一种利用异染色质促进药物筛选的鉴定方法 果蝇

目前尚无明确能够促进异染色质形成的药物。本文介绍一种简单且高效的方法，用于鉴定可促进该过程的小分子化合物。我们的筛选方案提供了一种简单、经济且易于操作的体内系统，可用于鉴定促进异染色质形成的药物。

鉴定能够促进异染色质形成的化合物可能有助于揭示癌症的修复机制并推动癌症治疗的发展。这种成本效益较高的方法已用于在果蝇中鉴定促进异染色质的化合物，也可用于统计筛选命中数，因其可作为细胞筛选中高通量细胞池的预防性措施。我们的筛选方案还可用于快速的预实验筛选，因为该果蝇TranSheet系统会产生花斑眼色表型，其表型强度与果蝇体内异染色质含量呈负相关。

我们的实验室本科生 Kenny Dao 将协助演示该实验步骤。在确定并制备用于筛选的药物文库时，需使用合适的溶剂和目标浓度，并在含有九毫米标准果蝇培养基的25 × 95毫米食物小瓶中，将三只雄蝇与三只或更多处女雌蝇进行杂交。

为每种药物设置三个重复样品管，为筛选实验添加一个对照管，并在室温下让果蝇产卵两天。

在杂交的第二天，用短暂的二氧化碳气流麻醉果蝇，并将亲代果蝇丢弃至含有70%乙醇的瓶子中。接下来，将每种药物化合物从初始储备液稀释至终浓度为微摩尔级别，溶剂为33%DMSO水溶液。

在果蝇培养基上加入60 µL药物，或仅加入对照33% DMSO。然后确认试管内无亲代果蝇存在，并将药物溶液加入相应的试管中。

在F1代果蝇羽化后的两天，将麻醉的果蝇逐管转移至多孔解剖垫上，垫下通过滤纸通入二氧化碳。在解剖显微镜下检查每只完整的果蝇，根据其不具有卷曲的显性卷翅表型来鉴定所有杂合雄蝇。按照1到5的等级对每只杂合雄蝇的眼色进行评分。

若果蝇眼睛红色斑点的总面积小于5%，则记为1分；若果蝇眼睛红色斑点的总面积为6%至25%，则记为2分；若果蝇眼睛红色斑点的总面积为26%至50%，则记为3分。

四只果蝇的红斑眼总面积占41%至75%，五只果蝇的红斑眼总面积超过75%。然后计算每瓶中重复评分的全部雄性果蝇的平均颜色指数。

为了证实这些化合物确实能够促进异染色质的形成，可采用另一种验证技术，例如蛋白质印迹法（western blotting）。在本项代表性实验中，使用黑腹果蝇（Drosophila Melanogaster）的DX1品系，对一个小分子药物文库“肿瘤学套装3”（oncology set 3）进行了筛选，该文库包含97种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的肿瘤学药物。根据筛选实验结果，文库中编号为E7的药物甲氨蝶呤（methotrexate）在DX1品系中引起了最显著的变化。

这表明甲氨蝶呤可能是未来癌症靶向治疗中最具前景的促进异染色质形成的药物。为进一步证实该化合物可促进异染色质转化，进行了蛋白质印迹实验，结果显示异染色质形成相关蛋白H3K9三甲基化水平上调，从而验证了筛选结果。

关键步骤是按照预定的研究方案，对每只白眼11-18 DX1杂合雄性果蝇的眼色进行评分，评分范围为1至5分。我们可以使用蛋白质印迹（Western blot）或免疫染色来验证筛选结果。发现可能促进异染色质形成的化合物，也可能有助于揭示癌症发生发展的IV型遗传机制，并推动在人类患者中开展临床试验。