在三维生物打印中使用多层水凝胶生物油墨，实现均匀细胞分布

使用我们的协议，液体类生物墨水稀释的多层不仅促进封装细胞的均匀分散性，而且保持一个适合细胞的生物墨环境。我们使用面间张力来阻止生物墨库内封装的细胞沉积，避免挤出印刷过程中对细胞的高剪切应力负荷。利用这项技术，我们可以生成具有均匀细胞分布的3D组织结构，为药物筛选和再生医学研究提供体外组织模具的功能。

在制备生物墨时，注意实验温度和湿胶囊加载过程非常重要，因为这些因素会影响油墨的质量。在开始制备之前，使用0.22微米注射器过滤装置对所有材料进行消毒，并在生物安全柜中将明胶溶解到50摄氏度PBS中10%的最终浓度。以0.6比1的重量比在明胶溶液中加入美丙烯酸酯，在50摄氏度下缓慢搅拌至少一小时。

在孵育结束时，将混合溶液转移到无菌的50毫升管中，通过离心将溶液分离成层。收集上部 GelMA 层，用两卷 40 至 50 摄氏度的去化水稀释收集的溶液。在40至50摄氏度下，用12至14千塔顿分子量切断透析膜对脱水进行5至7天的透析，每天更换两次水。

在透析结束时，将 GelMA 溶液冻结在零下 80 摄氏度的温度下过夜。接下来，在零下 45 摄氏度和 0.2 毫巴压力的冷冻干燥机中，将 GelMA 溶液冻干三到五天。然后溶解PBS中的冻干凝胶，辅以10%的胎儿牛血清、25毫摩尔的 HEPES 和 0.5% 的光启动器。

为了获得丝纤维素凝胶MA生物墨水，混合凝胶MA溶液与不同体积的初始丝纤维素溶液和不同体积的PBS，如表中所示。当所有生物墨水都准备好后，对溶液进行10至20分钟的声波化。当油墨进行声波化时，从80%汇合的NIH/3T3细胞培养物中收集到每个生物墨水溶液中一个15毫升锥形管中的细胞，通过离心使细胞产生颗粒。

然后小心地吸制超生，然后用两毫升生物墨水将细胞重新给每毫升生物墨水溶液浓度的六个细胞。要加载生物墨水进行打印，请将400微升的细胞填充丝纤维素0.5 GelMA添加到两毫升注射器的底层。将注射器放在零摄氏度的冰水浴中5分钟，将底层生物墨水转化为凝胶状态，然后将400微升的细胞填充丝纤维素0.75 GelMA生物墨水装到丝纤维素0.5 GelMA层上。

然后将注射器返回到冰浴中五分钟，继续以相同方式将每增加一个细胞填充生物墨水浓度添加到注射器中。当不同层内不同浓度的丝纤维素的多层生物墨水系统实现时，在37摄氏度的培养箱中重新加热生物墨水30分钟。在孵化结束时，将 27 规格的打印喷嘴加载到注射器上，将流量速度设置为每分钟 50 微升，将喷嘴的移动速度设置为 2 毫升/秒，将喷嘴的高度设置为 1 毫米。

接下来，在室温下使用定制的生物打印机以挤出方式打印组织结构，并在 800 毫瓦下用 365 纳米的紫外光将生物打印组织结构相连接，40 秒。然后在DMEM培养交叉链接组织结构，在细胞培养培养箱中辅以10%的胎儿血清和1%青霉素链霉素，在头两天和之后每两到三天每8小时更换一次培养。在这个代表性的分析中，随着生物打印程序的进行，目标井中的细胞密度在所有组中都有所下降。

在丝纤维素零凝胶MA组中，大约70%的细胞沉积在底层。在丝纤维素一个GelMA组中，大约40%的细胞沉积在底层，大约5%的细胞沉积在顶层。在丝纤维素多层GelMA组中，封装细胞的沉积比对照组更均匀。

该协议最关键的部分是加载SF-GelMA生物墨水多层。该协议可应用于使用液体样生物墨的其他挤出生物打印分析。