牵引力显微镜研究B淋巴细胞激活
July 23rd, 2020
在这里，我们提出了一个协议，用于在B细胞上进行牵引力显微镜实验。我们描述了软聚丙烯酰胺凝胶的制备及其功能化，以及显微镜下的数据采集和数据分析摘要。
这种方法可以测量B细胞在免疫突触时所施加的力的空间时间分布，并把它们与特定蛋白质的招募关联。使用聚丙烯酰胺凝胶的牵引力显微镜易于实现。该协议可用于快速设置许多B细胞的机械能力的测量。
这种方法是灵活的，可以适应图形其他配体，如内整，或研究其他类型的免疫突触，如T细胞或沮丧的吞噬。由于本实验要求的凝胶的物理和化学性质，将经典牵引力显微镜方法适应 B 细胞可能比较棘手。首先对凝胶支持进行盐化。
使用紫外线灯激活盖玻片或玻璃底部培养皿两分钟，然后用 200 微升 APTMS 盐化 5 分钟。这将准备对凝胶共价结合的支持。用超纯水彻底清洗盖玻片或玻璃底盘，并使用真空吸气进行干燥。
要准备将凝胶压平的盖玻片，请将其放入陶瓷盖玻片支架中，将盖玻片放入小烧杯中，然后将硅化试剂倒入盖玻片上，确保将其完全覆盖。用铝箔盖住烧杯，在室温下保持三分钟。同时，用超纯水填充大烧杯。
在硅化试剂中孵育三分钟后，将带盖玻片的盖玻片将用水转移到烧杯。用超纯水彻底冲洗盖玻片。擦干，放在纸巾上。
为了获得最佳效果，请立即进行凝胶聚合。根据手稿方向准备 500 个 Pascal 凝胶预混合，然后将预混合的 167 微升与 1.67 微升珠混合。漩涡和声波混合物在沐浴声波器中五分钟。
用铝箔保护混合物免受光线的腐蚀。要进行聚合，在凝胶混合物中加入1.67微升10%铵，然后通过加入0.2微升TEMED和将凝胶与移液器混合来启动聚合。要铸造凝胶，移液器将九微升凝胶混合物投射到每个盐化盖玻片或玻璃底盘上。
立即用硅化盖玻片压平凝胶，用钳子压下凝胶，以确保凝胶扩散到盖玻片的整个区域，并确保其中一部分泄漏出来。将盖玻片或玻璃底盘倒置到大型 Petri 盘中，然后轻拍长凳上，迫使珠子朝凝胶表面移动。将加湿组织放在盘子上，形成湿室。
用铝箔盖住它，孵育一个小时。孵育后，通过向样品中添加PBS，方便套盖唇释放。小心地用针头取下盖玻片，稍微倾斜盘子，但要确保凝胶浸入 PBS 中。
硅化剂、丙烯酰胺、基丙烯酰胺和TEMED通过吸入可能有毒。穿戴标准的个人防护设备，并在化学罩下操作这些产品。从凝胶中吸出 PBS，并在室温下加入 150 微升 Sulfo-SANPAH。
将凝胶暴露在紫外线处理中两分钟，然后用 PBS 清洗凝胶三次。使用 Sulfo-SANPAH 和 PBS 洗涤重复处理，然后将 250 微升的母鸡蛋解酶或 HEL 添加到凝胶中，并在四摄氏度的湿度室中孵育过夜，温度为铝箔。孵育后，取出 HEL 抗原，用 PBS 洗涤凝胶三次。
最后，用500微升B细胞培养基覆盖凝胶，并留在室温下。使用带热和二氧化碳控制的共和显微镜进行成像。从凝胶中吸出介质，留下大约 200 微升。
将凝胶放在显微镜上。两个主要层的珠子将出现在凝胶的底部和顶部。专注于凝胶平面，并找到一个均匀的区域图像。
仔细选择成像区域，确保保持对焦。适当的珠密度和均匀表面是获得可靠和可靠的力测量的关键。将 MD4 小鼠的 80 微升原发 B 淋巴细胞添加到凝胶中，避免接触凝胶以保持焦点。
确保焦点仍然正确，并且可以看到单元格在该区域中下降。在细胞到达凝胶之前启动采集。在 ImageJ 中打开影片作为图像堆栈，然后运行宏裁剪和保存.ijm。
选择输出目录并配置属性通道设置。使用矩形工具选择感兴趣的区域，并使用 T 键将它们添加到 ROI 列表中。完成后，单击"确定"。当宏建议单元格的掩码时，如果满意，请单击"确定"。
如果不满意，请单击"不确定"，然后使用任何选择工具手动选择闭合区域，然后单击"继续"。打开 Matlab 并运行 tfmv1.m。输入所需的参数。
具体到，检查图像属性，如像素大小和采集时间间隔，以及凝胶属性，如年轻模量 E 和泊松比。完成后，将软件的输出定位到与原始文件相同的目录中。正确的珠子图像看起来像一个均匀和随机分布的亮点类似于星空。
当珠子数量过低或图像对焦不足时，数据和分析不可靠。使用细胞与基板第一次接触之前的参考框架，可以用眼睛观察珠子的运动。从单个粒子跟踪可以获得近似结果。
分析提供了参考图像中的珠子作为控件的分割。使用软件，还可以获得位移和应力场，即每个像素和每个时间点局部应力的矢量。在细胞区域集成的位移和力场的标力素提供细胞在基板上施加的总工作。
在比较两个生物条件时，可以计算能量到达高原的最后一个时间点的平均值曲线或平均值。当力的空间信息相关时，也可以比较每个条件的单个时间点。此处显示了荧光抗原提取延时的示例。
突触中荧光信号的逐渐出现表明抗原与凝胶分离。荧光数据可用于构造平均提取曲线。协议中最微妙的步骤是凝胶在盖玻片下的聚合。
此步骤必须相对快速和小心地执行，确保凝胶均匀地挤压在盖玻片下。按照这个程序，表达B淋巴细胞的荧光蛋白可用于同时评估细胞内结构和力模式的定位。该技术可与遗传或化学扰动相结合，以评估特定蛋白质对细胞收缩性和抗原吸收的作用。
概览
本文介绍了一种用于B细胞牵引力显微镜实验的协议，详细说明了聚丙烯酰胺凝胶的制备和数据采集方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 免疫学
背景
- 牵引力显微镜允许测量B细胞施加的力。
- 理解免疫突触对免疫学研究至关重要。
- 聚丙烯酰胺凝胶用于研究细胞的机械性质。
- 将经典方法适应到B细胞存在独特的挑战。
研究目的
- 测量免疫突触处B细胞的机械性能。
- 将力分布与蛋白质招募相关联。
- 提供一个灵活的协议，用于研究各种免疫相互作用。
使用的方法
- 制备盐化的聚丙烯酰胺凝胶。
- 凝胶的紫外处理和蛋白质功能化。
- 使用共聚焦显微镜进行数据采集。
- 使用ImageJ和MATLAB进行图像分析和力测量。
主要结果
- 成功测量了B细胞施加的力。
- 识别了影响数据可靠性的关键参数。
- 展示了该协议对其他免疫细胞的适应性。
- 提供了B细胞在免疫反应中的机械行为洞察。
结论
- 该协议能够详细分析B细胞的机械性能。
- 研究结果有助于理解免疫突触动态。
- 未来应用可能扩展到其他细胞类型和配体。
常见问题
Executive Industry Relevance
Measuring cellular forces at immune synapses provides mechanistic insights into B cell activation, a critical process in humoral immunity and vaccine response. Traction force microscopy enables quantitative assessment of biophysical parameters that correlate with receptor signaling and antigen extraction, supporting target de-risking in biologics development. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking molecular engagement to functional cellular outputs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking BCR engagement to biomechanical responses and protein recruitment at the immune synapse.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct measurement of force-dependent processes in primary B lymphocytes.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying biophysical signatures of activation that correlate with downstream functional outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for assessing ligand-induced cellular mechanics in a reproducible format.
- Operational Value: Standardizes assay conditions through controlled gel rigidity, bead density, and protein functionalization for reliable force measurements.
- Scalability: Supports screening readiness by enabling rapid setup and imaging of multiple B cells under controlled conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects early discovery findings to preclinical validation by measuring force patterns that reflect physiological immune synapse dynamics.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target modulation by correlating antigen extraction with intracellular signaling and cytoskeletal reorganization.
- Disease Relevance: Provides a disease-relevant system for studying B cell responses in contexts such as autoimmunity and infectious disease.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target engagement screening to lead optimization by providing quantitative, imaging-based readouts of cellular mechanobiology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring spatial and temporal force distributions that reveal synapse architecture and signaling coordination.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized polyacrylamide gel preparation and bead-based displacement tracking for consistent force quantification.
- Analytics: Generates displacement and stress fields, enabling calculation of total work and energy plateau metrics for comparing activation states.
- Translational Research: Connects to preclinical work by capturing force patterns that mirror physiological antigen presentation and extraction scenarios.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform adaptable to various ligands and immune cell types beyond B cells, including T cells and phagocytic systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in B cell activation pathways through direct biophysical measurement.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via defined gel polymerization, functionalization, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying early biophysical biomarkers of activation that precede functional readouts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on force-generation capacity linked to antigen extraction efficiency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, confocal microscopy, and biomechanical analysis using ImageJ and MATLAB.
- Depends on instrumentation for UV treatment, gel polymerization, and environmental control during live-cell imaging.
- Necessitates cross-team standardization of gel preparation, bead density, and protein coating to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations for different cell sizes and ligand densities, particularly for small cells like B cells (~6 µm).
- Includes practical limitations such as toxicity of acrylamide and TEMED, requiring chemical hood use and PPE, and sensitivity to bead density and focus for reliable measurements.
