使用定性和定量组织方法对小鼠胚胎先天性心脏缺陷的分析

在此协议中，我们描述了定性和定量分析与先天性心脏缺陷相关的小鼠发育表型的程序。

该协议标准化了新的组织分析技术，以便可以更广泛地被研究先天性心脏缺陷的其他组使用。由于定性和定量分析技术各有优缺点，这种方法同时使用两者来解决最广泛的实验问题。这些技术对心脏病诊断方法有积极影响。

例如，病理学家可以应用我们的显微心脏组织分析技术，从活检样本中诊断人类心脏病。该协议可用于发展心脏病学或一般心脏病学研究。然而，这些方法也提供了各种有用的技术，可以应用于任何组织分析。

为了收集胚胎第15至15.5天的心脏，固定怀孕的大坝的四肢，并围绕尿道开始到胸骨，小心地沿着躯干做一个我形切口。在铲取运动中使用钳子，轻轻地将子宫从腹腔中抬出，必要时用细钳抓住子宫的肤浅组织，以帮助提取。用剪刀从腹部释放子宫。

将子宫浸泡在冰冷的PBS中后，将器官固定到解剖盘中。用剪刀将子宫切成单独的部分，每个部分包含一个单独的胚胎。使用两对细钳子，轻轻地将胚胎从子宫组织中剥离出来，并将它们放在含有四摄氏度PBS-EDTA的新培养皿中。

为了收集心脏，将盘子放在解剖显微镜下，并使用两对细钳将胚胎置于子宫内位置。稳定进入胸部后，使用第二对细钳的尖点，沿着胚胎的胸骨切口，在锁骨到肚脐之间延伸。使非常精细和肤浅的切口，同时逐渐工作到胸腔内侧，打开胚胎的腹部。

当心脏变得可见时，用一对钳子将躯干稍微挤到肋骨笼上，将肋骨剥开。使用一对钳子的两侧，轻轻抓住肺血管，而不分离组织，将心脏从腔中拉出。在新鲜PBS-EDTA中清洁心脏一至两分钟，然后将组织固定在4%的甲醛中45至60分钟。

然后，在PBS中每次洗5至10分钟，并辅以甘氨酸，洗心脏三次。在将心脏储存在PBS中摄氏4度之前。为了准备心脏的冷冻，将样品放入30%蔗糖和PBS的管中，在4摄氏度下24至40小时。

当心脏沉入管底时，使用具有修改尖端的巴斯德移液器小心地将每颗心转移到一块无绒擦拭上。短暂空气干燥后，将每个样品放入单独的最佳切割温度模具中，以所需的方向进行切割。将组织淹没在最佳切割温度介质中，无气泡。

然后，将霉菌在20摄氏度下储存几天，然后在80摄氏度下冷冻组织至少24小时，然后进行冷冻。要获取样品的低温分段，请使用新鲜的最佳温度切割介质将感兴趣的组织块连接到低温恒温器的夹头上，并允许该介质冻结，直到其不透明为白色。插入新刀片并调整组织块与刀片之间的距离，以便获得截面。

在 10 微米切片中修剪块，直到到达感兴趣点。当可以观察到组织时，使用小型平面画笔以连续切割运动轻轻地将切片拉到支架上。一旦组织被完全切开，使用细节刷拍下来的切片平对台。

在取下详细笔刷并完成切片之前，将截面保持到位约 20 到 30 秒。使用两个画笔轻轻地将切片压平，防止任何滚动，并按住组织部分对舞台。20 到 30 秒后，翻转该部分并再次将其压平到舞台上，然后放置一个静电滑动，使切片足够接近，以吸引切片并粘附到幻灯片上，而无需将幻灯片触摸到舞台上。

要评估心脏组织部分是否存在常见心脏缺陷，使用配备相机的显微镜，以 5 到 10 倍和 40 倍的放大倍率获得图像。对于心肌压实分析，在适当的图像分析软件程序中打开感兴趣的组织，将图像设置为 8 位。要设置图像的阈值，请单击"图像、调整"和"阈值"，然后移动顶部栏以调整阈值，直到仅选择背景像素。

接下来，使用多边形选择工具在组织周围绘制感兴趣的区域，然后单击"分析、设置测量、面积和限制阈值"。单击"分析"和"测量"可测量高亮显示像素的面积，以获取负空间区域的值。要测量整个感兴趣区域的区域，请单击"分析"、设置度量和取消选择阈值限制。

然后，选择"分析和测量"以测量所选感兴趣区域的整个区域。要计算肌肉组织的面积，请从感兴趣区域的负空间区域中减去"负空间"。然后将肌肉组织区域除以"感兴趣区域"来计算肌肉压实和X.从收获的胚胎心脏中染色组织切片，提供足够的对比度来分出组织边缘，但并没有使细胞特征难以区分。

在这个具有代表性的分析中，观察到肌肉压实在实验心脏中相对于在非实验条件下发育的胚胎显著降低。这些样品很有价值，需要很长时间才能创建。在尸检和低温统计剖切期间，请务必有意执行每一个动作。

保存准甲醛中的组织可保持抗原活性，允许样品用于亚米诺氟素染色等测试，帮助确定形态评估期间发现的病理原因。在我们的实验室中，我们获得了实验治疗的定量表示，可以帮助我们确定不同治疗如何影响我们的样品。甲状醛可以修复它接触的任何组织。

注意始终戴上手套，尽量减少暴露的皮肤，并在使用这种化学品时在薄膜罩中工作。