细菌群的延时成像与集体压力反应
May 23rd, 2020
我们详细介绍了一个简单的方法，以产生高分辨率延时电影的伪单一aeruginosa群，响应噬菌体（噬菌体）和抗生素压力使用平板文档扫描仪。这个过程是一种快速而简单的监测蜂群动力学的方法，可应用于研究其他细菌物种的动能和生长。
该协议可用于制作伪多莫纳斯aeruginosa群的延时电影，并捕获细菌或抗生素对蜂群的排斥。延时电影捕捉了大量对抗生素和噬菌体反应的详细动态，该技术只需要除湿机、计算机、孵化器和文档扫描仪。要为 P.aeruginosa 蜂长延时成像准备蜂拥的阿加片，请使用 25 毫升移液器在每个实验的 10 厘米直径 Petri 盘上添加 20 毫升的蜂拥糖溶液。
将板放在一个堆叠中，盖在室温下一小时。打开除湿机，将房间的相对湿度降低至40-50%当加糖凝固时，在层压流罩中再干燥蜂拥的阿加板30分钟，盖上盖子，以每分钟300立方英尺的速度朝上，室温下的相对湿度为40-50%。然后在4摄氏度下储存干蜂的阿加板长达24小时。
对于蜂拥的阿加电镀，握一个 P20 移液器尖端，装有五微升从隔夜 P.aeruginosa 培养，在一个蜂拥板中心上方 10-45 度角 2-1/2 厘米处，将柱塞压到仅液体掉落处接触 agar 的第一站。使用模板将点一致地定位在不同的蜂拥盘上。为了对噬菌体感染进行盘，首先将30微升过夜培养的P.aeruginosa与6微升混合，每毫升噬菌体DMS3 vir的12个斑块形成单位，并立即在2.8厘米半径同心圆的6个等距卫星位置添加6微升的P.aeruginosa噬菌体混合物。
使用模板将点一致地定位在不同的蜂拥盘上。要进行板式抗生素处理，将30微升过夜培养的P.aeruginosa与感兴趣的抗生素的适当浓度和体积混合，并立即在6个等距卫星位置的6个等距卫星位置，在菜盘中心周围2.8厘米半径的同心圆上添加6微升抗生素处理细菌。使用模板将点一致地定位在不同的蜂拥盘上。
当所有培养物都镀上时，用定制的黑色盖子替换清晰的培养皿盖。小心地将蜂拥的阿加板放在扫描仪上，在 37 摄氏度的培养箱中安装 10 升水浴，使湿度保持 75%。若要自动进行图像采集，请使用脚本软件。
选择空闲扫描和单次扫描，右键单击空闲扫描，然后左键单击启用。在孵化结束时，将所有扫描的图像导入 ImageJ。在序列选项窗口中，图像数将指示所选图像数。
将图像从一个图像开始，从文件夹中的第一张图片开始，将图像缩放为 100%，以保留图像的原始大小。单击"隐藏到 RGB"以保留图像的颜色。保留未选中使用虚拟堆栈，然后单击"确定"以加载映像。
单击文件，保存为 和 AVI 将图像合并到 AVI 文件中。将压缩调整为 JPEG，将帧速率调整为每秒五帧。然后将 AVI 延时保存在相应的存储文件夹中。
在37摄氏度的LB肉汤中，从LB的一个LB阿加板对一个野生型P.aeruginosa的单一殖民地进行延时成像，并发现进入蜂拥的阿加板的中心，发现在板块中心形成一个殖民地，从菌群径向扩散。沼泽从蜂拥的阿加板中心移动到外围，被感染噬菌体或用根塔霉素治疗的细菌发出的应激信号击退。单独在卫星位置发现的噬菌体或根塔姆霉素不会导致蜂拥而至的人口避开这些区域。
使用 25 毫升移液器，确保蜂拥的阿加板包含正好 20 毫升。根据实验室环境调整板材干燥时间也很重要。我们的技术使我们能够可视化伪多莫纳斯亚鲁吉诺萨种群的整体蜂群模式。
下一个目标是使用光明场显微镜监测单个细胞的活力。
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概述
本研究详细介绍了一种简单的方法，用于制作高分辨率时间延迟动态影片，记录绿脓杆菌在受到噬菌体和抗生素压力时的群体行为。该技术允许对群体动力学进行实时监控，可以适用于研究各种细菌物种的运动性和生长。
关键研究组成部分
研究领域
- 细菌群体动力学
- 对噬菌体和抗生素处理的反应
- 时间延迟成像技术
背景
- 了解细菌群体的行为对于微生物生态学至关重要。
- 噬菌体和抗生素对细菌的影响可以揭示重要的相互作用。
- 时间延迟动态影片提供了细菌行为随时间变化的视觉洞察。
使用的方法
- 通过文档扫描仪进行时间延迟成像
- 绿脓杆菌作为模式生物
- 使用ImageJ软件进行图像处理
主要结果
- 可视化展示了细菌在受到噬菌体和抗生素影响时的群体模式。
- 细菌显示对噬菌体或抗生素处理区域的排斥。
- 研究结果支持了噬菌体和抗生素在影响细菌运动中的作用。
结论
- 该技术有效地可视化并定量了细菌的群体行为。
- 研究结果对于理解微生物对处理的反应具有重要意义。
常见问题解答
Executive Industry Relevance
This method enables high-resolution, cost-effective monitoring of bacterial swarming dynamics and collective stress responses, providing quantitative phenotypic data for target de-risking in antimicrobial discovery. By visualizing repulsion behaviors induced by phage or antibiotic exposure, it supports mechanistic interrogation of compound effects on microbial motility and virulence pathways. The approach offers a scalable, reproducible platform for early-stage phenotypic screening and pathway validation in antibacterial R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying swarm repulsion as a phenotypic readout of stress response activation.
- Operational Value: Uses accessible instrumentation (document scanner, incubator) to standardize swarm imaging across laboratories.
- Predictive Value: Supports target confidence by linking compound exposure to measurable changes in collective bacterial behavior.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative time-lapse data on swarm expansion rates and spatial patterns for dose-response profiling.
- Operational Value: Automates image acquisition via scripting software, enabling consistent, high-throughput data capture.
- Assay Readiness: Produces standardized AVI outputs at five frames per second for downstream image analysis in tools like ImageJ.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects in vitro swarm behavior to potential in vivo biofilm and dispersal phenotypes relevant to infection models.
- Mechanistic De-risking: Isolates the collective stress response as a biomarker-like output for evaluating antimicrobial mechanism of action.
- Pathway Clarification: Distinguishes direct growth inhibition from behavior-modifying effects of phage or antibiotics on swarm dynamics.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows, supporting lead identification by providing phenotypic readouts that complement growth-based assays and help prioritize compounds with anti-virulence or anti-biofilm potential.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of how antimicrobials affect microbial collective behaviors beyond planktonic growth.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs suitable for assay standardization and inter-laboratory comparison.
- Analytics: Generates morphometric and kinetic parameters (e.g., tendril expansion, repulsion zones) for statistical comparison across treatment conditions.
- Translational Research: Links swarm repression to reduced surface colonization, a trait associated with persistent infections.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform adaptable to multiple bacterial species and stressor types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by separating effects on motility from effects on viability.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized plate preparation, humidity control, and automated scanning intervals.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying compounds that disrupt virulence-associated behaviors early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads showing dual action on growth and swarming behavior.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbiological techniques and sterile plate preparation.
- Depends on access to a document scanner, incubator with humidity control, and image analysis software.
- Necessitates standardization of inoculation timing, spot placement, and environmental conditions across replicates.
- Involves adaptation considerations when extending to non-swarming or fastidious bacterial species.
- Limited to surface-associated behaviors; does not replace planktonic growth or biofilm thickness assays.
