使用便携式qPCR系统对Matricaria chamomilla进行田间鉴定

利用植物来改善健康的做法已有数千年历史。近年来，随着需求增加，加之不可持续的采收方式和气候变化，给供应链带来了压力。因此，植物材料掺假问题日益引起关注，使得植物鉴定在质量控制中变得愈发重要。

理想情况下，鉴定应尽可能在源头附近进行，以便高效地将资源分配给正确身份的材料。植物鉴定有多种方法。传统上，植物鉴定通过形态学评估和化学分析方法进行。

形态学鉴定基于植物材料在宏观和微观特征上的差异。然而，该方法需要经过良好训练的植物学家，且在粉末状植物材料上的应用受到限制。化学分析方法在药典和实验室中被广泛应用，但由于仪器体积较大及对环境条件的要求，不适合用于现场检测。

近年来，由于植物材料中的基因组信息具有高度的保真性和特异性，基因组学方法已成为植物物种鉴定的一种替代技术。随着分子诊断工具以便携式设备的形式出现，该方法已可用于野外现场。本实验方案旨在介绍一种在实验室设备和专业技术人员受限的情况下（例如提供植物材料的农场）利用便携式qPCR系统进行植物鉴定的方法。

母菊（Matricaria chamomilla），通常称为德国洋甘菊，数百年来一直被用作草药以促进健康。为了展示本方法的特异性，本文还包括了德国洋甘菊与另一种常用洋甘菊花——即罗马洋甘菊——的区分作为对比。田间鉴定操作在一处德国洋甘菊种植农场的中部进行演示。

在田间设置一个具有平坦且水平表面的测试区域。选择一株具有代表性的植株，该植株应能反映洋甘菊花田中大多数植株的特征。使用无菌手套从代表性植株上采集一朵花序。

将样品放入一个2.0毫升的收集管中。重复操作，从同一植株上采集一片长约0.5至0.7厘米的小叶片。将干浴孵育器预热至95摄氏度。

向每个收集管中加入 100 微升植物 DNA 提取试剂盒中的提取液。为提高 DNA 提取效率，使用组织研磨棒研磨样品。盖紧管盖。

确保在整个提取过程中植物组织始终被提取液覆盖。将收集管放入预热的干浴孵育器中，在95摄氏度下孵育10分钟。10分钟后，将收集管从干浴孵育器中取出。加入100 µL DNA提取试剂盒中的稀释液，通过反复吹打数次混匀溶液。

对叶片提取重复相同的步骤。进一步振荡以充分混匀溶液。通常情况下，植物组织在此处理后似乎并未发生降解。

液体颜色可能会发生变化并变得浑浊。根据表一设置qPCR仪器的热循环条件，程序起始于恒温步骤以进行初始变性，随后进行25个扩增循环，最后通过温度梯度上升获得高分辨率熔解曲线。使用前将表二所列的qPCR预混液和引物在室温下解冻。

规划每个孔中将要加载的反应。孔中应包含目标物种的阳性对照、非目标物种的阳性对照、样品以及阴性对照。本示例中使用了10个孔，其中5个用于德国洋甘菊鉴定试验，另外5个用于罗马洋甘菊鉴定试验。

对于每种物种鉴定检测，一个孔中加入从目标物种参考物质中提取的DNA作为阳性对照，另一个孔中加入从非目标物种参考物质中提取的DNA作为阳性对照，两个孔中加入从田间采集的花和叶样本中提取的DNA，另设一个孔用于阴性对照。表三描述了每种孔的类型。根据表四为每种植物物种鉴定检测配制反应主混合液。

典型的反应主混合液包含两倍浓度的通用qPCR主混合液、特异性正向和反向引物以及无核酸酶水。使用前通过移液充分混匀反应主混合液。将PCR反应 cartridge 置于平坦且稳定的表面上，开口朝上。

根据此处定义的孔位，将上一步配置的18 µL反应主混合液加入到芯片的各孔中。本演示中，将德国洋甘菊鉴定测试反应主混合液加入标记为GC测试的孔中，即1、3、5、7、9号孔（GCT）；将罗马洋甘菊鉴定测试反应主混合液加入标记为RC测试的孔中，即2、4、6、8、10号孔（RCT）。从DNA提取管的上清液及预提取DNA阳性对照中各取2 µL样本DNA，转移至已预装qPCR主混合液的芯片孔中。

每次将DNA模板加入qPCR预混液后，用移液器轻轻混匀溶液。用粘性封膜小心密封反应板，然后将其装载到热循环室中并关闭盖子。

设置qPCR仪器开始运行。在本实验方案中，使用嵌合染料实时检测目标片段的扩增情况。Ct值定义为荧光信号超过预设阈值所需的循环次数。

循环阈值（Ct值）小于25个循环被视为阳性扩增。在本图中，罗马洋甘菊的阳性对照仅在罗马洋甘菊鉴定试验中发生扩增，而在德国洋甘菊鉴定试验中未发生扩增。德国洋甘菊的阳性对照和田间样品仅在德国洋甘菊鉴定试验中发生扩增，而在罗马洋甘菊鉴定试验中未发生扩增。

阴性对照在两次测试中均未发生扩增。为了进一步确认阳性对照和样本中的特异性扩增，实验室中将每个孔的PCR产物部分样品在2%琼脂糖凝胶上进行电泳。所有Ct值小于25的孔均产生了预期大小的扩增片段，该片段大小在德国洋甘菊和罗马洋甘菊之间有所不同。

其余泳道均未显示特异性扩增产物，这与现场检测中观察到的这些孔无荧光信号的结果一致。PCR扩增后，使用与监测荧光信号相同的软件进行熔解曲线分析。随着温度升高，双链扩增产物开始解离，导致荧光强度下降。

将荧光强度变化进一步转化为熔解峰曲线，以通过其特征熔解峰区分德国洋甘菊与罗马洋甘菊。在本图中，德国洋甘菊阳性对照的熔解峰为85.6°C，明显区别于罗马洋甘菊阳性对照的熔解峰。田间样品的PCR扩增产物产生的熔解峰接近德国洋甘菊阳性对照。

根据特异性扩增及与对照匹配的特征性熔解温度，确定田间样本的种类。在此示例中，田间采集的花和叶均被鉴定为母菊（Matricaria chamomilla），即德国洋甘菊。这两种样本的罗马洋甘菊检测结果为阴性。

本方案展示了利用便携式qPCR系统在野外对德国洋甘菊进行鉴别的方法。我们可基于类似方法开发更多技术，以扩展可检测的植物种类范围。我们希望本视频能为科研人员，甚至非专业人员，在野外或实验室设备有限的环境中进行植物鉴定提供有价值的培训材料。

基于DNA的现场鉴定检测不仅能够产生与实验室分析结果高度一致的高准确性结果，而且还能减少在实验室中进行的传统方法所需的时间和成本。