Name: 生成基于人类 iPSC 的血脑屏障芯片 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: 了解如何利用诱导多能干细胞在器官芯片上构建个性化血脑屏障模型，用于预测中枢神经系统药物渗透性并研究神经系统疾病机制。该技术为药物筛选和神经科学研究提供重要平台。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢 Soshana Svendsen 博士的审阅与修改。本工作由以色列科学基金会资助（项目编号 1621/18）、以色列科学与技术部（MOST）（项目编号 3-15647）、加州再生医学研究所资助（项目编号 DISC1-08800）、Sherman 家族基金会、美国国立卫生研究院神经疾病与中风研究所（NIH-NINDS）资助（项目编号 1UG3NS105703）以及美国肌萎缩侧索硬化症协会资助（项目编号 18-SI-389）。AH 由 Wallenberg 基金会资助（项目编号 2015.0178）。

<ol><li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+endogenous+transporters+as+therapeutic+targets%3A+a+new+model+for+small+molecule+CNS+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Therapeutic+Targets%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier endogenous transporters as therapeutic targets: a new model for small molecule CNS drug discovery.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 19 (8), 1059-1072 (2015).</li>
<li>Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+blood-brain+barrier%3A+beyond+the+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Modeling the blood-brain barrier: beyond the endothelial cells.</a> Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).</li>
<li>Jamieson, J. J., Linville, R. M., Ding, Y. Y., Gerecht, S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+iPSC-derived+pericytes+on+barrier+function+of+iPSC-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+in+2D+and+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">Role of iPSC-derived pericytes on barrier function of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells in 2D and 3D.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 16 (1), 15(2019).</li>
<li>El-Habashy, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+treatment+strategies+for+brain+tumors+and+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Patent+Analyst%22%5BJournal%5D)">Novel treatment strategies for brain tumors and metastases.</a> Pharmaceutical Patent Analyst. 3 (3), 279-296 (2014).</li>
<li>Lim, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntington%27s+disease+iPSC-derived+brain+microvascular+endothelial+cells+reveal+WNT-mediated+angiogenic+and+blood-brain+barrier+deficits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Huntington's disease iPSC-derived brain microvascular endothelial cells reveal WNT-mediated angiogenic and blood-brain barrier deficits.</a> Cell Reports. 19 (7), 1365-1377 (2017).</li>
<li>Dumitrescu, A. M., Liao, X. H., Weiss, R. E., Millen, K., Refetoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+thyroid+hormone+deprivation+and+excess+in+monocarboxylate+transporter+%28mct%29+8-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific thyroid hormone deprivation and excess in monocarboxylate transporter (mct) 8-deficient mice.</a> Endocrinology. 147 (9), 4036-4043 (2006).</li>
<li>Spencer, J. I., Bell, J. S., DeLuca, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+pathology+in+multiple+sclerosis%3A+reframing+pathogenesis+around+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology+and+Neurosurgical+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Vascular pathology in multiple sclerosis: reframing pathogenesis around the blood-brain barrier.</a> Journal of Neurology and Neurosurgical Psychiatry. 89 (1), 42-52 (2018).</li>
<li>Yamazaki, Y., Kanekiyo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-brain+barrier+dysfunction+and+the+pathogenesis+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Blood-brain barrier dysfunction and the pathogenesis of Alzheimer's disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (9), 1965(2017).</li>
<li>Ben-Zvi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mfsd2a+is+critical+for+the+formation+and+function+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier.</a> Nature. 509 (7501), 507(2014).</li>
<li>Heng, M. Y., Detloff, P. J., Albin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+genetic+models+of+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Rodent genetic models of Huntington disease.</a> Neurobiology of Disease. 32 (1), 1-9 (2008).</li>
<li>Ho, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS+disrupts+spinal+motor+neuron+maturation+and+aging+pathways+within+gene+co-expression+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ALS disrupts spinal motor neuron maturation and aging pathways within gene co-expression networks.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1256(2016).</li>
<li>Griep, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BBB+on+chip%3A+microfluidic+platform+to+mechanically+and+biochemically+modulate+blood-brain+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Microdevices%22%5BJournal%5D)">BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function.</a> Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).</li>
<li>Prabhakarpandian, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+tumor+networks+for+screening+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+controlled+release%22%5BJournal%5D)">Synthetic tumor networks for screening drug delivery systems.</a> Journal of controlled release. 201, 49-55 (2015).</li>
<li>Delsing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barrier+properties+and+transcriptome+expression+in+human+iPSC-derived+models+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Barrier properties and transcriptome expression in human iPSC-derived models of the blood-brain barrier.</a> Stem Cells. 36 (12), 1816-1827 (2018).</li>
<li>Park, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-enhanced+Blood-Brain+Barrier+Chip+recapitulates+human+barrier+function+and+shuttling+of+drugs+and+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-enhanced Blood-Brain Barrier Chip recapitulates human barrier function and shuttling of drugs and antibodies.</a> Nature Communications. 10 (1), 2621(2019).</li>
<li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-Derived+Blood-Brain+Barrier+Chips+Enable+Disease+Modeling+and+Personalized+Medicine+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-Derived Blood-Brain Barrier Chips Enable Disease Modeling and Personalized Medicine Applications.</a> Cell Stem Cell. 24 (6), 995-1005 (2019).</li>
<li>Henry, O. Y. F., Villenave, R., Cronce, M. J., Leineweber, W. D., Benz, M. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organs-on-chips+with+integrated+electrodes+for+trans-epithelial+electrical+resistance+%28TEER%29+measurements+of+human+epithelial+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Organs-on-chips with integrated electrodes for trans-epithelial electrical resistance (TEER) measurements of human epithelial barrier function.</a> Lab on a Chip. 17 (13), 2264-2271 (2017).</li>
<li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-derived+endothelial+cells+and+microengineered+organ+chip+enhance+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-derived endothelial cells and microengineered organ chip enhance neuronal development.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1222-1236 (2018).</li>
<li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+utilization+of+induced+pluripotent+stem+cell%E2%80%93derived+human+intestinal+organoids+using+microengineered+chips%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Enhanced utilization of induced pluripotent stem cell–derived human intestinal organoids using microengineered chips.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 669-677 (2018).</li>
<li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZ+spheres%3A+a+stable+and+expandable+culture+system+for+the+generation+of+pre-rosette+multipotent+stem+cells+from+human+ESCs+and+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">EZ spheres: a stable and expandable culture system for the generation of pre-rosette multipotent stem cells from human ESCs and iPSCs.</a> Stem Cell Research. 10 (3), 417-427 (2013).</li>
<li>Shelley, B. C., Gowing, G., Svendsen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cGMP-applicable+expansion+method+for+aggregates+of+human+neural+stem+and+progenitor+cells+derived+from+pluripotent+stem+cells+or+fetal+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A cGMP-applicable expansion method for aggregates of human neural stem and progenitor cells derived from pluripotent stem cells or fetal brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51219(2014).</li>
<li>Vatine, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+psychomotor+retardation+using+iPSCs+from+MCT8-deficient+patients+indicates+a+prominent+role+for+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling psychomotor retardation using iPSCs from MCT8-deficient patients indicates a prominent role for the blood-brain barrier.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 831-843 (2017).</li>
<li>Svendsen, C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+the+rapid+and+long+term+growth+of+human+neural+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A new method for the rapid and long term growth of human neural precursor cells.</a> Journal of Neuroscience Methods. 85 (2), 141-152 (1998).</li>
<li>Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retinoic+acid-enhanced%2C+multicellular+human+blood-brain+barrier+model+derived+from+stem+cell+sources%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources.</a> Scientific Reports. 4, 4160(2014).</li>
<li>Canfield, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isogenic+blood-brain+barrier+model+comprising+brain+endothelial+cells%2C+astrocytes%2C+and+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">An isogenic blood-brain barrier model comprising brain endothelial cells, astrocytes, and neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (6), 874-888 (2017).</li>
<li>Jamieson, J. J., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chipping+Away+at+Blood-Brain-Barrier+Modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Chipping Away at Blood-Brain-Barrier Modeling.</a> Cell stem cell. 24 (6), 831-832 (2019).</li>
<li>Faal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Mesoderm+and+Neural+Crest-Derived+Pericytes+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Study+Blood-Brain+Barrier+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Induction of Mesoderm and Neural Crest-Derived Pericytes from Human Pluripotent Stem Cells to Study Blood-Brain Barrier Interactions.</a> Stem Cell Reports. 12 (3), 451-460 (2019).</li>
<li>Lippmann, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+blood-brain+barrier+endothelial+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells.</a> Nature Biotechnology. 30 (8), 783(2012).</li>
<li>Qian, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+blood-brain+barrier+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to blood-brain barrier endothelial cells.</a> Science Advances. 3 (11), 1701679(2017).</li>
<li>Neal, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified%2C+Fully+Defined+Differentiation+Scheme+for+Producing+Blood-Brain+Barrier+Endothelial+Cells+from+Human+iPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Simplified, Fully Defined Differentiation Scheme for Producing Blood-Brain Barrier Endothelial Cells from Human iPSCs.</a> Stem Cell Reports. 12 (6), 1380-1388 (2019).</li>
<li>Wevers, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perfused+human+blood-brain+barrier+on-a-chip+for+high-throughput+assessment+of+barrier+function+and+antibody+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+and+Barriers+of+the+CNS%22%5BJournal%5D)">A perfused human blood-brain barrier on-a-chip for high-throughput assessment of barrier function and antibody transport.</a> Fluids and Barriers of the CNS. 15 (1), 23(2018).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+of+human+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135(2013).</li>
<li>Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
</ol>

Cedars-Sinai 持有 Emulate 公司的少数股份，该公司生产本研究中使用的微流控器官芯片。Cedars-Sinai 的一名高管同时在 Emulate 董事会任职。本研究未获得 Emulate 提供的任何资金支持。Cedars-Sinai 与 Emulate 均已就本研究相关技术提交了专利申请。

器官芯片技术与源自iPSC的细胞在神经血管单元（NVU）中的结合，为精确建模人血脑屏障（BBB）提供了广阔前景。本文提供了一套详细的实验方案，用于简便且稳健地应用近期发表的基于iPSC的血脑屏障芯片16。接种方案的总体流程与时间安排见图3。为了获得并维持适用于血脑屏障建模的屏障功能，生成均一的iBMEC单层细胞并保持其完整性至关重要。构建功能性单层细胞的第一步是化学活化非极性的PDMS表面，以促进细胞外基质（ECM）蛋白的附着。表面活化试剂在重悬后会迅速降解，可能导致细胞附着效果不理想。因此，在整个操作过程中保持试剂新鲜并避光保存十分关键。
在紫外光活化过程中（第5.2节），必须确保各通道内的试剂均匀分布，以实现一致的细胞外基质（ECM）包被和均匀的细胞贴附。本方案中提供的ECM成分和浓度已针对特定类型的细胞进行优化（即., iBMECs 和 EZ-sphere 分化而来的神经前体细胞）。改变细胞组成是可行的，但可能需要不同的细胞外基质（ECM）条件，这需要...

血脑屏障（BBB）是一种高度选择性的屏障，将中枢神经系统（CNS）与循环血液分隔开来。它可保护大脑的关键功能免受潜在干扰性物质、因子和外源性化合物的影响，同时允许营养物质及其他维持大脑稳态所必需的代谢物进入1。BBB 是一种多细胞构成的神经血管单元（NVU），其中周细胞、星形胶质细胞终足以及神经元突起直接与脑微血管内皮细胞（BMECs）接触。这些相互作用使 BMECs 形成特殊的屏障特性，并由紧密连接和黏附连接提供支持2,3。该屏障的形成限制了分子的细胞旁通路转运，但其含有极性分布的转运蛋白，可主动将分子转运进入中枢神经系统或返回血液中1。由于这些独特的屏障特性，BBB 构成了向脑内递送生物制药的主要障碍，据估计，仅有不到 5% 的经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的小分子药物能够到达中枢神经系统4。
动物模型已被广泛用于研究血脑屏障（BBB）的通透性以及参与BBB发育的分子机制5。尽管动物模型能够真实地再现复杂的多细胞体内环境，但不同物种间BBB转运蛋白的表达与活性差异以及底物特异性差异，常常导致无法将动物实验数据准确外推至人类6。因此，基于人类的模型对于研究人类血脑屏障以及用于靶向中枢神经系统（CNS）药物的开发至关重要。随着生物类、人类特异性药物在药物研发领域中所占比例不断增加，这一需求变得更加突出。越来越多的证据表明，受损的血脑屏障与多种严重的中枢神经系统疾病相关，包括脑肿瘤和神经性疾病7,8,9。能够真实反映这些疾病的基于人类的模型具有双重潜力：1）识别可用于药物开发的新靶向通路；2）预测药物在中枢神经系统的通透性，从而缩短临床前研究的时间和资源投入，并可能降低临床试验的失败率。
体外模型已被广泛用于研究脑微血管内皮细胞（BMECs）与神经血管单元（NVU）中其他细胞之间的相互作用，并用于筛选潜在的血脑屏障（BBB）通透性药物10。为了重建人血脑屏障的关键特征，体外模型必须表现出符合生理的相关特性（即低细胞旁路通透性和在内皮单层上具有生理相关性的跨内皮电阻[TEER]）。此外，体外系统的分子谱必须包含代表性功能转运系统的表达。通常，体外模型由内皮细胞组成，这些细胞在半透膜上与其他NVU细胞共培养，以增强血脑屏障特性11。该方法可对屏障功能和分子通透性进行简单且相对快速的评估。此类基于细胞的血脑屏障模型可使用动物或人类细胞来源建立，包括从手术切除组织中分离的细胞或永生化BMEC细胞系。
最近，已有研究建立了将人类多能干细胞分化为脑微血管内皮细胞（BMECs）的实验方案，这为体外构建人源血脑屏障（BBB）模型提供了极具吸引力的细胞来源12,13。由诱导性多能干细胞（iPSC）衍生的BMECs（iBMECs）具有高度可扩展性，能够展现人源血脑屏障关键的形态学和功能特征，并携带供体患者的遗传背景。在培养条件下，iBMECs可形成单层细胞，表达紧密连接标志物，并形成类似体内结构的紧密连接复合物。这些细胞还表达血脑屏障标志物，包括血脑屏障葡萄糖转运体——葡萄糖转运体1（GLUT1）。尤为重要的是，与其他可选的人源BMEC细胞来源不同，iBMECs所形成的屏障特性其数值可达到与体内测量值相当的高水平14，能够沿基底-外侧轴发生极化，并表达具有功能的外排转运蛋白。此外，使用来自不同个体的iPSCs不仅（1）为以个体化医学方式研究血脑屏障特性提供了可能，而且（2）为生成神经血管单元（NVU）中的其他细胞类型提供了灵活的细胞来源。若利用同基因型细胞来源制备个体化血脑屏障芯片，将有助于理解个体间药物反应的差异，而这种差异正是临床研究中观察到的治疗耐药性或疗效降低的主要原因。
将iBMECs以培养皿中的单层细胞或跨孔插入式半透膜上的单层细胞形式使用，是构建血脑屏障（BBB）模型的一种有力方法。这些系统通常具有较强的稳健性、可重复性且成本较低。此外，诸如经内皮电阻（TEER）和通透性等功能分析也相对容易实施。然而，二维（2D）系统无法重现体内组织的三维（3D）特性，并且缺乏循环血液及血细胞所提供的生理性剪切应力。这限制了这些模型中血管内皮细胞发育和维持其固有的血脑屏障特性和功能的能力。
已采用由活细胞构建的微加工系统，以模拟各种器官功能，这一概念被称为“器官芯片”。通过重建类似体内多细胞结构、组织-组织界面、理化微环境以及血管灌注，这些微加工平台实现了传统二维培养系统无法达到的组织和器官功能水平。它们还能够实现高分辨率、实时成像，并对生化、遗传和代谢谱进行分析，其结果与体内组织和器官环境中活细胞的特性相似。然而，器官芯片面临的一个特殊挑战是，这些微加工芯片的设计、制造和应用需要专业的工程专业知识，而这类知识通常在以生物学为导向的学术实验室中较为缺乏。
我们近期将诱导多能干细胞（iPSC）与器官芯片技术相结合，开发出一种个性化的血脑屏障（BBB）芯片模型15,16。为克服上述技术挑战，本研究采用 commercially available Chip-S1 芯片，并结合培养模块（culture module）使用，该仪器由 Emulate 公司设计，可简单且稳定地自动化维护芯片。该 BBB 芯片可重建神经细胞与内皮细胞之间的相互作用，并达到生理相关的跨内皮电阻（TEER）值，该值通过集成金电极的定制器官芯片进行测量17。此外，该 BBB 芯片表现出较低的旁细胞通透性，可在器官水平响应炎症信号，表达具有活性的外排泵，并展现出对可溶性生物标志物和生物药物的可预测性转运能力。值得注意的是，来自多个个体的 BBB 芯片能够捕捉健康个体与神经系统疾病患者之间预期的功能差异15。
以下方案详细描述了一种在动态流动条件下生成人源iPSC衍生的血脑屏障芯片的可靠、高效且可重复的方法。本文提供了可在血脑屏障芯片内直接进行或通过收集流出液开展的各类检测与终点分析的指导。因此，该方案展示了可用于评估人源相关模型中生物学特性及功能特性与响应的一系列技术。
本文简要描述了基于诱导多能干细胞（iPSC）的血脑屏障（BBB）芯片。人iPSC最初在组织培养瓶中作为游离的神经前体细胞团（称为EZ球）进行分化和扩增。将解离后的EZ球接种至Chip-S116,18,19的上层通道，这些细胞在7天内进一步分化为包含诱导型神经前体细胞（iNPCs）、诱导型星形胶质细胞（iAstrocytes）和诱导型神经元（iNeurons）的混合培养物，构成芯片的&#34;脑侧&#34;。同时，人iPSC也在组织培养板中分化为诱导型脑微血管内皮细胞（iBMECs）。将iBMECs接种至芯片的下层通道，随着其发育形成内皮管状结构，构成芯片的&#34;血侧&#34;（图1）。分隔上下通道的多孔细胞外基质（ECM）包被膜具有两个功能：1）允许通道间细胞形成细胞-细胞相互作用；2）使研究者能够使用常规光学显微镜对任一通道中的细胞进行通透性检测和成像分析。

<table><tbody><tr><td>Accutase</td><td>EMD Millipore</td><td>SCR005</td><td>解离溶液</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Chip-S1</td><td>Emulate Inc</td><td>Chip-S1</td><td>器官芯片</td></tr><tr><td>IV型胶原蛋白</td><td>Sigma</td><td>C5533</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>葡聚糖-FITC</td><td>Sigma</td><td>46944</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31330038</td><td></td></tr><tr><td>驴血清</td><td>Sigma</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>Emulate 试剂1 (ER-1)</td><td>Emulate Inc</td><td>ER-1</td><td></td></tr><tr><td>Emulate 试剂2 (ER-2)</td><td>Emulate Inc</td><td>ER-2</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)</td><td>Dako</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>GLUT-1</td><td>Invitrogen</td><td>MA5-11315</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Life Technologies</td><td>35050038</td><td>谷氨酰胺补充剂</td></tr><tr><td>人BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>KOSR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>层粘连蛋白</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>基底膜基质</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies, Inc.</td><td>85851</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸 (NEAA)</td><td>Biological industries</td><td>01-340-1B</td><td></td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB353</td><td></td></tr><tr><td>NutriStem</td><td>Biological industries</td><td>05-100-1A</td><td>替代培养基</td></tr><tr><td>PECAM-1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10333</td><td></td></tr><tr><td>血小板贫浆来源牛血清 (PPP)</td><td>Biomedical Technologies</td><td>J64483AB</td><td></td></tr><tr><td>视黄酸 (RA)</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>S100&amp;beta;</td><td>Abcam</td><td>ab6602</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP 无菌离心管顶滤器</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1 单克隆抗体</td><td>Invitrogen</td><td>33-9100</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;III-微管蛋白 (Tuj1&amp;alpha;)</td><td>Sigma</td><td>T8660</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-巯基乙醇</td><td>Life Technologies</td><td>31350010</td><td></td></tr></tbody></table>

人源ipsc衍生的血脑屏障芯片的制备

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

血脑屏障（BBB）由神经血管单元（NVUs）构成，可保护中枢神经系统（CNS）免受血液中多种可能干扰大脑精细功能的因素影响。因此，血脑屏障是向中枢神经系统递送治疗药物的主要障碍。越来越多的证据表明，血脑屏障在神经系统疾病的发生和发展中起着关键作用。因此，迫切需要一种能够预测靶向中枢神经系统药物穿透能力，并阐明血脑屏障在健康与疾病状态下作用的模型。
我们近期将器官芯片与诱导性多能干细胞（iPSC）技术相结合，开发出一种完全个性化的人源血脑屏障（BBB）芯片。这一新型平台展现出适用于预测药物和分子在人血脑屏障中转运能力的细胞、分子和生理特性。此外，通过使用患者特异性的血脑屏障芯片，我们建立了神经系统疾病模型，并展示了其在个性化预测医学应用中的潜力。本文提供了一套详细的实验方案，介绍如何从诱导性多能干细胞衍生出的脑微血管内皮细胞（iBMECs）分化开始，构建iPSC来源的血脑屏障芯片，最终形成包含神经前体细胞、分化神经元和星形胶质细胞的混合神经培养体系。同时描述了将细胞接种至器官芯片并在受控层流条件下培养血脑屏障芯片的操作流程。最后，提供了对血脑屏障芯片进行分析的详细方法，包括用于评估药物和分子通透性的旁细胞渗透性检测，以及通过免疫细胞化学方法鉴定芯片内细胞类型的组成。

图6A,B,C 显示了一种血脑屏障（BBB）芯片，其“脑侧”顶部通道接种了EZ-球体，“血侧”底部通道接种了诱导型脑微血管内皮细胞（iBMECs）。首先接种iBMECs并静置过夜使其贴壁，随后接种EZ-球体。芯片在静态条件下培养，每天更换培养基，持续七天。然后使用4%多聚甲醛在室温下固定BBB芯片10分钟，并用DPBS洗涤3次。对BBB芯片进行免疫细胞化学染色，使用1）巢蛋白（nestin）作为神经前体细胞的标志物，2）S100β或胶质纤维酸性蛋白（GFAP）作为星形胶质细胞的标志物，以及3）βIII-微管蛋白（βIII-tubulin）作为神经元的标志物。GLUT-1和Pecam-1用作脑微血管内皮细胞（BMECs）的标志物。使用共聚焦显微镜在20倍放大下进行成像，并使用Fiji for ImageJ软件处理图像。
图6D 展示了一项在含有iBMECs和EZ-球体、仅含iBMECs（不含EZ-球...

血脑屏障（BBB）是一种多细胞构成的神经血管功能单元，可严格调控大脑内环境的稳态。通过结合人诱导多能干细胞（iPSCs）与器官芯片技术，我们构建了一种可用于疾病建模及中枢神经系统药物穿透能力预测的个体化血脑屏障芯片。本文详细描述了该血脑屏障芯片的制备与操作流程。

人源iPSC衍生的血脑屏障芯片的制备

血脑屏障（BBB）由神经血管单元（NVUs）构成，可保护中枢神经系统（CNS）免受血液中多种因子的影响……

本方案将演示如何将已分化的诱导多能干细胞接种于器官芯片上，以构建完全人源化、个体化的微流控血脑屏障，可用于预测中枢神经系统药物的通透性，并研究神经性疾病。利用一种 commercially available 的器官芯片，我们将展示任何以生物学为导向的实验室均可使用该技术构建个体化的微流控血脑屏障芯片。不断积累的证据表明，通过使用源自患有遗传性神经疾病个体的iPSCs生成个体化血脑屏障芯片，可揭示血脑屏障在神经疾病中的作用。将有可能研究血脑屏障在健康和疾病中的作用。该方法对制药公司也具有应用价值，这些公司可利用这种人源血脑屏障平台筛选候选神经药物进入人脑的渗透能力。器官芯片技术的应用通常需要专业的工程技能。使用市售平台可使该技术应用于任何以生物学为导向的实验室。首先，将装有制备好的芯片的培养皿移至生物安全柜中。使用P200移液器，向入口加入200微升神经分化培养基，并从出口缓慢吸取液体，轻柔地冲洗两个通道。避免接触端口，小心地从芯片表面吸除多余的培养基液滴。轻轻振荡细胞悬液，以确保细胞悬液均匀。为了将诱导多能干细胞来源的神经前体细胞接种至顶部通道以形成脑侧，取一支含有30至100微升细胞悬液的P200吸头，细胞浓度为每毫升1×10⁶个细胞，将其插入顶部通道入口，然后轻轻从移液器上释放吸头。取一个空的P200移液枪，按下按钮，插入上层通道出口，小心地将单细胞悬液吸入枪头中。将芯片转移至显微镜下，检查上层通道内细胞的接种密度及分布均匀性。确认细胞密度达到20%覆盖率后，立即将芯片放入37摄氏度培养箱中孵育两小时。随后，向入口加入新鲜的神经分化培养基，并用移液器从出口抽吸液体，以洗去未贴壁的细胞。将细胞在37摄氏度下静态培养，并每天更换神经分化培养基。待iNPCs贴壁后，或接种后的次日，将含有制备芯片的培养皿移至生物安全柜中。用 200 微升内皮细胞培养基轻轻冲洗底部通道。避免接触端口，小心吸除芯片表面多余的内皮细胞培养基液滴，确保两个通道中均保留培养基。轻轻振荡细胞悬液，以确保细胞悬液均匀。使用 P200 移液器吸取 30 至 100 微升浓度为 14 至 20 × 10⁶ 个细胞/毫升的诱导多能干细胞来源的脑微血管内皮细胞悬液，将枪头插入器官芯片的底部通道入口。获得功能性屏障特性的最关键步骤是脑微血管内皮细胞的接种。必须以适当的密度接种细胞，以避免气泡形成，并确保细胞在器官芯片内均匀分布。用带有空吸头的P200移液器按下推杆，插入底部通道出口，然后缓慢释放移液器推杆，将单细胞悬液小心地从底部通道中抽出。吸取芯片表面多余的细胞悬液。避免直接接触进样口和出样口，以确保通道内的细胞悬液不会被吸出。将芯片转移至显微镜下检查接种密度。底部通道已充满细胞，细胞之间无可见间隙。确认细胞密度正确后，在其余芯片中接种细胞。为了将细胞贴附到位于底部通道上方的多孔膜上，将每个芯片倒置并放置在芯片支架中。在150毫米培养皿内放入一个盛有无菌DPBS的小型储液器，以为细胞提供湿度环境。将芯片置于37摄氏度孵育约三小时，或直至底部通道内的细胞完成贴附。待iPSC来源的脑微血管内皮细胞贴壁后，将芯片翻转回直立位置，以使细胞能够附着到底通道的底部区域。iPSC来源的脑微血管内皮细胞接种后48小时，将内皮细胞培养基置于37摄氏度水浴中预热1小时，以平衡温度。随后，在真空驱动的过滤系统中孵育15分钟，对培养基进行脱气处理。接下来，用70%乙醇对便携式模块包装盒和托盘的外表面进行消毒，擦拭后转移至生物安全柜中。打开包装，将模块放入托盘内，方向为储液槽朝向托盘后方。向每个入口储液槽中加入3 mL预平衡的温热培养基。向底部通道的入口储液池中加入内皮细胞培养基，并向顶部通道的入口储液池中加入神经分化培养基。然后，用移液器将300 µL预平衡并预热的培养基直接加入每个出口端口上方的出口储液池中。每个培养盘上最多可放置六个便携式模块。将托盘放入培养箱中，并将托盘完全滑入培养模块内，托盘把手朝外。在培养模块上选择并运行预灌注循环。关闭培养箱门，使培养模块对便携式模块进行约一分钟的预灌注。当状态栏显示“就绪”时，启动循环完成。从培养模块中取出托盘，并将其移至生物安全柜中。在生物安全柜内检查每个便携式模块的底部，以确认便携式模块已成功启动。检查所有四个端口处是否存在小液滴。如果任何便携式模块未出现液滴，请对该模块重新运行引液循环。如果培养基滴落到托盘上（更常见于出口端口附近），请使用70%乙醇清洁托盘。接下来，用温热且已平衡的细胞专用培养基轻轻冲洗每个芯片的两个通道，以去除通道中可能存在的气泡，并在每个进样口和出样口的顶部放置少量培养基液滴。将带有载体的芯片插入便携式模块中，每块托盘最多可放置六个。将托盘插入培养模块。在培养模块上设置适当的器官芯片培养条件，例如流速和拉伸。调节循环完成后（约需两小时），设定的培养条件即开始生效。随后，培养模块将在预设的器官芯片培养条件下开始运行流体。在接种后第七天，基于iPSC的血脑屏障芯片上进行的免疫细胞化学检测显示，EZ球体在上层脑侧通道中分化为混合神经细胞群体，其中包括S100 beta阳性星形胶质细胞、Nestin阳性神经前体细胞、GFAP阳性星形胶质细胞以及β III微管蛋白阳性神经元。接种于下层血液侧通道的iPSC来源脑微血管内皮细胞表达GLUT-1和PECAM-1。血脑屏障芯片通透性评估结果表明，与仅接种iPSC来源脑微血管内皮细胞的器官芯片相比，同时接种iPSC来源脑微血管内皮细胞和EZ球体的器官芯片形成了更紧密的屏障。仅接种EZ球体的器官芯片未表现出任何屏障特性。从通道的初始表面处理到每天更换培养基，均需避免通道内产生气泡。在整个实验步骤中，当需要通过通道加入表面活化试剂、细胞外基质或含细胞的培养基时，必须仔细确认无气泡存在。可以通过通透性检测来评估候选药物穿透人脑的能力。该方法可用于测试潜在的治疗药物。基于诱导多能干细胞的血脑屏障芯片的应用，有助于研究血脑屏障在多种神经系统疾病中的作用。未来，此类平台可能在预测性、个性化医疗应用中发挥重要作用。

generation-of-a-human-ipsc-based-blood-brain-barrier-chip

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

生成基于人类 iPSC 的血脑屏障芯片

本方法描述了如何从小鼠脑组织中分离并永生化微血管内皮细胞。我们介绍了一套从脑组织匀浆、消化处理、细胞接种到细胞永生化的逐步实验方案。通常需要约五周时间获得均一的、可永生化的微血管内皮细胞系。...

建立永生化的小鼠脑微血管内皮细胞系作为 体外 血脑屏障模型

本文展示了一种简单且高效的方案，使用单一慢病毒重编程载体，从3-4...

使用STEMCCA慢病毒载体从外周血生成人类诱导多能干细胞

本视频展示了利用iPSC来源的前体细胞构建血脑屏障芯片的方法。该方法包括将神经前体细胞和脑微血管内皮细胞分别接种在具有多孔膜的独立通道中。通过灌注分化培养基，内皮细胞形成类似血管的紧密连接，神经细胞则分化成熟为多种脑细胞类型，从而在芯片上建立功能性的血脑屏障。...

利用iPSC来源的前体细胞生成血脑屏障芯片

本文介绍了一种利用附加体型重编程策略及组蛋白去乙酰化酶抑制剂，从外周血中生成人诱导性多能干细胞的实验方案。...

利用附加体和HDAC抑制剂从血液中高效生成iPS细胞

本方案描述了一种从成人外周血细胞高效生成无整合iPSC的详细方法。通过使用四种基于oriP/EBNA的附加体质粒表达重编程因子KLF4、MYC、BCL-XL以及OCT4和SOX2，可从1...

使用附加体质粒载体从人外周血单个核细胞生成无整合诱导多能干细胞

我们提出一种无需基因改造（非转基因）的方法，通过重编程外周血细胞获得具有神经元表型的细胞。激活与一种新型人源GPI锚定蛋白相关的信号通路，揭示了一种高效、非转基因获取人多能干细胞的方法。...

无转基因方法生成血液来源神经元细胞

本文介绍了一种构建个性化器官芯片系统的方案，该系统通过整合由人诱导多能干细胞分化而来的基因匹配的上皮细胞和血管内皮细胞，模拟肾脏肾小球滤过屏障的结构与功能。这种生物工程系统可推动肾脏精准医学及相关应用的发展。...

由人诱导多能干细胞构建的等基因肾小球芯片

使用微尺度屏障组织平台（MicroSiM, µSiM）构建血脑屏障模型

血脑屏障（BBB）在维持稳定且健康的脑环境方面起着至关重要的作用。BBB功能障碍与多种神经系统疾病相关。我们开发了一种源自干细胞的三维血脑屏障模型，用于研究脑血管病理、血脑屏障完整性，以及遗传因素和疾病如何改变血脑屏障。...

血脑屏障的重建 体外 用于建模及治疗性靶向神经系统疾病

本研究阐述了一种建立人单核细胞来源的小胶质细胞样（iMG）细胞的新方法，可用于间接评估脑部炎症。该细胞模型可能有助于针对脑部潜在炎症及相关神经精神疾病的研究。...

用于逆向转化脑科学研究的人源血液诱导小胶质样细胞的构建

我们提出了一种通过将诱导性多能干细胞（iPSC）来源的造血祖细胞（HPCs）整合到类器官发育过程中，以生成含常驻小胶质细胞的人脑类器官的实验方案。...

衍生含小胶质细胞发育的人脑类器官

了解如何利用诱导多能干细胞在器官芯片上构建个性化血脑屏障模型，用于预测中枢神经系统药物渗透性并研究神经系统疾病机制。该技术为药物筛选和神经科学研究提供重要平台。

人源iPSC衍生的血脑屏障芯片的制备

探索更多视频