Name: 细胞细胞成像的微管细胞和微机械操作的 阿拉比多普西斯拍摄 阿皮克·梅里斯特姆 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: 了解拟南芥茎尖分生组织中皮质微管细胞骨架的活细胞成像方法。该技术用于研究机械力对植物细胞结构的影响，并可定量分析不同基因型的力学响应差异。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. 植物生长
<ol>
	<li>将表达微管结合域与绿色荧光蛋白融合蛋白（MBD-GFP）10 的拟南芥（Arabidopsis）种子播种于土壤中，在长日照（16 小时光照 / 8 小时黑暗）、20 °C/6 °C 条件下培养 1 周以完成萌发。</li>
	<li>萌发后，将幼苗转移至具有充足生长空间的新花盆中，以促进旺盛的营养生长。将植株置于短日照（8 小时光照 / 16 小时黑暗）、20 °C/16 °C 条件下培养 3–5 周。</li>
	<li>将植株转移至长日照（16 小时光照 / 8 小时黑暗）、20 °C/16 °C 条件下培养，直至植株抽薹（2–3 周）。让花序生长至 2–5 cm 长。</li>
</ol>
2. 培养基制备
<ol>
	<li>用2%琼脂糖填充小型培养皿（直径约5.5 cm，深度约1.5 cm）至其深度的一半，以制备解剖培养皿。这些解剖培养皿也可用于单时间点成像。</li>
	<li>制备生长培养基。
	<ol>
		<li>配制50 mL的1,000倍维生素母液，其中包含5 g肌醇、0.05 g烟酸、0.05 g盐酸吡哆醇、0.5 g盐酸硫胺素和0.1 g甘氨酸。</li>
		<li>配制生长培养基，成分为½ Murashige和Skoog培养基、1%蔗糖、1.6%琼脂、1倍维生素，pH = 5.8。经高压灭菌后冷却备用。</li>
		<li>在无菌洁净工作台上，将铰链式塑料盒（约5.2 cm × 5.2 cm × 3 cm）浸入70%乙醇中15分钟进行灭菌。</li>
		<li>在无菌洁净工作台上，待培养基冷却至适宜温度后，加入N6-苄基腺嘌呤至终浓度为200 nM，并加入1/1,000稀释的PPM（植物防腐剂混合物），充分混匀。将灭菌后的塑料盒填充约一半深度的培养基。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 分离 SAM
<ol>
	<li>用锋利的镊子剪下花序，并从花梗基部剥除较老的花蕾，直至肉眼难以分辨。</li>
	<li>用镊子在解剖皿中的琼脂糖上切开一条切口，将花序基部插入厚实的琼脂中，以提供稳固支撑，便于在解剖镜下进一步精细解剖较年轻的花组织，从而暴露茎尖分生组织（SAM）。</li>
	<li>在解剖显微镜下，用镊子从最老的花蕾开始，依次向较年轻的发育阶段轻轻下压，去除剩余的花蕾，直至茎尖分生组织（SAM）可见。通常在去除发育至第6至第7阶段的较老花蕾后，SAM 即可暴露。一旦 SAM 暴露，应迅速进入下一步操作，避免样品脱水。</li>
</ol>
4. 培养的自组装单分子膜的转移与生长
<ol>
	<li>将新鲜解剖的样本按照第1节所述方法接种到长方形塑料铰链培养盒的培养基中，使茎尖分生组织（SAM）刚好暴露在培养基表面之上。在培养盒边缘滴加几滴无菌去离子水，然后盖上盖子以维持盒内湿度。注意所加的水不可淹没茎尖分生组织（SAM）。</li>
	<li>盖紧盖子，并用微孔胶带将培养盒密封。将培养盒置于22 °C的长日照或连续光照条件下培养12–24 h，使茎尖分生组织（SAM）从解剖操作中恢复，并适应培养环境。</li>
</ol>
5. SAM 的成像
<ol>
	<li>用无菌去离子水填充含有 SAM 的培养盒，使水完全覆盖样品。在解剖显微镜下检查，并使用 1 mL 移液枪对准样品强力喷射水流，以去除任何气泡。</li>
	<li>将培养盒放置在直立式共聚焦显微镜的载物台上。注意确保培养盒不与显微镜物镜接触。使用数值孔径为 0.8–1 的长工作距离 40x 或 60x 水浸物镜，该物镜适用于无需盖玻片的成像。</li>
	<li>将物镜浸入水中，并检查物镜前端是否形成气泡。如有气泡，应降低载物台，用光学擦拭纸轻轻擦拭镜头，并用巴斯德移液管向物镜前端添加少量水，然后重新浸入水中。</li>
	<li>使用共聚焦显微镜的 GFP 滤光片和落射照明模块，调节 XY 控制器以定位样品。调节目镜位置，将 SAM 置于光源正下方，并沿 Z 轴调焦直至找到顶端分生组织。 
	注意：切勿直视紫外光。</li>
	<li>找到样品后，使用能够激发 GFP 的激光（例如 488 nm 或 496 nm 激光源）进行照射。调节显微镜的光学变倍，使整个 SAM 及第 1 阶段花原基均位于视野范围内。进一步调节激光输出功率和增益设置，以确保获得最佳的信噪比。 
	注意：激光强度过高会导致样品发生光漂白。利用欠曝光与过曝光调色板有助于更准确地调整这些参数。</li>
	<li>让样品静置 2–5 分钟。以约 0.3 µm 的像素尺寸分辨率，以 0.25 µm–0.5 µm 的 Z 轴切片间隔采集样品的共聚焦 Z 堆栈图像。确保从样品浸入水中开始，至完成图像采集为止，单个样品的总成像时间不超过 10 分钟。</li>
	<li>立即吸除水分，并将培养盒移回生长室。长时间将样品浸泡在水中会影响细胞的渗透状态。</li>
</ol>
6. SAM 的微机械扰动
<ol>
	<li>按照第5节所述设置成像条件，获取皮层微管组织的消融前图像序列。</li>
	<li>倒掉培养皿中的水。使用洁净的注射针头（0.4 mm × 20 mm）进行消融操作。
	<ol>
		<li>在解剖显微镜下，小心持握针头，缓慢接近茎尖分生组织（SAM）。 
		注意：屏住呼吸并以放松的手势持针有助于避免抖动。</li>
		<li>用针尖短暂接触 SAM 顶端穹顶，以确认完成消融。建议在 SAM 边缘区域进行消融，以便观察穹顶中央区域无序排列的皮层微管的行为及其转变过程。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重新向培养皿中加入无菌去离子水，并加入碘化丙啶（10 µg/mL）。除监测 GFP 标记的皮层微管信号外，使用独立通道观察碘化丙啶可清晰标记被消融细胞的区域。碘化丙啶可使用561 nm或其他合适波长的激光激发，发射光信号采集范围为600–650 nm。</li>
	<li>消融后立即采集图像序列（见第6节），之后每2小时重复采集一次，持续6小时。每次采集完成后，将培养皿连同样品放回培养箱中。确保培养基表面保留少量水分，并用微孔胶带封住培养皿以防止干燥。</li>
</ol>
7. 数据可视化与定量分析
<ol>
	<li>使用免费软件（如 MORPHOGRAPHX11、FIJI12 或宏工具 SurfCut13）生成表面投影。</li>
	<li>在 FIJI 中使用 FibrilTool14 宏工具提取皮层微管的各向异性。 
	注意：相关软件使用的详细方案可从对应的参考文献中获取。</li>
</ol>

<ol><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-constructing+our+models+of+cellulose+and+primary+cell+wall+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly.</a> Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).</li>
<li>McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+cellulose+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of cellulose synthesis.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).</li>
<li>Burgert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+micromechanical+design+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Exploring the micromechanical design of plant cell walls.</a> American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).</li>
<li>Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cellulose+synthase+demonstrates+functional+association+with+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules.</a> Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).</li>
<li>Barbier de Reuille, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MorphoGraphX%3A+A+platform+for+quantifying+morphogenesis+in+4D%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D.</a> Elife. 4, 05864(2015).</li>
<li>Kierzkowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+domains+regulate+growth+and+organogenesis+in+the+plant+shoot+apical+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem.</a> Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).</li>
<li>Heisler, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alignment+between+PIN1+polarity+and+microtubule+orientation+in+the+shoot+apical+meristem+reveals+a+tight+coupling+between+morphogenesis+and+auxin+transport%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport.</a> PLoS Biology. 8 (10), e1000516(2010).</li>
<li>Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+mechanical+compression+on+cortical+microtubules+in+Arabidopsis%3A+a+quantitative+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline.</a> Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).</li>
<li>Nakayama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+auxin-mediated+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of auxin-mediated growth.</a> Current Biology. 22 (16), 1468-1476 (2012).</li>
<li>Marc, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+GFP-MAP4+reporter+gene+for+visualizing+cortical+microtubule+rearrangements+in+living+epidermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells.</a> Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).</li>
<li>Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Plant+Growth+and+Cell+Proliferation+with+MorphoGraphX%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX.</a> Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+SurfCut%3A+a+user-friendly+pipeline+for+high-throughput+extraction+of+cell+contours+from+3D+image+stacks%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks.</a> BMC Biology. 17 (1), 38(2019).</li>
<li>Boudaoud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FibrilTool%2C+an+ImageJ+plug-in+to+quantify+fibrillar+structures+in+raw+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images.</a> Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), (2019).</li>
<li>Hervieux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mechanical+Feedback+Restricts+Sepal+Growth+and+Shape+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis.</a> Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+and+supracellular+mechanical+stress+prescribes+cytoskeleton+behavior+in+Arabidopsis+cotyledon+pavement+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells.</a> Elife. 3, e01967(2014).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), dev179036(2019).</li>
<li>Uyttewaal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+acts+via+katanin+to+amplify+differences+in+growth+rate+between+adjacent+cells+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis.</a> Cell. 149 (2), 439-451 (2012).</li>
<li>Hamant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+patterning+by+mechanical+signals+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis.</a> Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

评估机械信号转导事件对于鉴定参与机械感知和信号转导通路的分子调控因子至关重要。本文所述方案通过利用拟南芥（Arabidopsis）茎尖分生组织（SAM）中皮层微管的响应作为该过程的读出指标，提供了对这类事件的定量观察视角。此处描述的实验步骤已在多种组织类型的研究中被常规应用16,17,18,19。在所有组织类型中，微管各向异性在4小时范围内均表现出显著增加。
该实验方案中最关键的步骤是确保微管结构不会因长时间浸入水中而发生改变，因为水本身会导致细胞膨压升高。因此，应尽量缩短成像时间。尽管这可能会影响图像分辨率，但能够更准确地反映扰动处理的结果。第二重要的步骤是小心地解剖茎尖分生组织（SAM）。由于其尺寸极小，在操作过程中极易受损。如果较老器官的花梗未完全去除，则后续器官将更难移除。最后，在解剖过程中应避免SAM...

植物细胞被一层由多糖和糖蛋白组成的细胞外基质所包围，其力学特性类似于一种纤维增强复合材料，能够动态改变其机械性能1。植物细胞的生长由水分进入细胞所驱动，导致细胞壁上同时产生张力。为响应此类张力，细胞壁物理状态的改变使得细胞得以扩展。具有初生壁的细胞相较于含有次生壁的细胞能够更快地生长，这主要归因于两者细胞壁内多糖化学组成的差异。初生壁主要由纤维素、半纤维素和果胶以及糖蛋白组成，并且不含木质素，而木质素是次生壁中的组分2。纤维素是一种通过β-1,4糖苷键连接的葡萄糖聚合物，是细胞壁的主要成分。它形成纤维状结构，能够承受细胞生长过程中产生的高强度张力3。除了抵抗张力外，沿特定方向的机械增强作用会导致细胞在纤维素微纤丝净取向的垂直轴方向上由膨压驱动扩展。纤维素微纤丝的排列受到皮层微管细胞骨架的影响，因为后者可引导位于质膜上的纤维素合成复合体进行定向移动4。因此，利用与荧光分子融合的微管相关蛋白或微管蛋白来监测皮层微管的排列，可作为观察植物细胞中纤维素分布模式的间接手段。
皮层微管细胞骨架的排列受细胞和组织形态所衍生的机械力调控。在 SAM 顶端的细胞中，皮层微管的组织结构随时间推移并无特定取向；而在 SAM 周围区域以及 SAM 与新生器官交界处的细胞中，皮层微管则形成稳定且高度有序的跨细胞阵列5。目前已发展出多种方法用于物理干扰细胞的力学状态。改变渗透压状态，以及使用影响细胞壁刚性的药理学或酶学化合物，均可导致细胞所受张力的相应变化6,7。另一种替代方法是使用可逐步增加组织所受压缩力的装置8。施加离心力也被证明可在不与细胞发生物理接触的情况下影响其机械力9。然而，目前最广泛使用的方法是利用所有表皮细胞均处于张力状态这一特性，通过物理消融细胞，局部消除膨压并破坏细胞间黏附，从而改变邻近细胞所受的张力。该操作可通过聚焦高功率脉冲紫外激光或使用细针实现。
本文详细阐述了在 SAM 处对皮层微管行为进行成像和评估以实施机械扰动的过程。

<table><tbody><tr><td>FibrilTool</td><td></td><td></td><td>Boudaoud, A. &lt;em&gt;et al&lt;/em&gt;., Nat Protoc. 2014</td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td>Schindelin, J. &lt;em&gt;et al&lt;/em&gt;., Nat Methods. 2012</td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Merck</td><td>1.04201.1000</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 共聚焦显微镜</td><td>Leica</td><td>DM6000 CS</td><td></td></tr><tr><td>MAP4-GFP</td><td></td><td></td><td>Marc, J. &lt;em&gt;et al&lt;/em&gt;., Plant Cell 1998</td></tr><tr><td>微孔胶带</td><td>Leukopor</td><td>02482-00</td><td></td></tr><tr><td>MorphographX</td><td></td><td></td><td>Strauss, S. &lt;em&gt;et al&lt;/em&gt;., Methods Mol Biol. 2019</td></tr><tr><td>肌醇</td><td>Sigma</td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>N6-苄基腺嘌呤</td><td>Sigma</td><td>B3408</td><td></td></tr><tr><td>烟酸</td><td>Sigma</td><td>N4126</td><td></td></tr><tr><td>塑料铰链盒</td><td>Electron microscopy sciences</td><td>64312</td><td></td></tr><tr><td>PPM（植物防腐剂混合物）</td><td>Plant Cell Technology</td><td>PPM</td><td></td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Sigma</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>盐酸吡哆醇</td><td>Sigma</td><td>P9755</td><td></td></tr><tr><td>SURFCUT</td><td></td><td></td><td>Erguvan, O. &lt;em&gt;et al&lt;/em&gt;., BMC Biol. 2019</td></tr><tr><td>盐酸硫胺素</td><td>Sigma</td><td>T4625</td><td></td></tr></tbody></table>

活细胞成像观察微管细胞骨架及微机械操控 拟南芥 茎尖分生组织

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

多年来，细胞和组织水平上生长与形态发生的调控机制一直是生物学研究的前沿课题。分子和成像技术的进步使我们得以深入了解生化信号如何影响形态发生事件。然而，越来越多的证据表明，除了生化信号外，机械信号也在细胞和组织生长的多个方面发挥重要作用。拟南芥茎尖分生组织（SAM）是一种穹顶状结构，负责产生所有地上器官。介导植物细胞壁中纤维素沉积的皮层微管细胞骨架在空间上具有明确的分布特征。对皮层微管排列模式进行可视化和定量分析，对于理解SAM区域细胞的生物物理特性至关重要，因为纤维素是植物细胞壁中最刚性的组分。皮层微管组织的典型模式也是SAM中广泛存在的组织尺度物理力的结果。干扰这些物理力并随后监测皮层微管的组织变化，有助于鉴定参与介导机械感知与信号转导的候选蛋白。本文介绍了一种用于研究此类过程的实验方案。

图1展示了来自MBD-GFP品系的典型投影图像，其中位于穹顶中心的细胞其皮层微管排列紊乱，而位于边缘区域的细胞则呈环状分布（图1A,B）；相比之下，边界区域细胞的皮层微管则沿细胞长轴平行排列。这些观察结果揭示了茎尖分生组织（SAM）不同区域之间皮层微管空间分布的差异。延时成像显示，在消融处理后6小时内，皮层微管的排列从高度无序状态逐渐转变为更有序的结构（图1C,D）。利用FibrilTool生成的张量可叠加于皮层微管图像上，张量越长表示各向异性程度越高，同时也能反映皮层微管排列的主要方向。提取的信息可通过绘制随时间变化的平均各向异性值来表示（图1E）15。建议每种处理或基因型的样本量为四到...

本文介绍了一种对茎尖分生组织中皮层微管细胞骨架进行活细胞成像并监测其对物理力变化响应的实验方案。

理解细胞和组织水平上生长与形态发生的调控机制是数十年来生物学研究的前沿课题。随着……的进展

该方案有助于我们理解微管细胞骨架在植物中的行为。同时，它也有助于我们了解这些影响细胞和器官形态的结构组分如何响应机械力的变化。尽管该方法不需要复杂的操作，但它能够提供不同基因型和条件下机械响应差异的可靠定量结果。首先，在长日照条件下，于20℃和6℃的土壤中培养表达与绿色荧光蛋白融合的微管结合结构域的拟南芥种子，持续一周。萌发后，将幼苗转移至具有充足生长空间的新花盆中，以促进旺盛的营养生长，并将植株置于短日照条件下的20℃和16℃环境中。三至五周后，将植株转回相同温度的长日照条件下，直至植株抽薹，使花序生长至2至5厘米长。进行茎尖分生组织解剖时，将花序放入解剖皿中，用锋利的镊子从花梗基部剥去花朵，直至肉眼难以看到花梗，以去除较老的花芽。用镊子在解剖皿的琼脂中切出一条切口，将花序基部插入较厚的琼脂中。将解剖皿置于解剖显微镜下。 从最老的花蕾开始，用镊子轻轻推动，将花蕾从植株上移除。通常在去除发育至第6至第7阶段的较老花朵后，茎尖分生组织会暴露出来。继续用镊子将每个花蕾逐一向下推动，直至茎尖分生组织可见为止。一旦暴露茎尖分生组织，立即将新鲜解剖的样品放入生长培养基中，置于经乙醇灭菌的矩形塑料铰链式培养盒内，使茎尖分生组织恰好暴露在培养基表面之上。在培养盒边缘加入数滴无菌去离子水，盖上盖子以维持盒内湿度。用微孔胶带包裹培养盒，并将培养盒置于22摄氏度、长日照或连续光照条件下培养12至24小时。当植物从解剖操作中恢复后，用无菌去离子水覆盖样品，并在解剖显微镜下检查是否存在气泡。将培养盒转移至直立式共聚焦显微镜载物台上，选择 40 或 60X 水浸物镜。将物镜浸入水中，并检查物镜前端是否存在气泡。为去除气泡，先降低载物台，然后用光学镜片纸轻轻擦拭物镜。接着使用巴斯德移液管向物镜前端加入少量水，再将物镜重新浸入水中。随后，使用共聚焦显微镜的GFP滤光片和落射式照明模块，调节XY控制器以定位样品。调整目镜位置，将茎尖分生组织置于光源正下方，沿Z轴方向调焦直至观察到顶端。使用能够激发GFP的激光照射样品，并调节显微镜的光学变焦，使整个茎尖分生组织及一期花原基均位于视野范围内。随后，调节激光输出功率和增益设置，以获得最佳的信噪比。待样品静置两到五分钟之后，以0.25至0.5微米的Z轴切片间隔对样品进行共聚焦Z栈成像，像素尺寸分辨率约为0.3微米。成像结束后，立即吸除水分，并将培养盒转移回生长培养箱中。对于微机械扰动茎尖分生组织实验，首先按照上述方法获取皮层微管排列的消融前图像栈，然后将培养盒中的水去除并转移至培养皿中。在解剖显微镜下转移茎尖分生组织，并用一支洁净的0.4 × 20毫米注射针头缓慢接近茎尖分生组织。用针尖短暂接触茎尖分生组织圆顶的边缘，以确认消融操作已完成。随后用无菌去离子水重新填充培养皿。然后向培养皿中加入浓度为 10 微克/毫升的碘化丙啶，并立即采集图像堆栈，每两小时一次，持续六小时，每次采集后将培养皿放回培养箱中继续孵育。进行数据分析时，使用合适的图像分析软件生成图像堆栈的表面投影，并利用 Fiji 中的 Fibril Tool Macro 提取皮层微管的各向异性。此处可观察到典型的投影图像：来自微管结合域 GFP 标记品系的细胞中，位于穹顶中心的细胞其皮层微管排列紊乱，位于边缘区域的细胞其皮层微管呈环向分布，而边界区域细胞的皮层微管则与细胞长轴平行排列。延时成像显示，在消融后的六小时内，皮层微管排列从高度无序的状态逐渐转变为更有序的阵列。可以将张量叠加到皮层微管图像上，并通过绘制随时间变化的平均各向异性来表示提取的信息。在调整激光输出功率和增益设置时，应确保能够清晰观察到微丝结构，同时尽量避免过度曝光，因为信号过饱和可能在后续分析中对张力方向的判断产生偏差。还可以进行原子力显微镜检测，以评估机械力的变化如何实际影响细胞壁的物理状态。

live-cell-imaging-microtubule-cytoskeleton-micromechanical

Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

细胞细胞成像的微管细胞和微机械操作的 阿拉比多普西斯拍摄 阿皮克·梅里斯特姆

我们介绍一种利用培养皿和培养基固定植物子叶的方法，以便在数天的发育过程中对表皮进行共聚焦成像，记录气孔分化过程。通过荧光蛋白标记，可动态追踪蛋白的表达及其亚细胞定位，从而加深对其在细胞分裂和细胞类型分化过程中可能作用的理解。...

长期、高分辨率共聚焦延时成像 拟南芥子叶 萌发期间的表皮

Ca2+ 信号调控植物中多种多样的生物学过程。本文介绍了利用基因编码的 Ca2+ 探针 Aequorin 或 Case12，监测非生物胁迫在拟南芥细胞和组织中诱导产生的时空 Ca2+...

测量拟南芥植物中的空间和时间Ca2+信号

活体共聚焦成像为生物学家研究发育过程提供了强有力的工具。本文中，我们介绍了一种对发育中的拟南芥（Arabidopsis）花进行活体共聚焦成像的详细实验方案。...

活体共聚焦成像观察拟南芥花的发育过程

本文演示了如何在双层微流控平台上培养拟南芥（Arabidopsis...

成像根毛形态 拟南芥 双层微流控平台中的幼苗培养

我们报道了一种简单且通用的方法，可用于对拟南芥（Arabidopsis...

一种通用的封片方法 拟南芥 用于活体时间序列成像的叶片

本实验方案介绍了如何利用激光扫描共聚焦显微镜对不同植物物种的茎尖分生组织进行活体成像与分析。...

不同植物物种茎尖分生组织的共聚焦活体成像

本文描述了一套转基因拟南芥（Arabidopsis...

可诱导的、细胞类型特异性表达 拟南芥 通过LhGR介导的 转录-激活

在此，我们描述了一种对半体外 (SIV) 法用于观察花粉管导向与接收过程 拟南芥, 这会提高胚珠的接受性。高通量SIV 与隔膜...

活体成像 拟南芥 花粉管接收与半体外双受精实验方法体外室间隔 方法

本文介绍了几种常用的研究质膜受体激酶膜运输事件的方法。文稿中描述了详细的实验方案，包括植物材料准备、药物处理以及共聚焦成像设置。...

基于图像的方法研究气孔谱系细胞中的膜运输事件

减数分裂前期染色体的运动是一种尚不完全清楚的现象，但对孢子形成至关重要。本实验方案描述了一种在拟南芥（Arabidopsis...

活体成像表征雄性减数分裂前期着丝粒的运动 拟南芥

该过程结合使用共聚焦显微镜与荧光标记的细胞核及染色质标记品系 拟南芥 同时记录细胞核与染色质动态 拟南芥...

发育与环境胁迫过程中细胞核形态及染色质动态的定量活细胞成像 拟南芥 根

了解拟南芥茎尖分生组织中皮质微管细胞骨架的活细胞成像方法。该技术用于研究机械力对植物细胞结构的影响，并可定量分析不同基因型的力学响应差异。

活细胞成像观察微管细胞骨架及微机械操控拟南芥茎尖分生组织

探索更多视频

活细胞成像观察微管细胞骨架及微机械操控 拟南芥 茎尖分生组织

探索更多视频

活细胞成像观察微管细胞骨架及微机械操控拟南芥茎尖分生组织