可获得功能完整的肌细胞，适用于兴奋-收缩耦联研究。...

从代谢综合征相关射血分数保留型心力衰竭大鼠模型中分离心房心肌细胞

我们介绍一种简单、快速且可靠的原代成年成纤维细胞分离方案，初学者（例如学生）也可操作。该方法结合了酶消化组织与超声波机械振荡，以获取原代成纤维细胞。本方案可轻松根据特定实验需求进行调整（例如用于人体组织）。...

超声增强的成年成人原代成纤维细胞分离

本文描述了一种从单个成年小鼠心脏的心房和心室同时分离心肌细胞和非心肌细胞的方法。该方案可稳定获得高活力的心肌细胞和非心肌细胞，并详细说明了适用于细胞表型鉴定和体外分析的优化细胞特异性培养条件。...

成年小鼠心脏中同时分离与培养心房心肌细胞、心室心肌细胞及非心肌细胞

已开发并应用于成年小鼠心脏的一种优化的组织透明化方法。该方法旨在清除致密且具有自发荧光的心肌组织，同时保留由遗传报告基因策略标记的成纤维细胞的荧光信号。...

基于CLARITY优化的组织透明化技术用于小鼠健康与损伤心脏中三维成纤维细胞结构的研究

学习从小鼠心脏中分离高纯度成纤维细胞和肌成纤维细胞的方法，用于研究伤口愈合和纤维化机制。该技术结合免疫荧光、RT-PCR和流式细胞分选进行细胞表征，可应用于心脏组织修复生物学研究。

成年心脏成纤维细胞与肌成纤维细胞的分离与鉴定

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