Name: 用细胞内快速光化学氧化蛋白质对细胞内蛋白质进行特征化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 了解细胞内快速光化学氧化蛋白质技术用于活细胞中蛋白质相互作用与结构变化研究的方法。该技术结合质谱分析可在天然环境中表征膜蛋白，为癌症和遗传疾病研究提供重要信息。

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本工作获得了 NSF CAREER 奖（MCB1701692）对 LMJ 的资助。

1. 建立 IC-FPOP 流动系统
<ol>
	<li>开始组装流路系统时，使用裂解石将熔融石英切割至所需尺寸。IC-FPOP 流路系统需要四根 12 cm 和一根 17 cm 的熔融石英管，内径（ID）为 450 µm，外径（OD）为 670 µm；两根 24 cm 和一根 40 cm 的熔融石英管，内径为 75 µm，外径为 360 µm；最后两根 57 cm 的熔融石英管，内径为 150 µm，外径为 360 µm。 
	注意：切割石英管时，应轻轻刮除聚酰亚胺涂层，并通过弯折获得最平整的切口。检查切口是否笔直（这是确保不发生堵塞或泄漏的必要条件）。</li>
	<li>使用纳米密封套筒（适用于外径 360 µm 石英管的套筒内径为 0.0155"，外径为 1/16"；适用于外径 670 µm 石英管的套筒内径为 0.027"，外径为 1/16"），配合超无法兰 PEEK 1/4-28 平底螺母（适用于外径 1/16"）和带不锈钢环的超无法兰压环（Tefzel，ETFE），1/4-28 平底（适用于外径 1/16"），共建立 15 个连接。按照制造商的操作说明进行连接组装（图 1）。</li>
	<li>将 6 个小型圆柱形磁铁放入一支 500 µL 注射器中。将该注射器与另一支 500 µL 注射器以及两支 5 mL 注射器用缓冲液充满并排除空气。按 图 2A 所示位置安装到注射泵上。 
	注意：5 mL 注射器比 500 µL 注射器更大，因此需要使用垫片，以便同时牢固固定所有注射器（图 2B）。</li>
	<li>调节注射泵推杆止挡位置，使细胞注射器在电机停止时仍保留约 50 µL 的空间，以便为磁力搅拌子留出活动空间（图 2C-D）。 
	警告：若注射泵对磁铁施加压力，可能导致注射器卡住甚至破裂。</li>
	<li>使用鲁尔接头，将手动阀连接至每支注射器。按 图 3 所示方式组装石英管路。 
	注意：将含有细胞和 H2O2 的流路穿过十字交叉结构直至另一侧，然后插入内径为 450 µm 的石英管中。5 mL 注射器中的鞘液缓冲液流速将高于细胞和 H2O2 的流速。在两侧鞘液的共同作用下，细胞将被流体动力聚焦成一条细线，以便进行激光照射。</li>
	<li>将流路系统置于激光器旁。使用打火机烧除内径为 450 µm 的石英管表面的涂层，形成用于激光照射的透光窗口。</li>
	<li>在装有六个磁铁的细胞注射器上方放置一个磁力搅拌器。</li>
	<li>将注射泵设定为 492.4 µL/min，以实现最终总流速为 1,083.3 µL/min。用缓冲液冲洗系统三次，以充分清洗系统并检测是否存在泄漏。</li>
	<li>使用凸透镜将准分子激光聚焦至石英管上。聚焦完成后，将一小片纸张置于石英管后方并开启激光，测试照射窗口。测量激光烧蚀区域的长度。利用照射窗口尺寸和流速计算所需的激光频率，以获得零排除分数。 
	注意：IC-FPOP 实验推荐的激光能量应 ≥120 mJ。当照射窗口为 2.58 mm，流速为 1083.3 µL/min 时，若要获得零排除分数，激光频率需设定为 44 Hz。以下为已知照射窗口、流速和排除分数时，计算激光频率所需公式： 
	<img src="/files/ftp_upload/60911/60911eq1.jpg" alt="公式；数学表达式 w=πx*100,000(y*5*10⁻⁵)², v=w/((1-b)*1000), f=a/60*v；数学分析。" data-altupdatedat="1788250015000"> 
	其中 w 表示体积（单位：nL），x 表示激光光斑宽度（单位：mm），y 表示石英管内径（单位：µm），v 表示总体积（单位：µL），b 表示排除分数，a 表示流速（单位：µL/min），f 表示频率（单位：Hz）。</li>
</ol>
2. 制备淬灭剂和 H2O2
<ol>
	<li>配制淬灭液，其中含 100 mM N-叔丁基-α-苯基硝酮（PBN）和 100 mM N,N'-二甲基硫脲（DMTU）。将 11 mL 淬灭液分装至每份样品对应的 50 mL 圆锥形离心管中。</li>
	<li>将 H2O2 稀释至 200 mM。每份样品需要 500 µL H2O2。 
	注意：淬灭液可于实验前一天配制，并在避光条件下于 4 °C 过夜保存。H2O2 应在实验当天新鲜配制。</li>
</ol>
3. 收集细胞
<ol>
	<li>将细胞在 T175 培养瓶中培养至约 70–90% 汇合度。</li>
	<li>移除培养基，并用缓冲液清洗。 
	注意：常用的缓冲液包括细胞培养级的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）或 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）。</li>
	<li>使用胰蛋白酶-EDTA 或细胞刮刀使细胞脱离。</li>
	<li>细胞脱落后，用 10 mL 缓冲液重悬并计数细胞。</li>
	<li>离心沉淀，弃去上清液（包括缓冲液和胰蛋白酶-EDTA），再重悬细胞，使其浓度为 2 × 106 个细胞/mL。</li>
	<li>每份样品分装 500 µL 细胞悬液。 
	注意：每个实验条件至少制备 3 份激光处理样品和 3 份不进行激光处理的对照样品。</li>
</ol>
4. 进行IC-FPOP
<ol>
	<li>用缓冲液填充两个 5 mL 注射器，用含细胞的磁珠填充 500 µL 注射器，用 H2O2 填充最后一个 500 µL 注射器。开启磁力搅拌器。</li>
	<li>向一份淬灭液中加入 220 µL 二甲基亚砜（DMSO），轻轻混匀，并将其置于流动系统后方以收集辐照后的样品。添加 DMSO 可抑制内源性甲硫氨酸亚砜还原酶的活性。</li>
	<li>开启激光器，等待 7 秒后，启动流动系统。</li>
	<li>待样品流动完成后，关闭激光器，并将收集到的样品与淬灭液轻轻混匀。在执行步骤 4.5 和 4.6 期间将该样品暂时放置一旁。</li>
	<li>用细胞悬浮所用的缓冲液填充全部四个注射器，并使其流经流动系统。</li>
	<li>系统冲洗完成后，重复步骤 4.1 和 4.2。启动流动但不进行辐照。此为无激光对照组，用于评估细胞中背景氧化水平。</li>
	<li>在下一样品运行的同时，将前一个样品在 450–800 × g 条件下离心 5 分钟，去除上清液，并用 100 µL 细胞裂解缓冲液（如放射免疫沉淀分析缓冲液，RIPA 缓冲液）重悬沉淀。</li>
	<li>将样品转移至微量离心管中，并在液氮中快速冷冻。</li>
	<li>当所有样品运行结束后，拆卸流动系统进行清洗。丢弃使用过的石英毛细管，并将所有其他连接部件在 50% 水：50% 甲醇溶液中超声清洗 1 小时。按照制造商说明清洗注射器。</li>
</ol>
5. 消化
<ol>
	<li>消化全细胞裂解液。首先将样品解冻，并在 95 °C 下加热 10 分钟。</li>
	<li>加热后，将裂解液置于冰上冷却 15 分钟。</li>
	<li>加入 25 单位的核酸酶以消化 DNA 和 RNA，并在室温下孵育 15 分钟。</li>
	<li>使用台式离心机在 4 °C 条件下以 16,000 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>收集上清液并转移至新的洁净微量离心管中。</li>
	<li>使用蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。</li>
	<li>取 20–100 µg 样品转移至洁净的微量离心管中，并用缓冲液补至 100 µL。</li>
	<li>加入 20 mM 二硫苏糖醇（DTT）进行还原反应，在 50 °C 下孵育 45 分钟。</li>
	<li>将样品在室温下冷却 15 分钟。</li>
	<li>在避光条件下，加入 20 mM 碘乙酰胺（IAA）于室温烷基化 20 分钟。</li>
	<li>按蛋白与丙酮体积比 1:4 加入预冷的丙酮，混匀后于 -20 °C 过夜沉淀。</li>
	<li>次日清晨，在 4 °C 条件下以 16,000 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，加入 50 µL 预冷的 90% 丙酮，混匀后在 4 °C 条件下以 16,000 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>去除丙酮，将微量离心管盖打开，用无尘布覆盖管口，使样品自然干燥。样品完全干燥后，用 10 mM Tris 缓冲液（pH 8）重悬蛋白沉淀。</li>
	<li>将 20 µg 胰蛋白酶溶解于 40 µL 10 mM Tris 缓冲液（pH 8）中。按质量比 1:50（胰蛋白酶:样品）加入 2 µg 胰蛋白酶，37 °C 过夜孵育。</li>
	<li>次日清晨，使用肽定量试剂盒检测肽浓度。在取样完成肽浓度测定后，向样品中加入甲酸终止胰蛋白酶消化反应（终浓度为 5% 甲酸）。</li>
	<li>确定最终肽浓度后，将每份样品各取 10 µg 转移至洁净的微量离心管中，以确保各样品分析量一致。使用真空离心浓缩仪将样品干燥，干燥后用 20 µL 质谱级 0.1% 甲酸溶液重悬，随后转移至自动进样瓶中。</li>
</ol>
6. 液相色谱-串联质谱法
<ol>
	<li>为定位FPOP修饰，使用LC-MS/MS分析对消化后的细胞裂解液进行分析。</li>
	<li>采用含0.1%甲酸的水溶液（A）和含0.1%甲酸的乙腈溶液（B）作为流动相。</li>
	<li>将0.5 µg样品加载至180 µm × 20 mm C18捕获柱（5 µm，100 Å），并用99%（A）和1%（B）的流动相洗涤15分钟。</li>
	<li>使用75 µm × 30 cm C18分析柱（5 µm，125 Å），以0.300 µL/min的流速进行分析分离：起始条件为3%（B）并维持1分钟，随后在1–2分钟内升至10%（B），在2–100分钟内升至45%（B），在100–110分钟内升至100%（B）。通过在110–115分钟内保持100%（B）清洗色谱柱。再在115–116分钟内将流动相降至3%（B），并在3%（B）条件下保持至130分钟，以重新平衡色谱柱。</li>
	<li>设置质谱采集参数：分辨率设为60,000，m/z扫描范围为375–1500，自动增益控制（AGC）目标值设为5.0 × 105，最大离子注入时间设为50 ms。</li>
	<li>在质谱采集过程中，通过数据依赖采集（DDA）模式选择电荷态为2–6的前体离子，隔离窗口设为1.2 m/z，循环时间设为4秒。选择强度阈值高于5.0 × 104的肽段进行HCD碎裂，归一化碎裂能量设为32%。在完成一次MS/MS采集后，将相应肽段排除60秒。MS/MS扫描的分辨率设为15,000，AGC目标值设为5.0 × 104，最大离子注入时间设为35 ms。</li>
</ol>
7. 数据处理
<ol>
	<li>在可用的蛋白质分析软件中，使用相关的蛋白质数据库和相应的消化酶对 RAW 文件进行搜索。此处使用 Swiss-Prot Homo Sapiens 数据库和胰蛋白酶（trypsin）。</li>
	<li>设定前体离子质量搜索范围为 350 至 5,000 Da，质量容差为 10 ppm；允许最多 1 个漏切位点，肽段长度范围为 6 至 144 个氨基酸残基。这些限制条件有助于提高数据库搜索效率。</li>
	<li>设定碎片离子最大质量容差为 0.02 Da，以羧甲基化（+57.021）作为固定修饰，17 种氨基酸的 FPOP 修饰作为动态修饰（图 4 展示了用于检测 FPOP 修饰的蛋白质分析工作流程示例）。 
	注意：由于丝氨酸和苏氨酸的 FPOP 修饰与羟基自由基反应活性较低，因此在搜索中未包含这两种氨基酸的修饰。</li>
	<li>使用诱饵数据库进行搜索，设定错误发现率（FDR）为 1% 和 5%。</li>
	<li>完成文件搜索后，计算 FPOP 修饰程度。打开 Proteome Discoverer 2.2，导出序列、修饰位点、蛋白质登录号、质谱文件、前体离子丰度及保留时间信息。根据公式 4 计算修饰程度： 
	<img src="/files/ftp_upload/60911/60911eq2.jpg" alt="静态平衡方程，ΣEIC 修饰面积/ΣEIC 总面积，教学公式，分析图示。" data-altupdatedat="1788250015000"> 
	其中，EIC 修饰面积是指特定肽段带有羟基自由基修饰的色谱峰面积；EIC 总面积是指该特定肽段修饰与未修饰形式的总色谱峰面积。在有无辐照的样品中分别计算氧化修饰程度。未进行辐照的样品（对照组）用于评估细胞在 H2O2 暴露前后可能存在的背景氧化。通过从辐照样品中扣除对照组信号，有助于分离出特异性的 FPOP 修饰。</li>
</ol>

<ol><li>Gau, B., Garai, K., Frieden, C., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+protein+footprinting+characterizes+the+structures+of+oligomeric+apolipoprotein+E2%2C+E3%2C+and+E4%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based protein footprinting characterizes the structures of oligomeric apolipoprotein E2, E3, and E4.</a> Biochemistry. 50 (38), 8117-8126 (2011).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+structural+resolution+hydroxyl+radical+protein+footprinting+reveals+an+extended+Robo1-heparin+binding+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">High structural resolution hydroxyl radical protein footprinting reveals an extended Robo1-heparin binding interface.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (17), 10729-10740 (2015).</li>
<li>Zhang, H., Gau, B. C., Jones, L. M., Vidavsky, I., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+for+comparing+structures+of+protein%E2%88%92+ligand+complexes%3A+the+calmodulin%E2%88%92+peptide+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fast photochemical oxidation of proteins for comparing structures of protein− ligand complexes: the calmodulin− peptide model system.</a> Analytical Chemistry. 83 (1), 311-318 (2010).</li>
<li>Jones, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+MS+methods+assist+conformational+characterization+of+antibodies+with+altered+S-S+bonding+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Complementary MS methods assist conformational characterization of antibodies with altered S-S bonding networks.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (6), 835-845 (2013).</li>
<li>Kiselar, J. G., Janmey, P. A., Almo, S. C., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+analysis+of+gelsolin+using+synchrotron+protein+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomic%22%5BJournal%5D)">Structural analysis of gelsolin using synchrotron protein footprinting.</a> Molecular & Cellular Proteomic. 2 (10), 1120-1132 (2003).</li>
<li>Vahidi, S., Stocks, B. B., Liaghati-Mobarhan, Y., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+pH-induced+protein+structural+changes+under+equilibrium+conditions+by+pulsed+oxidative+labeling+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mapping pH-induced protein structural changes under equilibrium conditions by pulsed oxidative labeling and mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 84 (21), 9124-9130 (2012).</li>
<li>Hambly, D. M., Gross, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+flash+photolysis+of+hydrogen+peroxide+to+oxidize+protein+solvent-accessible+residues+on+the+microsecond+timescale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Laser flash photolysis of hydrogen peroxide to oxidize protein solvent-accessible residues on the microsecond timescale.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (12), 2057-2063 (2005).</li>
<li>Espino, J. A., Mali, V. S., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+cell+footprinting+coupled+with+mass+spectrometry+for+the+structural+analysis+of+proteins+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In cell footprinting coupled with mass spectrometry for the structural analysis of proteins in live cells.</a> Analytical Chemistry. 87 (15), 7971-7978 (2015).</li>
<li>Rinas, A., Mali, V. S., Espino, J. A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Microflow+System+for+In-Cell+Footprinting+Coupled+with+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development of a Microflow System for In-Cell Footprinting Coupled with Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 88 (20), 10052-10058 (2016).</li>
<li>Guan, J. Q., Almo, S. C., Reisler, E., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Reorganization+of+Proteins+Revealed+by+Radiolysis+and+Mass+Spectrometry%3A+G-Actin+Solution+Structure+Is+Divalent+Cation+Dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Structural Reorganization of Proteins Revealed by Radiolysis and Mass Spectrometry: G-Actin Solution Structure Is Divalent Cation Dependent.</a> Biochemistry. 42 (41), 11992-12000 (2003).</li>
<li>Xu, G., Chance, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyl+radical-mediated+modification+of+proteins+as+probes+for+structural+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics.</a> Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).</li>
<li>Kaur, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-Wide+Structural+Biology%3A+An+Emerging+Field+for+the+Structural+Analysis+of+Proteins+on+the+Proteomic+Scale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Proteome-Wide Structural Biology: An Emerging Field for the Structural Analysis of Proteins on the Proteomic Scale.</a> Journal of Proteome Research. 17 (11), 3614-3627 (2018).</li>
<li>Chea, E. E., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+the+structure+of+macromolecules+in+their+native+cellular+environment+using+hydroxyl+radical+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Analyzing the structure of macromolecules in their native cellular environment using hydroxyl radical footprinting.</a> Analyst. 143 (4), 798-807 (2018).</li>
<li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+in+vivo+structural+dynamics+in+integral+membrane+protein+by+hydroxyl+radical+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomic%22%5BJournal%5D)">Elucidating in vivo structural dynamics in integral membrane protein by hydroxyl radical footprinting.</a> Molecular & Cellular Proteomic. 8 (8), 1999-2010 (1999).</li>
<li>Rinas, A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+photochemical+oxidation+of+proteins+coupled+to+multidimensional+protein+identification+technology+%28MudPIT%29%3A+expanding+footprinting+strategies+to+complex+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">Fast photochemical oxidation of proteins coupled to multidimensional protein identification technology (MudPIT): expanding footprinting strategies to complex systems.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (4), 540-546 (2015).</li>
<li>Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+quantitation+strategy+for+hydroxyl+radical-mediated+protein+footprinting+using+Proteome+Discoverer%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An efficient quantitation strategy for hydroxyl radical-mediated protein footprinting using Proteome Discoverer.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 408 (11), 3021-3031 (2016).</li>
</ol>

Lisa Jones 是细胞流动组装专利（公开号：20180079998）的发明人。

已开发出多种基于质谱的技术，用于在全细胞或细胞裂解物中以蛋白质组范围的方式研究蛋白质结构及蛋白质-配体复合物。这些技术包括但不限于蛋白质氧化速率稳定性分析（SPROX）、热蛋白质组分析（TPP）、化学交联（XL-MS）和羟基自由基蛋白质足迹法（HRPF）。每种技术相比其他方法均有其独特的局限性和优势，已有大量综述对此进行了详细讨论12。这些方法均已应用于全蛋白质组水平的结构生物学研究，以阐明复杂细胞环境中蛋白质的结构及其最终功能。IC-FPOP 是一种HRPF技术，利用羟基自由基对氨基酸中溶剂可及的侧链进行氧化修饰，从而探测活细胞内蛋白质的结构及蛋白质-配体相互作用13。IC-FPOP 是对早期在活细胞中使用芬顿化学反应在分钟级时间尺度上产生活性自由基的HRPF方法的改进14。在本研究中，通过在整个蛋白范围内实现良好的氧化覆盖率，成功表征了跨膜蛋白在缓冲液pH值或离子强度降低条件下的结构变化。与芬顿化学反应相比，IC-FPOP 的反应速度快得多，可在微秒级时间尺度上对蛋白质进行修饰，从而能够研究蛋白质的天然构象。
对IC-FPOP的一项关键测试是确认细胞在暴露于H2O2后的存活能力。使用40 cm的混合管线时，细胞在辐照前会与H2O2孵育约3秒。通过改变该石英管的长度可调节此孵育时间。值得注意的是，尽管使用台盼蓝检测细胞活力可证明细胞在H2O2孵育后仍保持完整，但细胞可能仍处于应激状态，从而影响与H2O2相互作用的信号通路。幸运的是，该孵育时间极短，短于蛋白质合成所需时间，因此可以确信所检测的蛋白质并非由H2O2诱导产生。
下一步重要操作是确认流路系统的正确组装。组装完成后，在用目标缓冲液冲洗系统后，应确保系统无泄漏。若发现泄漏，需检查石英管是否被正确切割，并确保其与卡套紧密贴合，以便在拧紧时形成良好密封。所有部件均为手动拧紧，无需使用工具。在每次IC-FPOP实验过程中，需确保细胞注射器内的磁力搅拌子持续转动。这种轻微搅拌可减少细胞在注射器底部的沉降，又不会剧烈到造成细胞剪切损伤。一次运行后，注射器中约残留50 µL细胞悬液。每次实验后务必通过冲洗步骤将其稀释，以减少残留细胞对下一次实验的交叉污染。若需比较多种细胞处理条件，建议使用新的细胞注射器。此外，为待测细胞选择合适的缓冲液也至关重要。某些缓冲液会淬灭羟基自由基，导致蛋白质修饰减少。Xu等人的研究显示，一些常用缓冲液会缩短羟基自由基的寿命11。DPBS和HBSS是IC-FPOP实验中常用的缓冲液。
在完成IC-FPOP后，应根据所需参数优化消化方案。由于FPOP会产生不可逆的共价修饰，因此有充足的时间进行彻底的消化和纯化，而不会丢失标记覆盖率。务必对蛋白质浓度进行检测和归一化，以确保加载到串联质谱中的肽段浓度一致。最后需注意，免疫沉淀不能与IC-FPOP联合使用。如果FPOP修饰发生在相互作用区域，抗体的亲和力将降低。为了提高FPOP修饰的鉴定率，二维色谱分离步骤已被证明可使检测到的氧化肽段数量增加两倍以上15。
任何FPOP实验的一个挑战是由于可能产生的氧化产物而导致数据分析层面的复杂性。这一点无论是在细胞内还是体外实验中均成立，而在分析细胞裂解液时，其复杂性则显著增加。随着IC-FPOP技术的进一步优化，出现的蛋白质数量及其修饰覆盖率不断提高，使得数据分析迅速变得更加困难。单次IC-FPOP实验所产生的海量数据限制了人工验证的可行性，迫使研究人员更加依赖软件工具。为此，Rinas等人开发了一种基于Proteome Discoverer（PD）的HRPF定量策略16。该方法在PD中采用多搜索节点工作流程，并结合电子表格中的定量平台进行分析。目前，IC-FPOP平台的进一步改进工作正在进行中，旨在提高可鉴定的FPOP修饰肽段数量，同时增强实验的可重复性与定量准确性。

羟基自由基蛋白质足迹法（HRPF）是一种通过羟基自由基产生的共价修饰来探测蛋白质溶剂可及性的方法。当蛋白质结构或蛋白质相互作用发生变化时，氨基酸的溶剂暴露程度会随之改变，从而影响残基被修饰的程度。利用HRPF，已成功在体外研究了蛋白质相互作用1,2,3以及蛋白质构象变化4,5,6。目前有多种方法可用于生成HRPF实验所需的羟基自由基，其中之一是快速光化学氧化蛋白质法（FPOP）。FPOP由Hambly和Gross于2005年开发，利用248 nm准分子激光通过光解过氧化氢（H2O2）产生羟基自由基7。
最近，Espino 等人将FPOP技术的应用扩展至活细胞内的蛋白质结构研究，该方法被称为细胞内FPOP（in-cell FPOP，IC-FPOP）8。与体外研究相比，在细胞环境中研究蛋白质能够考虑分子拥挤效应以及多种可能影响蛋白质结构的蛋白质相互作用。此外，该技术具有提供整个蛋白质组快照的优势，可同时获得多个系统的结构信息，从而实现全蛋白质组水平的结构生物学研究。 Furthermore，该技术特别适用于在体外难以研究的蛋白质，例如膜蛋白。
早期对IC-FPOP的研究成功检测了105种在丰度和细胞定位上各不相同的蛋白质。为了改进IC-FPOP方法，Rinas等人开发了一种用于单细胞流动的微流系统9。该改进后的流动系统可减少细胞聚集，并提高可用于辐照的H2O2量。在最初的流动系统中，细胞在石英管内发生团聚，导致堵塞和辐照不均。通过引入两股鞘液缓冲液流，利用流体动力学原理将细胞聚焦，使其能够单独通过激光照射区域。此外，采用独立的注射泵输送H2O2，可更精确地控制并优化暴露时间，从而在无不良影响的情况下使用更高浓度的H2O2。同时，缩短孵育时间也有助于限制内源性过氧化氢酶对H2O2的降解。通过采用这一新型流动系统，检测到发生FPOP修饰的蛋白质数量增加了13倍，显著拓展了该方法在活细胞中研究多种蛋白质的能力。本实验方案重点描述了一般性的IC-FPOP实验流程，特别是IC-FPOP流动系统的组装过程。

<table><tbody><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>任何品牌均可</td></tr><tr><td>5 mL 气密型注射器，可拆卸鲁尔锁头</td><td>SGE Analytical Science</td><td>008760</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 圆锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>任何品牌均可</td></tr><tr><td>500 &amp;micro;L型气密式注射器：固定式鲁尔锁型号</td><td>Fisher Scientific</td><td>SG-00723</td><td></td></tr><tr><td>丙酮，HPLC 级</td><td>Fisher Scientific</td><td>A929-4</td><td>4 L 的量并非必需</td></tr><tr><td>乙腈（含0.1%甲酸，v/v），液相色谱/质谱级</td><td>Fisher Scientific</td><td>LS120-500</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC M-Class Symmetry C18 捕获柱，100 &amp;Aring;, 5 &amp;micro;米，180 &amp;micro;m × 20 mm，2G，V/M，1/包</td><td>沃特斯</td><td>186007496</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY UPLC M-Class 系统</td><td>沃特斯</td><td>ACQUITY UPLC M-Class 系统</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-100</td><td>任何品牌均可</td></tr><tr><td>Aqua 5 &amp;micro;m C18 125 &amp;Aring; 填充材料</td><td>Phenomenex</td><td>04A-4299</td><td></td></tr><tr><td>离心</td><td>Eppendorf</td><td>022625501</td><td></td></tr><tr><td>精密任务擦拭纸</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>AmericanBio</td><td>AB00490-00005</td><td></td></tr><tr><td>DMSO，无水</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>EX350 准分子激光器</td><td>GAM 激光器</td><td>EX350 准分子激光器</td><td></td></tr><tr><td>FEP 管道 1/16&quot; OD × 0.020&quot; ID</td><td>IDEX Health &amp;与科学</td><td>1548L</td><td></td></tr><tr><td>甲酸，LC/MS 级</td><td>Fisher Scientific</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>HV3-2 阀门</td><td>Hamilton</td><td>86728</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢</td><td>Fisher Scientific</td><td>H325-100</td><td>任何30%的过氧化氢均可满足要求</td></tr><tr><td>碘乙酰胺（IAA）</td><td>ACROS Organics</td><td>122270050</td><td></td></tr><tr><td>Legato 210 注射泵</td><td>KD Scientific</td><td>788212</td><td>任何能够容纳 4、5 mL 注射器，具备吸液和排液功能，并可通过某种方式锁定电机的注射泵均可使用</td></tr><tr><td>鲁尔接头 母鲁尔接头转1/4-28公制聚丙烯</td><td>IDEX Health &amp;与科学</td><td>P-618L</td><td></td></tr><tr><td>甲醇，LC/MS级</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454SK-4</td><td>4 L 的量并非必需</td></tr><tr><td>微型离心机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>75002436</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-二甲基硫脲（DMTU）</td><td>ACROS Organics</td><td>116891000</td><td></td></tr><tr><td>NanoTight 套管绿色 1/16&quot; ID x .0155&quot; ID × 1.6&quot;</td><td>IDEX Health &amp;科学</td><td>F-242X</td><td></td></tr><tr><td>NanoTight 套管 黄色 1/16&quot; OD × 0.027&quot; ID × 1.6&quot;</td><td>IDEX Health &amp;与科学</td><td>F-246</td><td></td></tr><tr><td>N-叔丁基-&amp;alpha;苯基叔丁基硝酮（PBN）</td><td>ACROS Organics</td><td>177350250</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Lumos 三合一质谱仪</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Orbitrap Fusion Lumos 三合一质谱仪</td><td>其他高分辨率仪器（例如 Q exactive Orbitrap 或 Orbitrap Fusion）可以使用</td></tr><tr><td>PE50-C 热释电能量计</td><td>Ophir Optronics</td><td>7Z02936</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 定量比色法肽测定</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>23275</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Rapid Gold BCA 蛋白质定量检测试剂盒</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A53225</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 胰蛋白酶蛋白酶，质谱级</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>90058</td><td></td></tr><tr><td>用于细胞裂解的 Pierce 通用核酸酶</td><td>Fisher Scientific</td><td>88702</td><td></td></tr><tr><td>Polymicro切割石，1&quot; × 1&quot; x 1/32&quot;</td><td>Molex</td><td>1068680064</td><td>任何毛细管切割器均可满足要求</td></tr><tr><td>Polymicro 柔性熔融石英毛细管，内径 150 &amp;micro;m，外径 360 &amp;micro;m，TSP150350</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150024</td><td></td></tr><tr><td>Polymicro 柔性熔融石英毛细管，内径 450 &amp;micro;m，外径 670 &amp;micro;m, TSP450670</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150025</td><td></td></tr><tr><td>Polymicro 柔性熔融石英毛细管，内径 75 &amp;micro;m，外径 360 &amp;micro;m, TSP075375</td><td>Polymicro Technologies</td><td>1068150019</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Fisher Scientific</td><td>P382-500</td><td></td></tr><tr><td>Proteome Discover 2.2（自下而上蛋白质组学软件）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>OPTON-30799</td><td></td></tr><tr><td>旋转磁力滚转搅拌器</td><td>V&amp;amp;P Scientific, Inc.</td><td>VP 710D3</td><td></td></tr><tr><td>旋转磁力滚轴搅拌器，用于注射泵的配件套装</td><td>V&amp;amp;P Scientific, Inc.</td><td>VP 710D3-4</td><td></td></tr><tr><td>超大无法兰卡套，含SST环，Tefzel材质&amp;trade; （ETFE），1/4-28 平底，适用于 1/16&quot; 光密度</td><td>IDEX Health &amp;与科学</td><td>P-259X</td><td></td></tr><tr><td>Super Flangeless Nut PEEK 1/4-28 平底，适用于 1/16&quot; &amp;和 1/32&quot; 光密度</td><td>IDEX Health &amp;与科学</td><td>P-255X</td><td></td></tr><tr><td>超级翻转搅拌盘，直径 3.35 mm，厚 0.61 mm</td><td>V&amp;amp;P Scientific, Inc.</td><td>VP 722F</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce RIPA 裂解液</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI89900</td><td></td></tr><tr><td>Tris碱</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Upchurch Scientific 低压接头：PEEK</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-700-182</td><td></td></tr><tr><td>Upchurch Scientific 低压三通接头：PEEK</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-700-178</td><td></td></tr><tr><td>紫外级熔融石英平凸球面透镜</td><td>THORLABS</td><td>LA4052</td><td></td></tr><tr><td>V&amp;amp;P Scientific 公司供应商多样性合作伙伴 TUMBL STIR DISC PARYLENE 1000</td><td>V&amp;amp;P Scientific, Inc.</td><td>VP724F</td><td></td></tr><tr><td>VHP MicroTight 360 用接头&amp;micro;m OD</td><td>IDEX Health &amp;与科学</td><td>UH-436</td><td></td></tr><tr><td>含0.1%甲酸（v/v）的液相色谱-质谱级水</td><td>Fisher Scientific</td><td>LS118-500</td><td></td></tr><tr><td>水，LC/MS级</td><td>Fisher Scientific</td><td>W6-4</td><td></td></tr></tbody></table>

利用细胞内快速光化学氧化蛋白质法表征细胞蛋白质

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

快速蛋白质光化学氧化（FPOP）是一种羟基自由基蛋白质足迹技术，用于表征蛋白质结构及其相互作用。FPOP 利用波长为 248 nm 的准分子激光器光解过氧化氢，产生羟基自由基。这些自由基可对 20 种氨基酸中的 19 种溶剂暴露的侧链进行氧化修饰。近年来，该方法已被应用于活细胞中（IC-FPOP），以研究蛋白质在其天然环境中的相互作用。在细胞内研究蛋白质能够反映分子间拥挤效应以及多种蛋白质相互作用，而这些在体外实验中往往会被破坏。为此，研究人员设计了一种定制的单细胞流动系统，以减少 IC-FPOP 过程中细胞的聚集和堵塞。该流动系统使细胞逐个通过准分子激光照射区域，从而确保照射条件的一致性。通过将 FPOP 产生的氧化程度与基于晶体结构计算得到的蛋白质溶剂可及性进行比较，IC-FPOP 能够精确探测蛋白质中溶剂可及的侧链区域。

IC-FPOP 是一种用于研究活细胞中蛋白质相互作用的足迹分析方法。在 IC-FPOP 流动系统中，H2O2 的暴露时间被限制在约 3 秒，因此可在不对细胞造成损害的情况下使用较高的 H2O2 浓度。该流动系统还包含两股鞘液缓冲液流，通过流体动力聚焦将细胞集中到管路中心，形成单一的细胞流，从而实现均匀辐照（图 5）9。正交 YZ 层扫荧光成像图（图 5A）显示鞘液缓冲液（含 FITC 荧光染料）与细胞溶液（含 TMRM 荧光染料）之间有清晰的分离。为突出这种分离效果，图 5B 和 图 5C 分别展示了鞘液缓冲液和细胞溶液的三维平均热图，表明两种溶液之间的混合极少。
使用单细胞流动系统可使氧化修饰蛋白的数量增加13倍（图6A）9。在该方法中，细胞多个区室中的蛋白质均被标记，其中膜蛋白、胞质蛋白以及细胞核内的蛋白质最为丰富8,9。为确保蛋白质修饰发生在完整细胞内，在H2O2处理和辐照后对CellROX处理的细胞进行了荧光成像（图6B）8。细胞在整个标记过程中的稳定性进一步证实了IC-FPOP在天然细胞环境中探测蛋白质的有效性。通过串联质谱技术，这些修饰可被精确定位于蛋白质的特定氨基酸上。图7展示了一例在IC-FPOP过程中发生的修饰及其对应的提取离子色谱图。提取离子色谱图中观察到的偏移反映了修饰肽段中甲硫氨酸氧化所引起的疏水性变化。
为了验证FPOP修饰是否能够探测细胞内蛋白的溶剂可及性，将细胞内标记的肌动蛋白与体外足迹分析研究以及多种肌动蛋白晶体结构进行了比较（图8）8。图中所示的细胞内标记肌动蛋白（图8A）显示出与Guan等人10报道的体外研究（图8B）相似程度的氧化修饰，表明肌动蛋白在细胞内和体外具有相似的溶剂可及性。为进一步确认IC-FPOP确实探测了肌动蛋白的溶剂可及性，将FPOP修饰的程度与根据两种肌动蛋白晶体结构计算得到的标记残基的溶剂可及性进行了比较（图8C）。该相关性表明，IC-FPOP能够很好地探测单体蛋白的溶剂可及性。
<img alt="光纤组件工艺示意图；连接器安装步骤、光纤插入、对准验证。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1：如何正确制作插芯。（A）在拧紧前，将插芯、石英管和套管一并放置到位。（B）将所有组件一起拧紧。（C）最终产品为套管上已牢固拧紧的插芯。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="飞秒激光瞬态吸收光谱实验装置；包含磁力搅拌器。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 2"> 
图 2：IC-FPOP 流动系统的搭建。（A）完全组装好的 IC-FPOP 流动系统放置在激光器旁的照片。（B）为增大 500 µL 注射器的外径，以便同时牢固固定所有注射器所需使用的垫片示例。（C）代表性图片，显示磁力搅拌器所需占用的空间。（D）需要使用堵头，以在不损坏注射器的情况下暂停注射泵运行。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="IC-FPOP 微流控流动系统示意图，包含鞘液缓冲液、细胞、H₂O₂；248 nm 光学激发。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3：为 IC-FPOP 开发的流动系统示意图。 蓝色管道代表内径 450 µm、外径 670 µm 的石英毛细管，红色管道内径为 150 µm、外径 360 µm，橙色管道内径为 75 µm、外径 360 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="蛋白质组学数据分析工作流程图，展示谱图选择和蛋白质鉴定节点。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 4"> 
图 4：用于检测 FPOP 修饰的蛋白质分析软件。 典型的工作流程，以及在每个节点中搜索的相应修饰。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微图像与强度图；荧光分布；三维光谱强度分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图5"> 
图5：单细胞流动系统通过流体动力学将细胞聚焦为单一液流。（A）正交YZ层扫描图像，显示被鞘液缓冲液（绿色，FITC荧光染料）包围的细胞分析物（红色，TMRM荧光染料）在三维空间中的聚焦情况。鞘液缓冲液的三维平均强度热图（B）和细胞分析物的三维平均强度热图（C）。较低强度以蓝色表示，最高强度以红色表示（B-C）。该图经Rinas等9修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="流动系统示意图与显微镜图像；医学研究中的细胞比较分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图6"> 
图6：IC-FPOP流动系统的使用显著增加了进样细胞中发生FPOP修饰的蛋白质数量。（A）使用与不使用流动系统时鉴定出的氧化蛋白质的比较。使用流动系统共鉴定出1391种FPOP修饰蛋白，而不使用流动系统仅鉴定出105种修饰蛋白，两者之间有58种修饰蛋白重叠。该图改编自Rinas等人的研究9。（B）IC-FPOP处理后经CellROX染色的细胞荧光成像显示，细胞在氧化标记后仍保持完整。细胞使用Olympus Fluoview FV1000 MPE多光子显微镜在665 nm波长下成像，图中显示为单层切片图像。该图改编自Espino等人的研究8 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="未修饰肽段和修饰肽段分析的质谱图谱及提取离子色谱图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 7"> 
图 7：IC-FPOP 过程中产生的串联质谱（MS/MS）图谱示例。 分别为（A）未修饰肽段和（B）在该肽段的 M8 残基上检测到的氧化修饰的产物离子（MS/MS）图谱。代表性提取离子色谱图显示了（C）未修饰肽段和（D）修饰肽段。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="用于结构分析的蛋白质修饰柱状图（A，B）和溶剂可及性散点图（C）" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60911/60911fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 8"> 
图 8：IC-FPOP 在探测蛋白质溶剂可及性方面具有有效性。（A）肌动蛋白中9个氧化修饰肽段的修饰程度。数值以平均值±标准差表示（n = 3）。（B）Guan 等人通过同步辐射辐解在体外氧化的肌动蛋白肽段的修饰情况10。（C）FPOP修饰程度与肌动蛋白在紧密态（三角形，虚线趋势线）和开放态（圆形，实线趋势线）中残基的溶剂可及表面积（SASA）的相关性。该图已根据 Espino 等人的研究修改8 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60911/60911fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本文利用一种称为细胞内快速光化学蛋白质氧化（IC-FPOP）的蛋白质足迹技术，在活细胞中表征蛋白质结构及相互作用位点。

快速蛋白质光化学氧化（FPOP）是一种羟基自由基蛋白质足迹技术，用于表征蛋白质结构及相互作用。

结合质谱技术的细胞内FPOP是一种强大的新兴技术，用于研究活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质结构变化。通过细胞内FPOP，无需分离目标蛋白质，即可在天然环境中对其进行研究。这对于膜蛋白尤其有益。通过该方法，您可以研究多种疾病（包括癌症和遗传性疾病）中的结构变化及蛋白质-蛋白质相互作用，从而更深入地理解并表征这些疾病。开始组装流式系统时，使用裂解石将熔融石英管切割至适当尺寸。接着，将六个小型圆柱形磁铁放入一支500微升注射器中，并用鞘液缓冲液填充该注射器、另一支500微升注射器以及两支5毫升注射器。除去空气后，将注射器置于注射泵上，并拧紧注射器泵的堵头，使电机停转时细胞注射器内剩余体积约为 50 µL。使用接头适配器，将手动阀门连接至每个注射器，并按图示组装石英管路，确保将含细胞和过氧化氢的石英管穿过十字接口，并直接插入内径为 450 ID 的石英管中。当所有管路连接完毕后，将流动系统置于激光器旁，用打火机烧除内径为 450 µm 的石英管表面的涂层，形成用于激光照射的窗口。将磁力搅拌器置于含有六个磁铁的细胞注射器上方，并将注射泵设置为492.4微升/分钟，以实现最终流速为1083.3微升/分钟。用缓冲液以相同流速冲洗系统三次，检查每个连接处是否有泄漏。使用凸透镜将准分子激光聚焦到石英管上。为测试辐照窗口，将一小片纸置于石英管后方并打开激光器。随后测量辐照造成的烧蚀区域，并结合辐照窗口和流速计算获得零排除分数所需的激光频率。为收集实验所需细胞，使用适当的细胞培养级盐溶液冲洗70%至90%融合度的T175培养瓶中的细胞。用10毫升缓冲液重悬细胞用于计数，并通过离心收集细胞。必须对细胞进行计数，以确保其数量足以进行后续分析，但又不会过多而导致细胞聚集并堵塞流式系统。然后将细胞重悬于鞘液缓冲液中，使细胞浓度为每毫升2×10⁶个细胞，并将细胞分装为每份样品500微升。进行细胞内FPOP实验时，用新鲜鞘液缓冲液填充两个5毫升注射器，用一份细胞悬液填充含有磁珠的500微升注射器，用新配制的200毫摩尔过氧化氢填充最后一个500微升注射器。打开磁力搅拌器，并向一份淬灭剂中加入220微升二甲基亚砜。轻轻混匀后，将淬灭剂置于流式系统后方以收集经照射的样品，然后打开激光器。七秒后，启动流体系统。待样品完全流过之后，关闭激光器，并轻轻将淬灭剂与收集的样品混合。接着，用新鲜缓冲液填充全部四个注射器，并将缓冲液冲洗流经整个流体系统。系统完成冲洗后，使用新的一份细胞和溶液重复上述操作，但不进行照射，作为无激光对照，以排除细胞内背景氧化的影响。在运行下一个样品的同时，将第一个样品离心，并将沉淀重悬于100 µL适当的细胞裂解缓冲液中。随后，将样品转移至微量离心管中，置于液氮中进行速冻。当所有样品完成运行后，拆卸流路系统并丢弃已使用的石英管。随后，将所有其他连接部件置于50%水和50%甲醇的溶液中，超声清洗一小时。按照标准操作流程从细胞裂解液中分离并消化蛋白质后，根据标准的串联液相色谱-质谱（LCMS）操作流程分析消化后的细胞裂解液，以在全蛋白质组范围内定位FPOP修饰位点。然后，将数据导入合适的蛋白质分析软件程序，并针对相关的蛋白质数据库和相应的消化酶对数据进行分析。文件搜索完成后，计算目标蛋白质的FPOP氧化程度。正交YZ堆叠图像的荧光成像显示，在流经激光照射窗口时，鞘液与细胞溶液之间呈现出清晰的分离。可以生成鞘液缓冲液或细胞溶液的三维平均热图，以说明两种溶液之间的混合程度极低。使用单细胞流动系统可使氧化修饰的蛋白质数量增加13倍。为了确认目标蛋白质在完整细胞内的修饰情况，可在过氧化氢处理和照射后进行荧光成像。利用串联质谱技术，可将这些修饰进一步定位到蛋白质的特定氨基酸上。在该提取离子色谱图中观察到的偏移，反映了因修饰肽段中甲硫氨酸氧化所引起的疏水性变化。通过体外足迹法比较细胞内标记的肌动蛋白，发现其氧化程度相似，表明肌动蛋白在细胞内和体外实验中具有相似的溶剂可及性。此外，将目标蛋白的快速光化学氧化修饰程度与溶剂可及性进行比较，并结合两个肌动蛋白晶体结构计算出的标记残基，结果表明，细胞内快速光化学氧化技术能够有效探测单体蛋白的溶剂可及性。为进一步提高低丰度FPOP修饰的检测，还可采取若干额外步骤，包括二维色谱、亚细胞分级分离以及蛋白质组学多重分析技术。通过应用细胞内FPOP技术，我们现在能够开展蛋白质结构生物学研究，从而更好地将蛋白质结构与细胞功能联系起来。由于FPOP需要248纳米波长的紫外光，务必始终佩戴紫外防护眼镜并穿着适当的防护服，以避免意外暴露于反射或散射的辐射中。

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无需激光的羟基自由基蛋白质足迹法用于蛋白质高级结构分析

一种新的静态平台被用于在天然细胞环境中表征蛋白质结构及相互作用位点，该方法利用了一种称为细胞内快速光化学氧化蛋白质（IC-FPOP）的蛋白质足迹技术。...

带有可移动XY载物台的培养箱平台：一种用于细胞内快速光化学蛋白质氧化的新平台

了解细胞内快速光化学氧化蛋白质技术用于活细胞中蛋白质相互作用与结构变化研究的方法。该技术结合质谱分析可在天然环境中表征膜蛋白，为癌症和遗传疾病研究提供重要信息。

利用细胞内快速光化学氧化蛋白质法表征细胞蛋白质

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