从固定心脏中分离心肌细胞用于免疫细胞化学和倍性分析

本方案提供了一种从任意心脏组织中分离杆状心肌细胞的方法，随后可用于检测这些心肌细胞的倍性及核化状态，且无需人工分析。与其他技术相比，本方案可获得更稳定的细胞产量和细胞形态；与流式细胞术不同，我们能够通过可视化方式确认心肌细胞的核化状态和倍性。该方法的可视化演示尤为重要，因为心脏组织的分割与关联过程通过视觉观察更易于理解。

首先将已处死的小鼠置于仰卧位，并用胶带固定伸展的四肢。使用钝头剪刀剪开胸腔以暴露心脏，然后剪断降主动脉和下腔静脉。

使用连接输注装置并带有23号蝶形针的蠕动泵，通过左心室注入3毫升氯化钾PBS溶液以灌注心脏。注意勿刺穿室间隔。随后以每分钟1毫升的速度注入10毫升4% PFA溶液，持续10分钟。

使用剪刀取出整个心脏。如需要，可分离特定区域。将组织置于含有1毫升4%PFA溶液的1.5毫升离心管中。

在摇床上孵育一小时。将心脏置于含有 PBS 溶液的培养皿中，轻轻挤压以去除心室中残留的 PFA，并用 PBS 清洗。

将固定的心脏放入含有胶原酶溶液的新1.5毫升离心管中，然后在37°C条件下于摇床上孵育过夜。次日，将心脏转移至含有胶原酶溶液的35毫米培养皿中，用镊子或剪刀将其解离成约1毫米大小的组织块。

然后使用移液管将解离的组织进一步吹打2分钟。如果仍有组织颗粒存在，换用尖端更细的移液管继续吹打，直至大部分组织被分散。将200至600微米的尼龙筛网置于15毫米离心管上。

向解离的细胞中加入5毫升PBS，并通过尼龙网筛过滤。用额外的4毫升PBS冲洗尼龙网筛。然后将过滤后的溶液在10至100 × g条件下离心1分钟。

弃去上清液，并在染色前将沉淀重悬于 10 毫升 PBS 中。下载 ImageJ 的 Fiji 发行版后，打开 Fiji，点击帮助、更新和管理更新站点。勾选 biomed group 和 IFPB 插件。

下载依赖插件 ellipse split 和 morpho lib J，然后单击关闭并应用更改。接下来，下载 RStudio 并打开。将文本稿件中的代码复制到 RConsole 的命令行中，然后按回车键。

然后在所有提示中输入 Y 以安装所有依赖项。要进行图像定量分析，请打开 Fiji 并将 analyzenucleation.py 拖入状态栏。

当脚本编辑窗口打开后，单击左下角的“运行”按钮。此时会弹出一个对话框，要求指定输出数据目录的位置。请选择一个文件夹，用于存储软件使用的所有分析数据、图表及其他数据。

在分析参数中，选择待分析图像的存储位置，并使用正则表达式输入图像文件名格式。选择所需的设置后，点击“确定”。当分析流程不同阶段的图像显示在屏幕上时，应检查图像以确保阈值分割和图像分割正确进行。打开 analyzemultinucleatedserver。

在 Rstudio 中输入 r。接下来，在名为 folder name 的变量中，输入上一步所选输出数据文件夹的文件路径，路径末尾不要加斜杠。单击脚本编辑窗口左上角的运行应用按钮。

使用滑块设置细胞核平均荧光强度有效值的最低阈值、细胞核面积有效值的最低阈值，以及心肌细胞最小 Feret 直径的有效最大值。向下滚动并点击“应用所选阈值”，然后点击“绘制强度分布”，系统将生成整个样本的细胞核强度分布图，以及每个分组变量的独立子图。为校正样本内变异，向下滚动并勾选“按组分别归一化”，然后点击“计算倍性并绘制估计的倍性分布图”。

当归一化的全样本图谱出现后，应可见两个峰形模式。使用滑块并设置阈值，将二倍体峰和四倍体峰相互分离，并排除异常值。然后向下滚动，点击计算倍性与核型。

最后，点击“plot”按钮并将结果保存至结果文件夹。该方法可用于分离出较为纯净的单个心肌细胞，且无其他污染细胞。该方法易于实施，且在不同批次分离中均能提供稳定的心肌细胞得率和质量。

采用本方案分离的心肌细胞可使用抗体和荧光染料偶联的叠氮化物进行染色。为显示肌节典型的Z线染色模式，细胞经抗α-辅肌动蛋白抗体染色。在另一项实验中，于分离固定的心肌细胞前向小鼠给予EdU。

分离后，检测了经历S期的单核、双核和三核心肌细胞。为识别单个细胞核，根据荧光强度对原始DNA染色图像进行阈值分割，并对细胞核掩膜拟合椭圆，以分割出各个细胞核。

接下来，根据像素距离最近的椭圆将图像像素划分为不同区域，并利用这些区域的边界在细胞核簇中绘制分界线。采用类似的分割方法来检测心肌细胞。该分割策略显示，新生小鼠的大部分心肌细胞为单核细胞。

两周龄小鼠中单核心肌细胞的频率要低得多，仅占心肌细胞总数的约25%。当检测心肌细胞内单个细胞核的倍性状态时，在幼年小鼠中检测到更高比例的四倍体细胞核。在分离心肌细胞时，必须确认所有细胞团块已通过吹打完全分散。