Name: 使用定性和定量组织方法对小鼠胚胎先天性心脏缺陷的分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 学习定性和定量组织分析方法，用于小鼠胚胎先天性心脏缺陷研究。该技术结合显微镜检查与组织切片，可提升心脏病诊断水平并促进发育生物学研究。

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Aguirre 实验室由美国国立卫生研究院下属的国家心肺血液研究所资助，资助编号为 K01HL135464，同时由美国心脏协会资助，资助编号为 19IPLOI34660342。

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</ol>

作者无任何披露事项需要报告。

本方案探讨了胚胎心脏中心脏发育分析所涉及的技术。该方法的一些局限性包括预备技术所需的动手灵巧性，这可能需要练习，以及显微镜成像操作的熟练程度。如果在冷冻切片机上获得的切片杂乱不清，则苏木精-伊红染色将不清晰；或者如果显微镜拍摄的图像照明不良，则ImageJ软件所用的方法将无法奏效。ImageJ软件阈值功能的一个局限性在于，它会根据像素值选择位于阈值一端的像素。因此，任何位于阈值错误一侧的像素都可能在计算中被错误地包含或排除。最终，在将本方案应用于研究时，必须进行必要的故障排查。
如果心脏提取过于困难，可考虑跳过至步骤 2.8。此外，可考虑从胸腔中取出除心脏和肺脏以外的更多组织。这样目标区域更大，更易于操作，同时可最大限度减少心脏与精细镊子之间的直接接触。在进行冷冻切片时，实验样本应始终与对照样本直接比较。只要操作误差在所有样本中保持一致，这种比较方式可在一定程度上容忍操作偏差。为尽量减少人为误差并避免假阳性结果，务必确保从各处理组中获取可比的切片。例如，若有多人参与切片制备，应确保每位操作者为对照组和所有处理组制备数量相等的切片，而非仅针对某一亚组。最后，在 ImageJ 中进行图...

先天性心脏病（CHD）是人类最常见的出生缺陷类型，也是出生缺陷相关死亡的首要原因1,2,3,4,5,6。尽管约90%的CHD新生儿能够存活，但该病常伴随显著的发病率和长期的医疗干预，给患者生活及医疗系统带来沉重负担7,8,9,10。除单纯的遗传因素外，CHD的病因尚不明确4。根据美国心脏协会及其他来源的数据，约56%-66%的CHD病例病因尚未明确2,3,4,11。已知的致病因素包括基因突变、拷贝数变异（CNVs）、新生单核苷酸变异以及非整倍体。流行病学研究提示，环境和饮食因素也可能在CHD的发生中起重要作用，例如母体生活方式2,12、经济贫困和种族差异13；此外，关于饮食因素的研究也表明叶酸11,14和生物活性脂质视黄酸15,16可能具有影响。深入研究CHD及其他心血管缺陷的机制与病因，对于开发预防策略和新型治疗方案具有重要意义1,4,17,18,19。
发育中的小鼠是研究哺乳动物先天性心脏病（CHD）的核心模型。然而，对于初次分析小鼠心脏的研究人员而言，某些常用方法和分析手段可能具有挑战性，例如保留心脏形态的解剖技术、发育阶段的分析以及与CHD相关缺陷的识别。本实验方案旨在为这些操作提供定性和定量的指导。因此，本方案详细说明了如何进行定时交配以获得特定妊娠阶段的胚胎，对怀孕雌鼠进行解剖以完整回收心脏（包括流出道等关联组织），心脏的固定及冷冻切片前处理，基本的组织学方法，常见心脏缺陷的定量分析，以及心肌致密化程度的定性分析——后者是多种类型先天性心脏病常见的前驱表型。

<table><tbody><tr><td>15 mL 圆锥形离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td># 1495970C</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J 小鼠</td><td>Jackson Labs</td><td>C57BL/6J - stock 000664</td><td></td></tr><tr><td>柯普林染色缸（x6）</td><td>VWR Scientific</td><td># 25457-006</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 24×50 mm #1.5</td><td>VWR Scientific</td><td># 48393-241</td><td></td></tr><tr><td>冷冻切片机 - Leica CM3050S</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>解剖皿</td><td>Fisher Scientific</td><td># 50930381</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 精细镊子（x2）</td><td>Fine Science Tools</td><td># 11254-20</td><td></td></tr><tr><td>伊红 Y 溶液</td><td>Millipore Sigma</td><td># HT110116-500ML</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（纯度，200 proof）</td><td>Fisher Scientific</td><td># BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Millipore Sigma</td><td># E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt 封片剂</td><td>Millipore Sigma</td><td># 03989-100ML</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td># 14060-10</td><td></td></tr><tr><td>荧光体视显微镜 Leica M165 FC</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Millipore Sigma</td><td># 410225-250G</td><td></td></tr><tr><td>Graefe 镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td># 11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism 8 软件</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes 擦镜纸</td><td>Fisher Scientific</td><td># 06666A</td><td></td></tr><tr><td>梅耶苏木精染液</td><td>Millipore Sigma</td><td># MHS16-500ML</td><td></td></tr><tr><td>微量移液器吸头 - p200</td><td>Fisher Scientific</td><td># 02707448</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel 软件</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCT 包埋剂</td><td>VWR Scientific</td><td># 102094-106</td><td></td></tr><tr><td>Olympus CkX53 显微镜</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>画笔（至少 2 支）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>VWR Scientific</td><td># 0215014601</td><td>配制成 4% 溶液（溶于 PBS）</td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Fisher Scientific</td><td># 13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 15140122</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td># 70011044</td><td>使用前从 10x 稀释至 1x</td></tr><tr><td>天平</td><td>Mettler Toledo</td><td># MS1602TS</td><td></td></tr><tr><td>天平</td><td>Mettler Toledo</td><td># MS105</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄 #3</td><td>VWR Scientific</td><td># 10161-918</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>VWR Scientific</td><td># 21909-612</td><td></td></tr><tr><td>方形模具</td><td>VWR Scientific</td><td># 100500-224</td><td>用于 OCT 包埋模具</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Millipore Sigma</td><td># S9378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td># 1255015</td><td></td></tr><tr><td>外科剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td># 14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Accu-Edge 一次性切片刀片</td><td>VWR Scientific</td><td># 25608-964</td><td></td></tr><tr><td>便携式天平</td><td>Acculab</td><td>VIC 5101</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>Millipore Sigma</td><td>214736-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

利用定性和定量组织学方法分析小鼠胚胎中的先天性心脏缺陷

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

先天性心脏病（CHD）是人类最常见的出生缺陷类型，影响高达1%的活产婴儿。然而，目前对CHD的根本病因仍了解甚少。发育中的小鼠是研究CHD的宝贵模型，因为小鼠与人类在心脏发育程序上具有高度保守性。本实验方案详细描述了如何获得特定妊娠阶段的小鼠胚胎，心脏组织的分离与保存方法以用于后续处理，通过组织学手段定量鉴定常见CHD类型（如室间隔缺损、房间隔缺损、动脉导管未闭）的方法，以及用于测量常见心肌致密化表型的定量组织形态学分析方法。这些方法系统阐述了样本制备、采集和分析的全部步骤，使科研人员能够准确且可重复地测量CHD。

比较了在两种不同环境下发育的心脏的肌肉致密化指数，即对照组与实验组。这些方案用于对肌肉组织的致密化程度进行定量分析，从而允许开展统计学分析。结果显示，与在非实验条件下发育的胚胎相比，实验组心脏的肌肉致密化程度显著降低。
若观察时间似乎不准确，则丢弃相应胚胎。尽管胚胎生长迟缓可能是实验处理所致，且胚胎发育进程存在个体差异，但通过合理安排交配时间，足以确保胚胎发育时序的准确性。胚胎分期采用Theiler分期法21。若切片不一致，或存在明显撕裂或折叠，则视为切片质量不佳。染色应提供足够的对比度以分辨组织边缘，但不应过深而致使细胞结构无法分辨。随后使用倒置显微镜和40倍物镜对切片进行成像。MCI值使用ImageJ软件和Microsoft Excel计算，并通过T检验对这些MCI值进行统计分析。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1"...

在本实验方案中，我们描述了对与先天性心脏缺陷相关的小鼠发育表型进行定性和定量分析的步骤。

先天性心脏病（CHD）是人类最常见的出生缺陷类型，影响高达所有活产婴儿的1%。然而，其根本病因……

本方案标准化了新的组织分析技术，以便其他研究先天性心脏缺陷的团队能够更广泛地应用。由于定性与定量分析技术各有优缺点，本方法结合两者，以应对最广泛的实验问题。这些技术可对心脏病学诊断方法产生积极影响。例如，病理学家可将我们的显微心脏组织分析技术应用于心内膜心肌活检样本中人类心脏病的诊断。该方案可用于发育心脏病学或普通心脏病学研究。然而，这些方法还提供了多种实用技术，可广泛应用于各类组织分析。为了获取胚胎第15至15.5天的心脏，固定怀孕母鼠的四肢，并从尿道区域开始沿躯干向上至胸骨，小心地做“I”形切口。使用镊子以舀取动作轻轻将子宫从腹腔中提起，必要时用精细镊子夹住子宫表面组织以协助取出。使用剪刀将子宫从腹部分离。将子宫浸泡在冰冻的 PBS 中后，将其固定在解剖皿中。使用剪刀将子宫切成多个独立片段，每个片段包含一个单独的胚胎。使用两把精细镊子，轻轻将胚胎从子宫组织中剥离，并放入含有 4°C PBS-EDTA 的新培养皿中。为获取心脏，将培养皿置于解剖显微镜下，使用两把精细镊子将胚胎置于仰卧位。固定并暴露胸腔后，用第二把精细镊子的尖端沿胚胎胸骨从锁骨之间向脐部做切口。在逐渐向胸腔内部操作时，进行非常精细且表浅的切开，打开胚胎的腹腔。当心脏刚刚可见时，用一对镊子轻轻挤压紧贴肋骨的躯干，使肋骨张开。用其中一把镊子的侧面轻轻夹住肺部血管，不要分离组织，将心脏从体腔中拉出。将心脏在新鲜的PBS-EDTA中清洗1至2分钟，然后在4%多聚甲醛中固定45至60分钟。然后，用添加了甘氨酸的 PBS 溶液洗涤心脏，每次洗涤 5 至 10 分钟，共洗涤三次。在将心脏置于 4°C 的 PBS 中保存之前，为准备进行冷冻切片，将样品放入含有 30% 蔗糖和 PBS 的离心管中，于 4°C 下孵育 24 至 40 小时。当心脏沉至管底后，使用带有改良尖端的巴斯德移液管，小心地将每颗心脏转移至无绒擦拭纸上。短暂空气干燥后，将每个样本按所需的切片方向放入独立的OCT包埋模中。将组织浸入OCT包埋剂中，确保无气泡。然后，将模具在 20 摄氏度下储存数天，随后将组织在 -80 摄氏度下冷冻至少 24 小时，再进行冰冻切片。为获得样品的冰冻切片，使用新鲜的最适切削温度介质将目标组织块固定于冰冻切片机的持样器上，并等待介质冻结至呈现不透明的白色。安装新刀片，并调节组织块与刀片之间的距离，以便获取切片。将组织块切成10微米厚的切片，直至到达目标区域。当观察到组织时，使用小的平头画笔轻轻将切片拉向支撑架，保持连续切割动作。一旦组织被完全切开，使用细节画笔将切片轻拍平整，紧贴于载片台上。在移除精细毛刷并完成切片前，将切片固定在原位约20至30秒。使用两把毛刷轻轻将切片压平贴附于载物台上，防止卷曲，并将组织切片紧贴载物台固定。20至30秒后，翻转切片，再次将其压平贴附于载物台上，然后将带静电的载玻片移至足够近的位置，使切片被吸引并黏附到载玻片上，而无需将载玻片接触载物台。为了评估心脏组织切片中是否存在常见的心脏缺陷，使用配备相机的显微镜，以5至10倍和40倍的放大倍数获取图像。进行心肌致密化分析时，在合适的图像分析软件程序中打开感兴趣的组织图像，并将图像设置为8位。为设定图像的阈值，点击“Image”（图像）、“Adjust”（调整）和“Threshold”（阈值），移动顶部滑块调整阈值，直至仅选中背景像素。接下来，使用多边形选择工具在组织周围绘制一个感兴趣区域，然后点击“分析”、“设置测量值”、“面积”和“限定于阈值”。点击“分析”和“测量”，以测量高亮像素的面积，从而获得负空间面积的数值。要测量整个感兴趣区域的面积，请点击“分析”、“设置测量值”，并取消选择“限定于阈值”。然后，选择“分析”和“测量”，以测量所选感兴趣区域的整个面积。要计算肌肉组织面积，需从感兴趣区域面积中减去空白区域面积。然后将肌肉组织面积除以感兴趣区域面积，以计算肌肉致密度和X。对收获的胚胎心脏组织切片进行染色，可提供足够的对比度以清晰分辨组织边缘，但又不会过深而使细胞结构无法分辨。在此代表性分析中，与在非实验条件下发育的胚胎相比，实验组心脏的肌肉压实程度明显降低。这些样品十分珍贵，且需要长时间制备。在尸检和冷冻切片过程中，务必确保每一个操作都准确无误。用多聚甲醛保存组织可维持抗原活性，使样本可用于诸如氨基荧光素染色等检测，从而有助于在形态学评估过程中识别病理原因。在我们的实验室中，我们获得了实验处理的定量表征，这有助于我们确定不同处理对样本的影响程度。多聚甲醛能够固定其接触到的任何组织。操作该化学品时，务必始终佩戴手套以尽量减少皮肤暴露，并在通风橱中进行操作。

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

使用定性和定量组织方法对小鼠胚胎先天性心脏缺陷的分析

在研究影响心脏发育的遗传改变时，胎儿及围产期死亡是常见的现象。高频超声成像提高了二维分辨率，能够提供早期心脏发育的优良信息，是检测死亡发生前心脏结构与功能受影响情况的理想方法。...

小鼠胎儿超声心动图

超高频超声是一种强大的活体成像工具，可用于检测小型动物的心脏异常。其非侵入性特点有助于维持胚胎的生理状态。本文展示了利用M型超声在E18.5阶段测量胚胎心率的方法。 在子宫内.

in utero 通过无创M型超声心动图测量小鼠心率

导致先天性心脏缺陷的突变需要在发育过程中对心脏结构进行体内研究，但在小鼠胚胎心脏中开展高分辨率的结构研究在技术上具有挑战性。本文介绍了一种可靠的免疫荧光与图像分析方法，用于评估发育中小鼠心脏中心肌细胞特异性结构。...

小鼠胚胎心脏中心肌细胞发育的免疫荧光分析

超声心动图检查在小鼠中经常使用。为此已开发出昂贵的高分辨率超声设备。本方案描述了一种经济实惠的超声心动图操作流程，并结合组织学形态计量分析，以确定心脏形态。...

小鼠心脏形态的超声心动图与组织学检查

本文介绍了一种对小鼠早期胚胎进行整体免疫荧光染色及基于图像的定量体积分析的实验方案。我们提出，该技术可作为一种强大手段，用于在发育过程中对心脏结构进行定性与定量评估，并认为该方法可广泛适用于其他器官系统。...

小鼠胚胎心脏前体细胞群体的定量整体免疫荧光分析

高频超声成像技术显著提高了胎鼠心脏的成像分辨率，可实现对心脏发育过程及结构缺陷的精确、无创性表征。本文所述方案旨在进行实时胎鼠超声心动图检测 体内.

利用高频超声（30/45 MHz）系统对胎鼠心血管成像

我们介绍了利用从心室特异性MLC-2v-tdTomato报告基因敲入小鼠中分离出的胚胎，通过整体封片表层荧光显微镜观察小鼠心脏发育的实验方案。该方法使我们能够直接可视化小鼠心脏发育过程中心室形成的各个阶段，而无需繁琐的组织化学方法。...

利用整体胚胎落射荧光技术分析小鼠胚胎发生过程中的心脏腔室发育

本文详细介绍了利用胎儿超声心动图、尸检以及基于共聚焦表层显微镜（ECM）的表层荧光成像（EFIC）结合三维（3D）重建技术，对小鼠先天性心脏病（CHD）进行诊断的方法。...

一种用于表征胎鼠心脏结构缺陷的分析流程

利用鸡胚GFP神经管移植与碳菁染料DiI注射对鸡胚中的神经嵴细胞与血管进行双重标记

本文介绍了一种将超声微泡造影剂注射到活体离体晚期妊娠阶段小鼠胚胎中的实验方案。该方法可利用增强型高频超声成像技术，研究胚胎内的灌注参数及血管分子标志物。...

利用高频超声对小鼠胚胎进行对比成像

学习定性和定量组织分析方法，用于小鼠胚胎先天性心脏缺陷研究。该技术结合显微镜检查与组织切片，可提升心脏病诊断水平并促进发育生物学研究。

利用定性和定量组织学方法分析小鼠胚胎中的先天性心脏缺陷

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