利用细胞内快速光化学氧化蛋白质法表征细胞蛋白质

结合质谱技术的细胞内FPOP是一种强大的新兴技术，用于研究活细胞中的蛋白质-蛋白质相互作用以及蛋白质结构变化。通过细胞内FPOP，无需分离目标蛋白质，即可在天然环境中对其进行研究。这对于膜蛋白尤其有益。

通过该方法，您可以研究多种疾病（包括癌症和遗传性疾病）中的结构变化及蛋白质-蛋白质相互作用，从而更深入地理解并表征这些疾病。开始组装流式系统时，使用裂解石将熔融石英管切割至适当尺寸。接着，将六个小型圆柱形磁铁放入一支500微升注射器中，并用鞘液缓冲液填充该注射器、另一支500微升注射器以及两支5毫升注射器。

除去空气后，将注射器置于注射泵上，并拧紧注射器泵的堵头，使电机停转时细胞注射器内剩余体积约为 50 µL。使用接头适配器，将手动阀门连接至每个注射器，并按图示组装石英管路，确保将含细胞和过氧化氢的石英管穿过十字接口，并直接插入内径为 450 ID 的石英管中。当所有管路连接完毕后，将流动系统置于激光器旁，用打火机烧除内径为 450 µm 的石英管表面的涂层，形成用于激光照射的窗口。

将磁力搅拌器置于含有六个磁铁的细胞注射器上方，并将注射泵设置为492.4微升/分钟，以实现最终流速为1083.3微升/分钟。用缓冲液以相同流速冲洗系统三次，检查每个连接处是否有泄漏。使用凸透镜将准分子激光聚焦到石英管上。

为测试辐照窗口，将一小片纸置于石英管后方并打开激光器。随后测量辐照造成的烧蚀区域，并结合辐照窗口和流速计算获得零排除分数所需的激光频率。为收集实验所需细胞，使用适当的细胞培养级盐溶液冲洗70%至90%融合度的T175培养瓶中的细胞。

用10毫升缓冲液重悬细胞用于计数，并通过离心收集细胞。必须对细胞进行计数，以确保其数量足以进行后续分析，但又不会过多而导致细胞聚集并堵塞流式系统。然后将细胞重悬于鞘液缓冲液中，使细胞浓度为每毫升2×10⁶个细胞，并将细胞分装为每份样品500微升。

进行细胞内FPOP实验时，用新鲜鞘液缓冲液填充两个5毫升注射器，用一份细胞悬液填充含有磁珠的500微升注射器，用新配制的200毫摩尔过氧化氢填充最后一个500微升注射器。打开磁力搅拌器，并向一份淬灭剂中加入220微升二甲基亚砜。轻轻混匀后，将淬灭剂置于流式系统后方以收集经照射的样品，然后打开激光器。

七秒后，启动流体系统。待样品完全流过之后，关闭激光器，并轻轻将淬灭剂与收集的样品混合。接着，用新鲜缓冲液填充全部四个注射器，并将缓冲液冲洗流经整个流体系统。

系统完成冲洗后，使用新的一份细胞和溶液重复上述操作，但不进行照射，作为无激光对照，以排除细胞内背景氧化的影响。在运行下一个样品的同时，将第一个样品离心，并将沉淀重悬于100 µL适当的细胞裂解缓冲液中。随后，将样品转移至微量离心管中，置于液氮中进行速冻。

当所有样品完成运行后，拆卸流路系统并丢弃已使用的石英管。随后，将所有其他连接部件置于50%水和50%甲醇的溶液中，超声清洗一小时。按照标准操作流程从细胞裂解液中分离并消化蛋白质后，根据标准的串联液相色谱-质谱（LCMS）操作流程分析消化后的细胞裂解液，以在全蛋白质组范围内定位FPOP修饰位点。

然后，将数据导入合适的蛋白质分析软件程序，并针对相关的蛋白质数据库和相应的消化酶对数据进行分析。文件搜索完成后，计算目标蛋白质的FPOP氧化程度。正交YZ堆叠图像的荧光成像显示，在流经激光照射窗口时，鞘液与细胞溶液之间呈现出清晰的分离。

可以生成鞘液缓冲液或细胞溶液的三维平均热图，以说明两种溶液之间的混合程度极低。使用单细胞流动系统可使氧化修饰的蛋白质数量增加13倍。为了确认目标蛋白质在完整细胞内的修饰情况，可在过氧化氢处理和照射后进行荧光成像。

利用串联质谱技术，可将这些修饰进一步定位到蛋白质的特定氨基酸上。在该提取离子色谱图中观察到的偏移，反映了因修饰肽段中甲硫氨酸氧化所引起的疏水性变化。通过体外足迹法比较细胞内标记的肌动蛋白，发现其氧化程度相似，表明肌动蛋白在细胞内和体外实验中具有相似的溶剂可及性。

此外，将目标蛋白的快速光化学氧化修饰程度与溶剂可及性进行比较，并结合两个肌动蛋白晶体结构计算出的标记残基，结果表明，细胞内快速光化学氧化技术能够有效探测单体蛋白的溶剂可及性。为进一步提高低丰度FPOP修饰的检测，还可采取若干额外步骤，包括二维色谱、亚细胞分级分离以及蛋白质组学多重分析技术。通过应用细胞内FPOP技术，我们现在能够开展蛋白质结构生物学研究，从而更好地将蛋白质结构与细胞功能联系起来。

由于FPOP需要248纳米波长的紫外光，务必始终佩戴紫外防护眼镜并穿着适当的防护服，以避免意外暴露于反射或散射的辐射中。