少突胶质细胞的生成及其条件培养基的制备用于共培养实验

我们介绍了一种高效的少突胶质细胞系细胞纯化与培养方法。该方法可用于研究调控少突胶质细胞分化及其在髓鞘形成过程中与神经元相互作用的分子机制。这种振荡培养技术成本较低，是获得大量少突胶质细胞的理想方法。

此类培养可用于制备少突胶质细胞条件培养基，以及少突胶质细胞与神经元的共培养。多发性硬化是一种由中枢神经系统局灶性脱髓鞘引起的疾病，继发于少突胶质细胞的丢失。少突胶质细胞培养为深入理解如何促进再髓鞘化提供了研究工具。

只有少突胶质细胞培养才能提供关于调控少突胶质细胞发育和生物学内在机制的见解。与神经元的共培养有助于深入了解其对神经元生理学的影响。开始时，使用弯镊将动物头部固定在眼睛水平位置。

使用小型手术剪在颅底处做一个小切口，并沿脑中线剪开颅骨。用镊子从正中线轻轻剥离颅骨的两部分。使用小型手术勺将脑组织从颅腔中取出。

将脑组织置于含有冰冷 PBS 葡萄糖溶液的 60 毫米培养皿中，并保持在冰上。在体视显微镜下观察，用精细镊子去除小脑、脑干和嗅球，分离大脑半球。用精细镊子将两个大脑半球分开。

使用精细镊子剥离脑膜。将大脑皮层置于冰上的60毫米培养皿中。在超净工作台内，用锋利的手术刀将大脑皮层仔细切碎。

将切碎的组织转移至含有酶消化液的50毫升离心管中。在37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中孵育30分钟。随后，用移液器轻轻吸除酶消化液，同时确保皮质组织仍留在管底。

使用 P1000 移液器加入一毫升含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基，轻柔吹打组织。使用 70 微米滤膜和一毫升注射器的推杆将皮质组织过滤至 50 毫升离心管中。用含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基多次冲洗 50 毫升离心管内壁上残留的组织。

用含10%胎牛血清的DMEM填充50毫升离心管，在室温下以423 ×g离心5分钟。小心吸去上清液，并用2毫升含10%胎牛血清的DMEM重悬细胞沉淀。

用P1000移液器轻轻吹打细胞沉淀，随后用P200移液器继续吹打。用适量体积的含10%胎牛血清的DMEM培养基稀释细胞悬液。将5毫升细胞悬液以每平方厘米1×10⁵个细胞的密度接种至T-150培养瓶中。

向每个T-150培养瓶中加入20毫升含10%胎牛血清的温热DMEM培养基。置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育。在37摄氏度、250转/分钟条件下振荡培养过夜后，收集培养瓶中的上清液，其中主要含有少突胶质细胞系细胞，同时也含有少量小胶质细胞，并将其接种至未包被的100毫米培养皿中。

将培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育15分钟。此步骤可利用小胶质细胞在培养皿表面差异性快速贴壁的特性将其去除。在此期间，向每个T-150培养瓶中加入25毫升预热的新鲜配制的培养基，并将培养瓶置于37摄氏度、5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育，直至第二次摇晃。

接下来，将培养皿中的上清液转移至新的未包被的100毫米培养皿中，以使残留的小胶质细胞贴壁。将培养皿置于37°C、含5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育15分钟。收集每两个培养皿中的上清液（含有非贴壁的少突胶质细胞系细胞），并将其转移至50毫升离心管中。

弃去接种有小胶质细胞的培养皿。将离心管在423 × g条件下离心5分钟。小心移除上清液，并用1 mL Bottenstein-Sato培养基重悬细胞沉淀。

将所有沉淀收集至一个共同的50毫升离心管中，并根据细胞密度用博滕斯坦-萨托培养基调整体积至20或30毫升。取10毫升细胞悬液接种到两到三个预先包被的100毫米培养皿中。在37摄氏度、5%二氧化碳的湿润培养箱中孵育。

两小时后，通过更换所有博滕斯坦-萨托培养基来清除培养皿中的碎片。在37摄氏度、5%二氧化碳的湿化培养箱中，于培养基中继续培养两天。两天后，在显微镜下观察培养物。

在超净工作台内，于无菌条件下，使用 10 毫升温热的 MPB-27 低培养基更换培养液。将细胞置于 37 摄氏度、含 5% 二氧化碳的湿化培养箱中孵育两天。为收集 OCM，收集含有少突胶质细胞分泌因子的上清液。

使用0.22微米滤器对OCM进行过滤除菌。在本方案中，少突胶质细胞系细胞通过振荡去除星形胶质细胞和小胶质细胞，从胶质细胞培养物中纯化获得。对不同标志物表达的分析表明，少突胶质细胞培养物主要为前少突胶质细胞，其中O4阳性细胞占90 ± 4%，NG2阳性细胞占85 ± 7%，PLP阳性细胞占4.7 ± 2.1%，而GFAP阳性星形胶质细胞占7.2 ± 2.5%。

将此类培养物产生的OCM在体外培养三天后添加至纯化的海马神经元培养物中。该处理可促进notal蛋白的聚集。通过在体外培养14天时添加少突胶质细胞，研究海马神经元的髓鞘化。

体外培养20至24天后，通过髓鞘标志物（如髓鞘碱性蛋白）的免疫染色，可观察到髓鞘节段和郎飞结。核心PBS对于脑膜的去除至关重要。快速清洗对少突胶质细胞的存活以及准确控制移液管施加的流体剪切力强度具有关键作用。

可将少突胶质细胞条件培养基添加至神经元培养物中，以深入了解少突胶质细胞分泌因子对神经元生理功能的影响。也可将少突胶质细胞与神经元进行共培养，以研究髓鞘形成过程。