Name: 在Vivo羟基基蛋白足迹研究卡诺哈布迪特人的蛋白质相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 了解活体快速光化学氧化蛋白质技术，利用微流控系统和质谱分析秀丽隐杆线虫体内蛋白质相互作用。该方法成功修饰545种蛋白质，为研究蛋白质结构与功能提供重要工具。

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本工作获得了马里兰大学巴尔的摩分校的启动资金以及授予LMJ的美国国立卫生研究院（NIH）1R01 GM 127595项目的资助。作者感谢Daniel Deredge博士在修改手稿过程中提供的帮助。

1. C. elegans 的培养与保种
<ol>
	<li>按照标准实验室操作规程，将线虫群体培养并同步至其第四幼虫期（L4 阶段）8。</li>
	<li>进行 IV-FPOP 实验当天，用 M9 缓冲液（0.02 M KH2PO4、0.08 M Na2HPO4、0.08 M NaCl、1 mM MgSO4）将 L4 期线虫从细菌菌苔（OP50 E. coli）上冲洗下来。</li>
	<li>每份 IV-FPOP 样品取约 10,000 条线虫，分装为 500 µL 的等分试样。</li>
</ol>
2. 微流控流动系统组装
<ol>
	<li>通过切割一段2 cm长的氟化乙烯丙烯（FEP）管（外径1/16英寸，内径0.020英寸）开始组装流动系统。</li>
	<li>使用洁净的解剖针，仅在一端扩大FEP管的内径，形成一个约50 mm长的小型凹坑。该凹坑应足够大，以容纳两段外径为360 µm的熔融石英毛细管。 
	注意：不要扩大另一端，因为该端仅用于安装出口毛细管。</li>
	<li>使用陶瓷切割器，切割两段内径为250 µm、长度为15 cm的熔融石英管。这两段将作为流动系统的进样管线。</li>
	<li>使用自粘胶带将两根内径为250 µm的毛细管并排固定，确保它们彼此平行且末端完全对齐。 
	注意：为确保熔融石英管切割后末端未被压碎、保持平直且完全对齐，建议使用放大镜或体视显微镜进行检查。</li>
	<li>将两根已用胶带固定的毛细管插入FEP管的手工凹坑中，推至凹坑边缘处。 
	警告：为保持流动系统的有效性，请勿将毛细管推过手工凹坑（图1a）。</li>
	<li>在洁净表面上滴一小点环氧树脂，并用解剖针混合均匀。</li>
	<li>迅速使用同一根针将少量树脂滴加在进样毛细管与FEP管连接处，并将出口端朝上悬挂数分钟，使树脂干燥（图1a）。</li>
	<li>在树脂干燥固定FEP管与两根毛细管的同时，切割一段新的内径为250 µm的毛细管。该毛细管将作为流动系统的出口毛细管。其所需长度可通过以下公式计算： 
	<img alt="流速公式，流体动力学方程，数学表达式" src="/files/ftp_upload/60910/60910eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式1"> 
	其中ℓ为待切割毛细管的长度（单位：厘米），t为期望的反应时间（单位：分钟），f为流速（单位：mL/min），i.d.为毛细管内径（单位：厘米）。 
	注意：切割出口毛细管后，应检查其末端是否平直且未被压碎。</li>
	<li>待树脂完全干燥后，将新的毛细管从FEP管的出口端穿入。出口毛细管与两根进样毛细管的内端应在FEP管内部完全对齐，从而形成混合T型接头（图1b）。</li>
	<li>按照步骤2.6和2.7所述方法，使用新鲜环氧树脂将出口毛细管与FEP管进一步固定。</li>
	<li>让树脂过夜干燥，以牢固结合整个流动系统。次日即可搭建微流控流动系统（图1c）。</li>
</ol>
3. 体内FPOP的微流控流动系统
<ol>
	<li>在一支5 mL注射器内放入四个磁力搅拌子。该注射器即作为样品注射器。这些磁力搅拌子可防止线虫在IV-FPOP过程中沉降于注射器内图 2A).</li>
	<li>用M9培养基填充两支5 mL注射器。确保每支注射器内无气泡，因为气泡可能影响流速和混合效率。</li>
	<li>将鲁尔接头适配器连接至每支5 mL注射器上，确保用手拧紧并牢固固定。</li>
	<li>将每个注射器连接至一个3-2阀。注射器应连接至阀门的中间端口。图2B).</li>
	<li>将每个5 mL注射器固定到双通道注射泵上，并调节机械止动环，以防止推块对注射器施加过大的压力。在设置止动环位置时，需考虑磁力搅拌子的占用空间。</li>
	<li>使用无螺纹超级螺母、FEP 套管和无螺纹超级卡套环，将自制微流控流动系统的每根灌注毛细管末端连接至每个 3-2 阀的顶部接口图2B).</li>
	<li>将一根10 cm的管子连接至三通二位阀（底端端口）剩余的开口端 450 µm 使用无肩超细螺母、FEP套管和无肩超细卡套的皮下毛细管（图2B这些毛细管将成为用于吸取样品的毛细管。</li>
	<li>启动泵流，并检查微流控流动系统的所有连接处是否存在可视泄漏。使用实验流速至少推动三倍注射器体积的液体。最终流速取决于激光照射窗口、激光频率以及零排除分数体积。 
	注意：本方案中，最终流速为 375.52 µL/min 从2.55 mm的激光照射窗口计算得出， 250 µm 内径熔融石英，零排阻分数，50 Hz频率。
	<ol>
		<li>流路由3-2阀手柄上的箭头标示。通过将阀手柄从排出位置切换至吸入位置，可手动重新填充每支注射器。 
		注意：3-2 阀门处的泄漏可通过重新拧紧无扩口螺母或更换阀门连接部件（无扩口螺母、FEP 套管或无扩口卡套）来修复。混合 T 接头处的泄漏则需要重新组装微流控流动系统（步骤 2.1 至 2.11）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将微流控流动系统移至实验台，并使用固定装置将出口毛细管固定在辐射台上 360 µm o.d. 不锈钢接头（图2C，D).</li>
	<li>使用长柄打火机灼烧激光辐照窗口处的熔融石英涂层。用无尘纸和甲醇清洁灼烧后的涂层。 
	注意：交替进行灼烧循环和甲醇清洗循环，以避免毛细管过热，过热可能导致毛细管熔化和/或断裂。</li>
	<li>将磁力搅拌器模块置于装有磁力搅拌子的5 mL注射器上方。调节磁力搅拌器模块的速度和位置，使5 mL注射器内的磁力搅拌子缓慢而持续地旋转。</li>
</ol>
4. 体内FPOP
<ol>
	<li>打开KrF准分子激光器，并让引燃管预热。 
	警告：该激光器发射波长为248 nm的可见和不可见辐射，可能对眼睛造成损伤。在打开激光器和开启光束出口窗口之前，应佩戴适当的护目镜。</li>
	<li>将光学传感器置于光束出口窗口处，在50 Hz频率下至少测量100个脉冲的激光能量。 
	注：本实验方案使用2.55 mm的辐照窗口，激光能量为150 ± 2.32 mJ。</li>
	<li>获取约10,000条线虫（500 µL），并手动将样品吸入样品注射器中。</li>
	<li>向样品注射器中加入2.5 mL M9缓冲液，使最终样品体积达到3 mL。确保样品注射器中未引入气泡。</li>
	<li>向第二个注射器中加入3 mL 200 mM H2O2，同样确保注射器中未引入气泡。</li>
	<li>在出口毛细管末端放置一个用铝箔包裹的15 mL锥形管，内含6 mL 40 mM N’-二甲基硫脲（DMTU）、40 mM N-叔丁基-α-苯基亚硝基叔胺（PBN）和1%二甲基亚砜，分别用于淬灭过量的H2O2、羟基自由基，并抑制甲硫氨酸亚砜还原酶活性。</li>
	<li>通过软件窗口启动准分子激光器，等待第一个脉冲发出后，启动双注射器的样品流动。 
	注：样品应在三种条件下进行检测，每种条件设生物学重复两次，技术重复三次：激光辐照加H2O2（样品组）、无激光辐照加H2O2、无激光辐照无H2O2（对照组），每组生物学样本共9个样品。</li>
	<li>将全部样品收集至15 mL试管中，同时密切观察样品流路是否存在可视泄漏，因为样品注射器有时会产生一定的反向压力。</li>
	<li>IV-FPOP反应完成后，以805 × g离心2分钟收集线虫沉淀。去除淬灭液后，加入250 µL裂解缓冲液（8 M尿素、0.5% SDS、50 mM HEPES、50 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM苯甲基磺酰氟[PMSF]）。将样品转移至洁净的微量离心管中，迅速冷冻后于-80 °C保存，直至进行样品消化处理。</li>
</ol>
5. 蛋白质提取、纯化与蛋白水解
<ol>
	<li>将冻存样品置于冰上解冻，超声处理10秒后，在冰上孵育60秒。可能需要进行多轮超声处理，可通过取2 µL样品滴加到载玻片上，在体视显微镜下观察匀浆情况。当观察到无或仅有极小的线虫碎片时，表明样品已充分匀浆。</li>
	<li>在4 °C条件下，以400 × g 离心匀浆后的样品5分钟，收集上清液至洁净的微量离心管中。</li>
	<li>根据制造商说明书，使用二辛可宁酸法（BCA法）测定样品的蛋白质浓度。 
	注意：可选用任何合适的生化蛋白质浓度测定方法。需注意所选试剂与裂解缓冲液（8 M 尿素、0.5% SDS、50 mM HEPES、50 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM PMSF）的兼容性。必要时可对缓冲液进行稀释。</li>
	<li>从每个样品中取100 µg蛋白质，置于洁净的微量离心管中。</li>
	<li>加入二硫苏糖醇（DTT），使终浓度为10 mM，以还原所有样品中的二硫键。涡旋混匀，短暂离心后，在50 °C孵育45分钟。</li>
	<li>将样品在室温下冷却10分钟。</li>
	<li>加入碘乙酰胺（IAA），使终浓度为50 mM，以烷基化还原后的残基。涡旋混匀，短暂离心后，避光于室温孵育20分钟。</li>
	<li>烷基化完成后立即加入4倍体积的预冷100%丙酮沉淀蛋白质，并在-20 °C过夜孵育。</li>
	<li>次日，于16,000 × g 离心10分钟收集蛋白沉淀。用90%丙酮洗涤沉淀，弃去上清液，让沉淀干燥2–3分钟。</li>
	<li>将蛋白沉淀重悬于25 mM Tris-HCl缓冲液中（1 µg/µL）。加入胰蛋白酶，使蛋白酶与蛋白质的最终质量比为1:50（w/w），在37 °C过夜消化。</li>
	<li>次日，加入5%甲酸终止胰蛋白酶消化反应。 
	注意：进行LC-MS/MS分析（步骤6.1–6.5）时，每个样品至少需要0.5 µg肽段。按照制造商提供的方案，使用定量比色肽浓度测定法（见材料表）测定样品中肽段的浓度。</li>
</ol>
6. 高效液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）
<ol>
	<li>使用以下液相色谱流动相：含0.1%甲酸的水溶液（A）和含0.1%甲酸的乙腈溶液（B）。</li>
	<li>加载 0.5 µg 将肽段载样至捕获柱（180 µm × 20 mm）含C18（5 µm，100 Å）并用99% 溶剂A和1% 溶剂B洗涤样品15分钟 15 µL/min 流速</li>
	<li>使用自制填充柱（内径 0.075 mm × 长度 20 mm）并结合 C18 反相材料分离肽段5 μm，125 Å。</li>
	<li>采用以下分析分离方法：梯度以300 nL/min流速泵送120 min：0−1 min，3% B；2−90 min，10−45% B；100−105 min，100% B；106−120 min，3% B。</li>
	<li>使用高分辨率质谱仪，以正离子模式纳米电喷雾电离（nESI）进行肽段的数据采集。 
	注意：本实验方案采用超高效液相色谱（UPLC）联用高分辨质谱仪。数据采集采用数据依赖模式。MS1 的 m/z 扫描范围为 3750–1500，分辨率设为 60,000，动态排除时间为 60 s。选择电荷态为 +1 和 &gt;6个被排除。采用5.5e5的自动增益控制（AGC）目标值，最大注入时间为50 ms，强度阈值为5.5e4。用于MS2分析的离子经归一化碰撞能量为32%的高能碰撞解离（HCD）碎裂。碎片离子在检测器中以15,000分辨率和5.0e4 AGC目标值进行检测。</li>
</ol>
7. 数据分析
<ol>
	<li>使用自下而上的蛋白质组学分析软件，针对 C. elegans 数据库搜索串联质谱文件。</li>
	<li>设置蛋白质分析的搜索参数如下：允许一个胰蛋白酶漏切位点，肽段质荷比（m/z）范围为 375–1500，碎片离子质量容差为 0.02，前体离子质量容差为 10 ppm。将羧甲基化设为固定修饰，所有已知的羟基自由基侧链修饰9,10 设为可变修饰。肽段鉴定置信度设为 95%（中等），残基鉴定置信度设为 99%（高）。错误发现率（FDR）设为 1%。</li>
	<li>将数据导出至电子数据库，并使用以下公式11总结每个肽段或残基的氧化程度： 
	<img alt="求和公式 ΣEIC area modified/ΣEIC area；用于色谱结果分析图示。" src="/files/ftp_upload/60910/60910eq2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 2"> 
	注：其中 EIC area modified 指发生氧化修饰的肽段或残基的提取离子色谱面积（EIC），EIC area 指同一肽段或残基有或无氧化修饰的总色谱面积。</li>
</ol>

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</ol>

本文是为部分完成 JAE 博士学位论文而撰写。作者声明无利益冲突。

目前，研究体内蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的基准技术是荧光共振能量转移（FRET）。该技术最简单的形式是通过两个分子在彼此靠近时发生能量转移来研究PPI。15与质谱技术不同，FRET 无法在氨基酸水平上表征构象变化和相互作用位点。基于质谱的技术已越来越多地被用于蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的研究16IV-FPOP 是一种高分辨率蛋白质组学方法，可实现体内蛋白质结构分析 秀丽隐杆线虫 为了成功标记 秀丽隐杆线虫 通过IV-FPOP方法，正确组装微流控流动系统以减少样品损失至关重要。与内径较小的毛细管相比，内径为250 µm的毛细管已被证明可最大程度提高样品回收率4. 未测试内径更大的毛细管，但该微流控流动系统的设计采用与商用流式细胞仪分选系统相同内径的毛细管 秀丽隐杆线虫.17 线虫样本量也很重要，FPOP 前每样本少于约 10,000 条时，无法获得足以进行 LC-MS/MS 分析的蛋白质浓度。更高的样本量（&#62;10,000 条蠕虫）也可通过调整初始起始体积（步骤 4.5）来使用。
正确组装微流控流动系统至关重要。样品通路中的泄漏会导致线虫或 H2O2 流动不一致。只要在每次实验后进行适当清洗， ferrules、sleeves 和 3-2 阀门可在多次 IV-FPOP 实验中重复使用。然而，我们建议每次生物学重复实验均组装一套新的微流控流动系统。若微流控系统组装正确，线虫和 H2O2 将在混合 T 型接头处混合，并产生最小的反压。作为微流控流动系统的质量控制（QC），我们建议使用有色染料测试混合效率。在 IV-FPOP 过程中，需注意监测线虫注射器内磁力搅拌子的运动状态，若线虫注射器或混合 T 型接头处样品混合不当，可能导致反压并引发泄漏。此外，混合条件不佳会导致样品损失严重、线虫在激光窗口处的激光照射不充分以及系统堵塞。
C. elegans 的培养维护对于降低背景氧化至关重要。我们建议在低温和低应激条件下培养线虫，因为高温可能影响总体背景氧化水平。在所有体外自由基介导的蛋白质氧化探针实验（IV-FPOP）中，应设置仅含线虫、不含 H2O2 且无激光照射的对照样本组，以校正因实验室常规培养所导致的背景氧化。该技术目前的局限性之一在于所鉴定出的氧化修饰肽段总数以及每条肽段上发生氧化的残基数仍有限，从而限制了获取更高层次的蛋白质结构信息。尽管不推荐，但可通过使用更高浓度的过氧化氢来增加氧化修饰程度。然而，过氧化氢浓度升高可能显著干扰重要的生物学通路，并引发氧化诱导的蛋白质去折叠。若提高 IV-FPOP 中过氧化氢的浓度，建议检测线虫的存活率及背景氧化水平，因为浓度超过 200 mM 的条件尚未经过测试。
文中所述的LC-MS/MS方案可进行优化和调整，以满足其他实验室的质谱质量控制（MS QC）需求。已有研究表明，二维色谱（2D-chromatography）技术可提高对氧化修饰肽段和蛋白质的鉴定能力18。然而，不建议使用针对特定目标蛋白的蛋白质富集技术，包括但不限于抗体沉淀或pull-down实验。这些技术可能因IV-FPOP导致蛋白表位或结合位点发生氧化修饰，从而偏向于某一特定蛋白构象。在足迹分析自由基试剂方面的最新进展，例如硫酸根自由基阴离子10或三氟甲基化19，有望进一步提升IV-FPOP的适用性。尽管迄今为止在体内实验中唯一测试过的标记试剂是过氧化氢，但其他激光活化的自由基也可被优化使用。这些自由基的使用需确保与线虫存活率相容、具有细胞通透性，并与248 nm激光波长兼容。由于秀丽隐杆线虫（C. elegans）被广泛用作多种人类疾病的模型系统，IV-FPOP在研究蛋白质结构于疾病发病机制中所起作用方面具有重要的应用前景。

近年来，蛋白质足迹法结合质谱（MS）被用于研究蛋白质相互作用及构象变化。羟基自由基蛋白质足迹法（HRPF）通过修饰蛋白质氨基酸侧链来探测蛋白质的溶剂可及性。其中一种HRPF方法——蛋白质快速光化学氧化法（FPOP）1，已被用于体外2、细胞内（IC-FPOP）3，以及最近的活体（IV-FPOP）4条件下对蛋白质结构进行探测。FPOP利用波长为248 nm的准分子激光器，通过光解过氧化氢快速生成羟基自由基1。这些自由基可在微秒时间尺度上标记20种氨基酸中的19种，其反应速度超过蛋白质解折叠的速度。尽管各种氨基酸与羟基自由基的反应活性相差达1000倍，但通过计算保护因子（PF），仍可实现对侧链氧化程度的归一化处理5。
由于FPOP能够对蛋白质进行氧化修饰，而不论其大小或一级序列如何，因此在细胞内和体内蛋白质研究中具有显著优势。IV-FPOP用于探测蛋白质结构 秀丽隐杆线虫 与体外和细胞内研究类似4. 秀丽隐杆线虫 属于线虫科，被广泛用作研究人类疾病的模式生物。该线虫可通过被动和主动扩散吸收过氧化氢，从而便于研究不同体系统中蛋白质的结构。此外， 秀丽隐杆线虫 适用于IV-FPOP，因为它们在FPOP所需的248 nm激光波长下具有良好的透光性6将该方法与质谱联用，可利用传统的自下而上蛋白质组学方法鉴定多种修饰蛋白。
在本实验方案中，我们描述了如何在秀丽隐杆线虫（C. elegans）中进行体外自由基驱动的蛋白质组分析（IV-FPOP）以研究蛋白质结构。该实验方案需要组装并建立微流控流动系统，该系统基于Konermann等人7所报道的IV-FPOP方法进行改进。完成IV-FPOP后，样品经匀浆处理以提取蛋白质。蛋白质样品经蛋白酶解消化后，肽段通过液相色谱（LC）串联质谱（MS）进行分析，随后进行定量。

<table><tbody><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>任何品牌均可</td></tr><tr><td>5 mL 气密型注射器，可拆卸鲁尔锁</td><td>SGE Analytical Science</td><td>008760</td><td>2 个最低数量</td></tr><tr><td>60 型超声波细胞破碎仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>FM3279</td><td>该产品已不再提供。任何低体积超声波破碎仪均可满足需求</td></tr><tr><td>丙酮，HPLC 级</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929-4</td><td>4 L 的量并非必需</td></tr><tr><td>乙腈（含0.1%甲酸，v/v），LC/MS级</td><td>Fisher Scientific</td><td>LS120-500</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 捕获柱，100&amp;Aring;, 5 &amp;micro;米，180 &amp;micro;m × 20 mm，2G，V/M，1/包</td><td>沃特斯</td><td>186007496</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC M-Class 系统</td><td>沃特斯</td><td></td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td>任何品牌均可</td></tr><tr><td>Aqua 5 &amp;micro;m C18 125 &amp;Aring; 填充材料</td><td>Phenomenex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf</td><td>022625501</td><td></td></tr><tr><td>精密任务擦拭纸</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>解剖针</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-822-525</td><td>只需要几个</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>AmericanBio</td><td>AB00490-00005</td><td></td></tr><tr><td>DMSO，无水</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>5分钟环氧速混胶</td><td>Loctite</td><td>1365868</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-100</td><td></td></tr><tr><td>EX350 准分子激光器（248 nm 波长）</td><td>GAM 激光器</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FEP 管道 1/16&quot; OD × 0.020&quot; ID</td><td>IDEX Health &amp;与科学</td><td>1548L</td><td></td></tr><tr><td>甲酸，LC/MS 级</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-500</td><td></td></tr><tr><td>HV3-2 阀门</td><td>Hamilton</td><td>86728</td><td>2 最小值</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-100</td><td>任何30%的过氧化氢均可满足要求</td></tr><tr><td>碘乙酰胺（IAA）</td><td>ACROS Organics</td><td>122270050</td><td></td></tr><tr><td>Legato 101 注射泵</td><td>KD Scientific</td><td>788101</td><td></td></tr><tr><td>鲁尔接头 母鲁尔接头转1/4-28公螺纹 聚丙烯</td><td>IDEX Health &amp;科学</td><td>P-618L</td><td>2 个最低限度</td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>甲醇，LC/MS级</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454SK-4</td><td>4 L 的量并非必需</td></tr><tr><td>微型离心机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75002436</td><td></td></tr><tr><td>N,N&amp;prime;- 二甲基硫脲（DMTU）</td><td>ACROS Organics</td><td>116891000</td><td></td></tr><tr><td>NanoTight 套管 绿色 1/16&quot; ID x .0155&quot; ID x1.6"</td><td>IDEX Health &amp;科学</td><td>F-242X</td><td></td></tr><tr><td>NanoTight 套管 黄色 1/16&quot; OD × 0.027&quot; ID × 1.6&quot;</td><td>IDEX Health &amp;amp; 科学</td><td>F-246</td><td></td></tr><tr><td>N-叔丁基-&amp;alpha;苯基叔丁基硝酮（PBN）</td><td>ACROS Organics</td><td>177350250</td><td></td></tr><tr><td>OmniPur 苯基甲基磺酰氟（PMSF）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7110-OP</td><td>任何蛋白酶抑制剂均可满足要求</td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos 三合一质谱仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td></td><td>其他高分辨率仪器（例如 Q exactive Orbitrap 或 Orbitrap Fusion）也可使用</td></tr><tr><td>PE50-C 热释电能量计</td><td>Ophir Optronics</td><td>7Z02936</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 定量比色法肽测定</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>23275</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Rapid Gold BCA 蛋白质定量检测试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A53225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 胰蛋白酶蛋白酶，质谱级</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>90058</td><td></td></tr><tr><td>Polymicro切割石，1&quot; × 1&quot; x 1/32&amp;rdquo;</td><td>Molex</td><td>1068680064</td><td>任何毛细管切割器均可满足要求</td></tr><tr><td>Polymicro 柔性熔融石英毛细管，内径 250&amp;micro;m，外径 350&amp;micro;m, TSP250350</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150026</td><td></td></tr><tr><td>Polymicro 柔性熔融石英毛细管，内径 450&amp;micro;m，外径 670&amp;micro;m, TSP450670</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150625</td><td></td></tr><tr><td>Polymicro 柔性熔融石英毛细管，内径 75&amp;micro;m，外径 375&amp;micro;m, TSP075375</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150019</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Fisher Scientific</td><td>P382-500</td><td></td></tr><tr><td>Proteome Discoverer（自下而上的蛋白质组学软件）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>OPTON-30799</td><td></td></tr><tr><td>旋转磁力滚筒搅拌器</td><td>V&amp;amp;P Scientific, Inc.</td><td>VP 710D3</td><td></td></tr><tr><td>旋转磁力滚轴搅拌器，用于注射泵的配件套装</td><td>V&amp;amp;P Scientific, Inc.</td><td>VP 710D3-4</td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-111-1315</td><td>任何剪刀均可满足要求</td></tr><tr><td>自粘标签带</td><td>Fisher Scientific</td><td>15937</td><td>一个卷就足够了</td></tr><tr><td>Snap-Cap 微量离心 Flex-Tube 管</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402</td><td>任何品牌均可</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠（SDS）</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-525-017</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠七水合物</td><td>Fisher Scientific</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>体视变焦显微镜</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-000-014</td><td>放大镜已足够</td></tr><tr><td>超级无法兰卡套配SST环，Tefzel（ETFE），1/4-28平底，适用于1/16&quot; 光密度</td><td>IDEX Health &amp;科学</td><td>P-259X</td><td></td></tr><tr><td>Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 平底，适用于 1/16&quot; &amp;和 1/32&quot; 光密度</td><td>IDEX Health &amp;与科学</td><td>P-255X</td><td></td></tr><tr><td>超级翻滚搅拌盘，直径 3.35 mm，厚 0.61 mm</td><td>V&amp;amp;P Scientific, Inc.</td><td>VP 722F</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>通用底板，2.5&quot; × 2.5&quot; x 3/8&quot;</td><td>Thorlabs 公司</td><td>UBP2</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Fisher Scientific</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>VHP MicroTight 360连接头&amp;micro;m OD</td><td>IDEX Health &amp;科学</td><td>UH-436</td><td>2 最小值</td></tr><tr><td>含0.1%甲酸（v/v）的液相色谱-质谱级水</td><td>Fisher Scientific</td><td>LS118-500</td><td></td></tr><tr><td>水，液相色谱-质谱级</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td></td></tr></tbody></table>

体内羟基自由基蛋白质足迹法用于研究蛋白质相互作用 秀丽隐杆线虫

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

快速蛋白质氧化（FPOP）是一种羟基自由基蛋白质足迹技术（HRPF），用于研究蛋白质结构、蛋白质-配体相互作用以及蛋白质-蛋白质相互作用。FPOP利用波长为248 nm的KrF准分子激光器对过氧化氢进行光解，从而产生羟基自由基，后者进一步氧化修饰溶剂可及的氨基酸侧链。最近，我们将FPOP技术扩展应用于体内氧化标记的Caenorhabditis elegans（C. elegans），该方法称为IV-FPOP。这种透明线虫已被广泛用作多种人类疾病的模型系统。由于线虫能够吸收过氧化氢、对248 nm激光辐照透明，且修饰具有不可逆性，因此可通过IV-FPOP开展针对C. elegans的结构研究。本文描述了用于IV-FPOP标记的微流控流动系统的组装、IV-FPOP实验参数、蛋白质提取方法以及优化后的LC-MS/MS分析参数。

在用于IV-FPOP的微流控流动系统中，H2O2与线虫在激光照射前始终保持分离。这种分离可避免内源性过氧化氢酶及其他细胞机制导致的H2O2降解12。使用内径为250 µm的毛细管时，在两次生物学重复实验中样品总回收率可达63–89%，而内径为150 µm的毛细管回收率仅为21–31%（图3A）。与较小内径的毛细管（150 µm）相比，使用较大内径的毛细管（250 µm）可显著改善IV-FPOP过程中的线虫流动情况，并实现单个线虫的流动（图3B）（图3C）。150 µm内径的毛细管无法实现单个线虫流动（图3C），多个线虫会在激光照射窗口处成簇通过，从而降低每个单个线虫所接受的激光照射剂量。
C. elegans 中的溶剂可及性可通过 IV-FPOP 这一共价标记技术进行探测。图 4A 展示了经 FPOP 修饰与未修饰肽段的代表性提取离子色谱图（EIC）。羟基自由基标记会改变氧化修饰肽段的化学性质，从而使 FPOP 修饰后的肽段极性增强。在反相色谱中，IV-FPOP 修饰肽段的保留时间早于未修饰肽段。对分离肽段进行 MS/MS 碎裂可实现对氧化修饰残基的鉴定（图 4B）。
IV-FPOP 在两次生物学重复实验中已氧化修饰了共计 545 种蛋白质 秀丽隐杆线虫 (图5A，B）。IV-FPOP 作为一种蛋白质足迹分析方法的优势在于该技术能够在蠕虫的多种体内系统中对蛋白质进行修饰（图5C）。该方法可用于研究线虫体内任意组织或器官中的蛋白质结构及蛋白质相互作用。此外，串联质谱分析证实，IV-FPOP可在活体条件下探测蛋白质的溶剂可及性。研究人员分析了热休克蛋白90（Hsp90）与肌球蛋白伴侣蛋白UNC-45形成复合物时的氧化模式（图6）。Hsp90 的 MS/MS 分析显示四个发生氧化修饰的残基（图6C，D归一化的FPOP修饰程度（ln(PF)）5 表明Hsp90的残基M698在与UNC-45结合时，其溶剂可及性低于残基R697、E699和E700图6C）。这些氧化差异得到了文献中溶剂可及表面积（SASA）计算结果的验证（PDB 4I2Z）13）。残基 M698 的溶剂可及表面积（SASA）值为 0.03，相较于 SASA 值较高的残基 R697、E699 和 E700，被认为是一个埋藏残基（图6C).14
<img alt="带有FEP管和混合T形接头的微流控混合示意图；用于化学反应的环氧树脂装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60910/60910fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1. 体内FPOP微流控流动系统示意图。（A）IV-FPOP流动系统的两条注入管线（橙色）位于FEP管（黄色）内部，环氧树脂的正确结合位置由浅蓝色圆圈表示。（B）由三根内径为250 µm的毛细管组装而成的完整混合T形接头。出口毛细管与FEP管之间环氧树脂的正确结合位置由浅蓝色圆圈表示。（C）用于C. elegans体内共价标记的完整组装流动系统。在进行FPOP之前，线虫与H2O2保持分离，直至标记前才混合；激光照射窗口以浅蓝色表示，激光束由紫色闪电符号表示。图中比例不准确。本图经Espino等4修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60910/60910fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="用于液体混合和光学激发装置的磁力搅拌器和注射器装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60910/60910fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图2"> 
图2. 体内自由基介导的蛋白质氧化修饰（IV-FPOP）过程中的微流控系统。（A）C. elegans位于5 mL注射器内的代表性图像。未搅拌时，线虫沉降于注射器底部（左图）；在IV-FPOP实验过程中，磁力搅拌器与搅拌块可使线虫保持悬浮状态（右图）。（B）5 mL注射器、灌注毛细管和连接至3-2阀的抽吸毛细管的代表性图像，图中3-2阀手柄处于抽吸位置。（C）IV-FPOP过程中的微流控流动系统，磁力搅拌块位于盛有线虫的5 mL注射器上方。（D）固定在辐射台上的出口毛细管。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60910/60910fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="微管实验中蠕虫回收率的柱状图与显微图像；数据分析比较" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60910/60910fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图3"> 
图3. 比较 秀丽隐杆线虫 使用两根内径毛细管进行流体流动与回收。 (A两次生物学重复（BR）在 IV-FPOP 后的蠕虫回收率，分别为 250（灰色）和 150（黑色） μm 皮下毛细血管。误差线根据技术重复三次的标准差计算得出。 C. elgans 通过激光照射窗口流动 250 µm (B）和 150 µm (C) 皮下毛细管。蠕虫在较细的毛细管中更为紧密地聚集。 150 µm 皮内毛细血管显示虫体聚集。该图已根据 Espino 等人的研究修改。4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60910/60910fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="FPPO修饰肽的色谱图，显示相对丰度随时间及质荷比（m/z）的变化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60910/60910fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图4"> 
图4. 体外自由基标记结合液相色谱-质谱（IV-FPOP）分析的代表性LC-MS/MS结果。（A）FPPO修饰肽（红色）与未修饰肽（蓝色）的提取离子流图（EIC）。所选肽段属于肌动蛋白-1（actin-1）蛋白。（B）未修饰的肌动蛋白-1肽段317-327（双电荷）的MS/MS质谱图。（C）FPPO修饰的肌动蛋白-1肽段317-327（双电荷）的MS/MS质谱图，本例中P323位点发生了氧化修饰（y5+离子，红色）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60910/60910fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="显示基因重叠、样本-对照比较和组织分布的维恩图与饼图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60910/60910fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 5"> 
图 5. IV-FPOP 在 C. elegans 内对蛋白质进行氧化修饰。（A）在两个生物学重复（BR）中，50 Hz 条件下存在 200 mM 过氧化氢时发生氧化修饰的蛋白质的维恩图，BR1 以蓝色表示，BR2 以黄色表示。（B）在 BR2 的技术三重复中，经照射样品、过氧化氢对照和仅线虫对照中鉴定出的氧化修饰蛋白质的维恩图。（C）在不同 C. elegans 身体系统中发生氧化修饰的蛋白质的饼图。该图改编自 Espino 等人4。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60910/60910fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质结构分析、肽段作图和相互作用位点；质谱结果示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60910/60910fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6. 将IV-FPOP修饰与溶剂可及性相关联。（A）肌球蛋白伴侣蛋白UNC-45（灰色）（PDB ID 4I2Z13），突出显示通过LC/MS/MS分析鉴定出的两个修饰肽段669−680和698−706（绿色，左上插图）。UNC-45与Hsp90肽段片段（蓝色）结合。该片段中发生氧化修饰的残基以棍状表示（红色），UNC-45以表面形式呈现（右上插图）。（B）UNC-45肽段669−680（上图）和698−706（下图）的串联质谱图，显示因CO2丢失而产生的b离子和y离子，为FPOP修饰的特征。（C）Hsp90中发生氧化修饰的残基R697、M698、E699和E700的计算ln(PF)值。Hsp90各残基上方标注了计算得到的SASA值。（D）R697、M698、E699和E700的串联质谱图，显示+16的FPOP修饰。本图经Espino等4修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60910/60910fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

活体快速光化学蛋白质氧化（IV-FPOP）是一种羟基自由基蛋白质足迹技术，可用于在天然环境中绘制蛋白质结构图。本方案描述了IV-FPOP微流控流动系统的组装与设置。

快速蛋白质氧化（FPOP）是一种羟基自由基蛋白质足迹技术（HRPF），用于研究蛋白质结构、蛋白质-配体相互作用、...

在秀丽隐杆线虫（C-elegans）中进行的体内FPOP蛋白质-蛋白质相互作用及蛋白质结构变化研究。这些动物被广泛用作研究人类疾病的模型系统。通过将体内FPOP与质谱技术联用，我们可以在活体动物中探测不同细胞和组织区室内的蛋白质-蛋白质相互作用，而无需分离特定的单一蛋白质。开始组装流动系统，先用剪刀截取一段两厘米长的氟化乙烯丙烯（FPP）管。使用洁净的解剖针将管的一端内径扩大，在管端形成一个长约15毫米的小型凹坑。为制备流动系统的灌注管线，使用陶瓷切割刀将内径为250微米的熔融石英管切割成每段15厘米长的管段。用自粘胶带将两根毛细管固定在一起，确保两端完全对齐。将两根毛细管插入FPP管的凹槽中，推至最边缘。在干净的表面上放置少量环氧树脂，用解剖针将其混合均匀。使用同一根针头，迅速在灌注毛细管末端（即与FPP管路连接处）放置一小滴树脂，使树脂出口朝上干燥数分钟。同时，剪切一段新的内径为250微米的毛细管，作为流动系统的出口毛细管。待树脂干燥后，将新毛细管插入FPP管路的出口端。出口毛细管的内端与两条灌注毛细管的内端应平齐对齐，形成混合区。使用新鲜环氧树脂如前所述将毛细管与FPP管路粘合，并让流动系统过夜干燥。插入四个磁力搅拌子，置于一个五毫升注射器内部，以防止在线虫体内快速光化学蛋白质氧化（in vivo FPOP）过程中线虫在该注射器中沉降。取一支5毫升注射器并另取一支5毫升注射器，均用M9培养基充满，注意避免产生气泡。将一个低位接头连接到每支注射器上，确保用手拧紧并固定到位。然后，将每支注射器连接至一个三通二位阀的中间端口。将每个注射器固定到双注射泵上，并调节机械颜色以防止推块产生过压。使用带超宽法兰的列表而非FEP套管和带超宽法兰的可变列表，将先前制备的微流控系统的每个灌注毛细管末端连接到每个三通两通阀的顶部端口。最后，将一根10厘米长、内径为450微米的毛细管连接至阀的底部端口，该毛细管将用作抽取样品的毛细管。启动泵流，并目视检查所有连接处是否泄漏。使用实验流速至少推动三倍注射器体积的液体。三通阀手柄上的箭头指示流路方向，通过将阀手柄从排出位置切换至吸入位置，可手动重新填充每支注射器。检查微流控流动系统后，将其移至实验台，并使用不锈钢接头将出口毛细管固定在辐射平台上。使用长柄打火机烧除激光辐照窗口处熔融石英表面的涂层，并用无绒纸巾和甲醇清洁烧除后的残留物。将磁力搅拌器放置在装有磁力搅拌子的注射器上方，并调节转速，使搅拌子缓慢且持续地旋转。打开氟化氪准分子激光器，使甲状腺套管预热。将光学传感器置于光束出口窗口处，以50赫兹的频率测量至少100次脉冲的激光能量。用样品注射器手动吸取约10,000条线虫，体积为500微升。然后加入 2.5 毫升 M9 缓冲液，注意避免产生气泡。样本量应至少包含 10,000 条线虫。样本量过小将导致后续蛋白质组学分析的蛋白质得率偏低。用第二个注射器吸取三毫升 200 毫摩尔的过氧化氢。在出口毛细管末端放置一个 15 毫升的圆底离心管，其中含有六毫升 40 毫摩尔的 DMTU、40 毫摩尔的 PBN 和 1% 的苹果酱氧化物。从软件窗口启动准分子激光器，等待第一个脉冲，然后启动双注射器的样品流。将全部样品收集至15毫升离心管中，同时密切监测样品流是否存在肉眼可见的泄漏。体内FPOP反应结束后，以805 ×g离心2分钟，使线虫沉淀。吸除淬灭溶液，并加入250 µL许可缓冲液。将样品转移至洁净的微量离心管中，快速冷冻后于负80摄氏度保存，直至进行样品消化。通过体内FPOP实验，比较了使用两种不同内径毛细管后的线虫回收率。当使用内径为250微米的毛细管时，在两个生物学重复中，总样品回收率介于63%至89%之间。使用内径为150微米的毛细管仅获得21%至31%的回收率。在体内FPOP过程中，采用更大内径的毛细管可改善线虫的流动；较小的毛细管无法实现单个线虫的流动，导致多个线虫在激光辐照窗口处同时通过，从而降低了每条线虫所接受的激光照射量。FPOP修饰与未修饰肽段的代表性提取离子色谱图显示，羟基自由基会改变氧化修饰肽段的化学性质，使其极性增强。在反相色谱中，体内FPOP修饰的肽段比未修饰的肽段保留时间更早。对分离的肽段进行质谱碎裂，可鉴定出发生氧化修饰的残基。在秀丽隐杆线虫中，体内FPOP在两个生物学重复实验中共修饰了545种蛋白质。这种蛋白质足迹分析方法的一个优势在于，它能够在蠕虫的多种体内系统中对蛋白质进行修饰。串联质谱分析证实了FPOP探针在体内的溶剂可及性。对热休克蛋白90与肌球蛋白伴侣蛋白UNC 45形成复合物后的氧化模式进行了分析，发现了四个被氧化修饰的残基。利用秀丽隐杆线虫进行体内FPOP研究，有望揭示蛋白质-蛋白质相互作用及蛋白质结构在疾病发病机制中的作用。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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体内羟基自由基蛋白质足迹法用于研究蛋白质相互作用秀丽隐杆线虫

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