Name: 牵引力显微镜研究B淋巴细胞激活 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-07-23T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 了解牵引力显微镜技术用于研究B淋巴细胞在免疫突触处的力学特性。本方法通过聚丙烯酰胺凝胶测量细胞施加的力，并关联蛋白质招募，为免疫学研究提供可靠的实验方案。

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作者感谢 M. Bolger-Munro 的审阅意见，并感谢法国国家科学研究中心-居里研究所尼康影像中心（Nikon Imaging Center@CNRS-InstitutCurie）以及居里研究所 PICT-IBiSA（巴黎）在图像采集方面的支持，该中心为法国生物成像国家研究基础设施（France-BioImaging）的成员。同时感谢居里动物实验中心提供的支持。PP 得到法国国家科学研究中心（CNRS）的资助。AK 和 JP 得到巴黎笛卡尔大学博士奖学金以及 FIRE 博士研究生项目（Bettencourt 计划）的资助。本项目由以下基金资助：PP（ANR-10-JCJC-1504-Immuphy）和 AMLD（ANR-PoLyBex-12-BSV3-0014-001，ERC-Strapacemi-GA 243103）。

1. 凝胶制备
<ol>
	<li>凝胶支撑物的硅烷化
	<ol>
		<li>使用紫外灯对盖玻片或玻璃底培养皿（将用作凝胶支撑物）活化2分钟（在暴露于紫外灯前等待30秒，以避免接触残留的臭氧）。</li>
		<li>使用200 µL 氨丙基三甲氧基硅烷（APTMS）对盖玻片/玻璃底培养皿进行硅烷化处理5分钟。此步骤将为凝胶的共价结合做好准备。</li>
		<li>用超纯水彻底清洗盖玻片/玻璃底培养皿。</li>
		<li>使用真空抽吸法干燥盖玻片/玻璃底培养皿。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用于压平凝胶的18 mm盖玻片的制备
	<ol>
		<li>制备盖玻片时，先将其放入陶瓷盖玻片架中，然后将盖玻片架放入小烧杯（50 mL）内，并倒入硅烷化试剂（储存于4 °C，可重复使用），确保完全覆盖盖玻片。</li>
		<li>用铝箔覆盖烧杯，在室温下孵育3分钟。在此期间，准备一个大烧杯（500 mL）并装满超纯水。3分钟硅烷化试剂孵育结束后，将带有盖玻片的盖玻片架转移至盛水的烧杯中。</li>
		<li>用超纯水彻底冲洗盖玻片，充分干燥后置于擦镜纸上。为获得最佳效果，应立即进入下一操作步骤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>凝胶聚合
	<ol>
		<li>对于0.5 kPa的凝胶，将75 µL 40%丙烯酰胺与30 µL 2%双丙烯酰胺（交联剂）和895 µL磷酸盐缓冲液（PBS）混合。该预混液可在4 °C保存最多一个月。</li>
		<li>向167 µL 0.5 kPa凝胶预混液中加入1%（1.67 µL）微珠，涡旋混匀，并在水浴超声仪（标准台式超声清洗器，功率50–100 W，频率40 kHz）中超声5分钟。使用铝箔包裹混合物以避光。 
		注意：在未加入引发剂（TEMED）前，预混液不会发生聚合。</li>
		<li>为催化聚合反应，加入1%（1.67 µL）10% w/v 过硫酸铵（APS）。</li>
		<li>为启动聚合反应，加入0.1%（0.2 µL）N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）。用移液器混匀。一旦加入APS和TEMED，凝胶将迅速聚合，因此需立即进行凝胶浇铸操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>凝胶浇铸
	<ol>
		<li>将9 µL凝胶混合液滴加至每片盖玻片/玻璃底培养皿上（滴于中心位置，图1A）</li>
		<li>放置经硅烷化处理的疏水性盖玻片以压平凝胶（图1B）。使用镊子轻压盖玻片，确保凝胶均匀铺展至整个盖玻片表面（图1C），直至液体开始溢出。</li>
		<li>将盖玻片/玻璃底培养皿倒置放入大培养皿中，并轻敲实验台面，促使微珠向凝胶表面迁移（图1D）。</li>
		<li>用铝箔覆盖，在湿润环境中室温静置1小时以完成聚合（例如，在培养皿上方放置湿润的纸巾以防止蒸发）。</li>
		<li>1小时后，向样品中加入PBS以利于盖玻片的剥离。小心使用针头取下盖玻片（不同硅烷的涂层应能使盖玻片轻松从凝胶上剥离，图1E）。</li>
		<li>将凝胶保留在PBS中。 
		注意：凝胶现可在4 °C的PBS中保存5–7天，但建议在48小时内使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 凝胶功能化
<ol>
	<li>在10 mM HEPES缓冲液中配制浓度为0.5 mg/mL的磺基琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮-2'-硝基苯氨基)己酸酯（Sulfo SANPAH）溶液。避光并用铝箔包裹后可在4 °C保存最多一周。</li>
	<li>吸除凝胶中的PBS。</li>
	<li>在室温下向凝胶中加入150 µL Sulfo SANPAH溶液（图1F）。</li>
	<li>将凝胶暴露于紫外光处理2分钟，以光活化Sulfo SANPAH的反应位点，使其共价结合至凝胶表面。</li>
	<li>用PBS洗涤三次（图1G）。</li>
	<li>重复步骤2.2–2.5。</li>
	<li>每孔凝胶中加入250 µL HEL（100 µg/mL），在4 °C湿润环境中避光孵育过夜（图1H）。</li>
	<li>移除HEL抗原，并用PBS洗涤三次。 
	注意：HEL既作为抗原，也作为黏附分子。可被其他能与受体结合的分子替代（例如抗小鼠IgM、牛血清白蛋白、卵清蛋白），或与整合素配体混合使用（例如ICAM1与LFA1结合）。如有需要，可通过荧光标记的HEL（使用蛋白质标记试剂盒对分子进行染色获得，见步骤4）观察抗原摄取情况。需注意，相同体积浓度的溶液在凝胶表面的浓度可能与玻璃表面不同：若需直接比较，应通过二次染色进行定量分析。</li>
</ol>
3. 细胞加载与成像
<ol>
	<li>成像前，从凝胶中移除 PBS 并加入 500 µL B细胞培养基（RPMI 1640、10% 去补体胎牛血清、1% 青霉素-链霉素、2% 丙酮酸钠、50 μM 巯基乙醇和1×非必需氨基酸），并使其平衡至室温。</li>
	<li>细胞制备
	<ol>
		<li>根据阴性选择方案从脾脏中纯化原代B细胞（参见 材料表）。典型的终末B细胞得率约为1 × 107 细胞。将此浓缩至 3 x 106 每毫升细胞数用B细胞培养基（含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素、0.1%巯基乙醇和2%丙酮酸钠的RPMI-1640）调整。</li>
		<li>根据需要将细胞储存最多6小时 4 °C.</li>
		<li>保持细胞在 37 °C 在图像采集前孵育30分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>成像
	<ol>
		<li>使用配备温控和（可能的）CO₂控制功能的共聚焦显微镜2 对照 
		注意：无论使用共聚焦显微镜还是转盘显微镜，均需选择能够实现合适像素尺寸的物镜/针孔组合 &lt;200 nm，以便在分析阶段轻松追踪微珠（例如，60倍，数值孔径1.3）。也可使用落射荧光显微镜，但其信噪比较低，可能使单个微珠的追踪更加困难。</li>
		<li>凝胶底部和顶部将出现两个主要的珠层。聚焦于凝胶平面。 
		注意：理想的凝胶图像应呈现为繁星点点的夜空，珠粒大致均匀分布在同一平面上。</li>
		<li>将采集程序设定为30分钟，帧速率为5秒（可根据实验需求调整，例如采集其他荧光通道、采集z轴层扫等）。</li>
		<li>吸出凝胶中的培养基，保留约 200 µL 将培养基加到凝胶上。将凝胶置于显微镜下，找到微珠的表面层以及凝胶上一个均匀且清晰的区域。</li>
		<li>添加 80 µL 细胞（避免触碰凝胶以保持焦距）。</li>
		<li>确保焦点正确，能够在透射光下观察到细胞在该区域下移。在细胞到达凝胶前启动图像采集。</li>
		<li>若凝胶意外接触、发生振动或焦点漂移，请调整焦距。 
		注意：必须采集凝胶松弛状态的图像，该图像可以是细胞到达凝胶之前拍摄的任意一幅图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 荧光标记的HEL提取实验
<ol>
	<li>通过将荧光染料（颜色需与微珠不同，例如 Alexa 555）与 HEL 结合，制备荧光标记的 HEL，参见材料表。</li>
	<li>在步骤 2.7 中，用荧光标记的 HEL 替代常规 HEL。</li>
	<li>采用低光照设置或低帧率（例如每分钟 2 帧）采集图像，以避免光漂白。</li>
	<li>为定量分析 HEL 的提取情况，根据以下公式计算每帧图像中细胞区域积分强度 I(t)，并以第 0 帧的强度 I(0) 进行校正和归一化： 
	<img alt="归一化强度变化的计算公式，Q(t)=(I(t)-I(0))/I(0)。" src="/files/ftp_upload/60947/60947eq1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="公式 1"> 
	注意：与荧光染料偶联的抗原在凝胶表面不可见（可能是由于凝胶表面荧光染料发生淬灭），但可通过抗 HEL 抗体和荧光二抗验证其存在于凝胶上。可通过使用涂有抗 HEL 抗体的盖玻片从凝胶上剥离抗原，并用荧光二抗（在盖玻片上）显色，验证该荧光染料在脱离后确实具有荧光信号6。提取的抗原信号非常微弱，有时会被微珠的渗漏荧光掩盖。如果仅关注抗原提取，建议制备不含微珠的凝胶（跳过步骤 1.3.2 和 1.4.3）。</li>
</ol>
5. 荧光成像
<ol>
	<li>通过从基因修饰小鼠的脾脏中分离B细胞来获取荧光标记的B细胞，方法与野生型小鼠相同（例如，使用Lifeact-GFP或Myosin II GFP小鼠）。</li>
	<li>对荧光细胞进行成像时，应使用（如有可能）配备长距离水浸物镜（40x–100x）的转盘共聚焦显微镜。</li>
	<li>保持较低的曝光时间和帧率，以避免荧光漂白。 
	注意：由于凝胶的存在，Z方向上的点扩散函数会显著退化，因此建议使用水浸物镜。直立式活细胞显微成像中，当使用浸水物镜时，发射光路中（球形）细胞（及细胞核）的存在会引起严重的球面像差。</li>
</ol>
6. 分析
注意：数据分析通常首先对整个图像序列进行漂移校正，然后在每一帧中定位微珠，通过参考帧（即无细胞时采集的图像）追踪其运动，插值得到位移场，并通过傅里叶变换反演问题以获得应力29。为此，我们建议使用可从在线数据库下载的ImageJ宏和MATLAB程序组合30。
<ol>
	<li>在 ImageJ 中将视频作为图像堆栈打开</li>
	<li>运行宏“Crop_and_save.ijm”
	<ol>
		<li>使用“矩形”工具选择感兴趣区域（ROI），并通过按“t”键将其添加到 ROI 列表中。</li>
		<li>裁剪细胞时，务必包含至少 5–10 像素的固定微珠区域。将过于靠近边界或其他细胞的细胞排除在分析之外。完成后点击“OK”。</li>
		<li>宏将生成一个细胞的掩膜：如果结果满意，则点击“OK”；若不满意，则点击“Not ok”，然后使用任意选择工具（例如“Freehand”或“Oval”）手动选择一个闭合区域，再点击“Continue”。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打开 MATLAB 并运行“TFM_v1.m”。
	<ol>
		<li>输入所需参数：特别检查图像属性（像素大小、采集时间间隔）和凝胶属性（杨氏模量 E、泊松比）。</li>
		<li>默认情况下，参考图像设为第一帧。如有需要可设置为其他帧，或设为“0”以加载外部文件。</li>
		<li>在与原始文件相同的目录中查找软件输出结果（具体说明见 User_notice.pdf 文件）。输出包括微珠的初步轨迹（“FILENAME.fig”）、收缩能随时间变化的图（“FILENAME_energy.fig”）、整合了细胞多个参数的表格（如能量、面积、矩等）“FILENAME_finaltable.mat”、包含位移场和力场的结构体，以及微珠、位移场、应力和能量的视频（可用任意 avi 阅读器打开）。 
		注意：输入参数中的“Window size”指用于插值位移的窗口，即位移场和应力场的最终分辨率。该值通常设为几个像素（默认为四个像素）。不建议减小该值，否则会通过在无微珠区域进行插值而人为提高分辨率。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文所述的牵引力显微镜（TFM）方法可用于系统研究B细胞的主动机械能力。对于B细胞而言，这与其提取和内化抗原的能力相关。与其他TFM方法相比，此处介绍的方案简单且具有较高的可重复性：通过玻璃微球压痕并结合赫兹（Hertz）模型测量得到的基质刚度介于400至600 Pa之间。类似方案不仅已成功应用于B细胞35，也用于T细胞的研究36。与纳米柱阵列（亦曾用于T淋巴细胞37）相比，该方法提供了一个平坦且均质的表面，因此结果更易于解释，因为凝胶与细胞的相互作用主要被限制在与表面相切的方向上。
我们所描述的实验方案可用于研究B细胞对抗原呈递基质施加作用力的空间和时间动态特性。在空间层面上，该方法可提供作用力定位信息，并结合荧光显微镜技术，使实验人员能够将局部作用力与特定分子的存在（例如细胞骨架组分或BCR信号级联中的分子）进行关联分析。在时间层面上，可通过积分计算某些物理量（如总能量或总应力），为每个时间点提供单一数值，从而降低噪声干扰。这使得研究人员能够观察牵引力随时间的变化过程（包括增长和平台期）以及脉冲式作用模式的存在。
以下描述了分析中的关键实验要点。（i）细胞密度：为了进行正确的分析，细胞应充分分离。我们认为，若一个细胞周围存在与其自身大小相当的空旷区域，则该细胞可被分析。（ii）透射图像：建议在实验过程中至少采集一幅细胞的透射图像，用于分析中的掩膜处理。（iii）图像中微球的数量：建议仅分析突触中微球数量在30至200之间（即1–8个微球/µm²）的图像。密度过低将无法实现充分的地图位移重建；密度过高则会导致单颗粒追踪结果不可靠。（iv）实验过程中微球数量应保持恒定；然而，由于成像条件的微小变化（特别是微球彼此过于接近时），可能出现波动。若发生焦平面漂移，必须进行校正，并剔除存在问题的图像帧。（v）凝胶质量：存在过多裂纹、微球分布不均或过厚的凝胶应予以弃用。（vi）根据细胞类型的不同，在多次曝光后，后期时间点（&#62;300帧）的细胞可能会受到光毒性影响。建议在不含细胞的掩膜上运行程序，作为与实验数据对比的“基线”，以评估仅由实验条件引起的噪声水平。
用于在经典黏附实验中测量牵引力的凝胶可用来研究局灶性黏附部位发生的各种过程（如肌动蛋白流动和信号分子的募集），即力作用的位点38,39。然而，免疫突触处的力并非通过局灶性黏附施加。直到最近，才开始利用该方法对B细胞免疫突触上力生成的时空模式进行定量研究。通过牵引力显微技术（TFM），我们首次观察到B细胞免疫突触上的力分布模式，如我们近期的研究中所报道6，这为淋巴细胞的研究开辟了令人鼓舞的新方向。
值得注意的是，该方法采用细胞到达凝胶之前拍摄的图像作为力计算的参考图像。通常的牵引力显微镜（TFM）实验方案建议在实验结束时，即用胰蛋白酶消化去除细胞后，再采集参考图像；这样可使实验者能够寻找细胞密集的区域。尽管此处也可采用该方法，但胰蛋白酶对从抗原包被的凝胶上解离B细胞效率较低，需要等待较长时间才能实现解离，且存在凝胶结构改变或位移的风险（可能导致整个数据集无法使用），风险更高。
本文介绍的方法具有灵活性，可用于研究免疫突触中其他信号的作用，因为它允许将其他蛋白质固定在凝胶表面（例如，已测试整合素配体和免疫球蛋白），甚至可固定荧光抗原（见第4节）。此外，细胞仍可被实验人员接触，便于进行药物处理和局部扰动。最后，该方法也适用于固定细胞的成像。对于这些观察，建议在盖玻片上制备凝胶，对细胞染色后，将盖玻片粘附到载玻片上，然后再添加封片介质和另一张盖玻片。观察时应使凝胶位于上方，以避免光线穿过凝胶导致图像质量下降。
可能存在的问题包括凝胶在聚合和包被过程中的变异性。聚合问题主要源于引发剂/催化剂的质量。此外，凝胶可能会发生膨胀，尤其是在组装后未立即使用的情况下。此问题似乎不会显著影响凝胶的机械性能，但可能导致物镜无法接触到微珠层，从而使凝胶无法使用。当出现该问题时，我们建议为每种条件额外制备一些凝胶。包被过程也可能存在一定变异性，因此至关重要的是要使用新鲜稀释的 Sulfo SANPAH。
综上所述，我们描述了一种简单、廉价且可重复的方法，用于测量B细胞在BCR配体激活下于免疫突触处施加的力。该方法可通过使用适当的受体配体，进一步适用于研究其他配体刺激反应以及其他类型的淋巴细胞（如记忆B细胞、T细胞等）。

B细胞是免疫系统中产生抗体的细胞。为了激活适应性免疫反应，B细胞首先通过一种特异性受体——B细胞受体（BCR）1，以天然形式（即未经加工）获取抗原。该过程发生在淋巴结的B细胞区。尽管部分抗原可通过淋巴液到达B细胞，但大多数抗原，尤其是分子量较高者（&#62;70 kDa，超过淋巴管通道的尺寸限制），实际上是通过抗原呈递细胞（APC）表面以天然形式呈现的，这类细胞通常为被膜下窦巨噬细胞或滤泡树突状细胞，抗原通过凝集素受体或Fc受体（非特异性）结合于其表面。B细胞与该细胞的接触会形成免疫突触，在此过程中BCR对APC表面的抗原施加机械力。抗原与BCR的结合可启动BCR信号传导，进而可能激活产生机械力的机制。这些机械力不仅可能在放大BCR信号传导中发挥重要作用，而且对于B细胞提取并内化抗原也至关重要。
近期研究表明，B细胞受体（BCR）确实具有机械敏感性2。例如，较硬的基底可引发更强的BCR信号传导3。此外，在免疫突触处产生的机械力会牵拉单个BCR，以探测其与抗原的亲和力，从而确保亲和力的区分4。因此，研究B细胞对抗原呈递的机械响应，并从所涉受体类型（IgG/IgM）5、黏附分子（整合素配体）或药理学与遗传学修饰细胞（例如，沉默BCR信号通路或细胞骨架动力学下游的某种蛋白）等方面解析该响应，具有重要意义6。
一种简单的方法可用于观察细胞对生理性硬度基底的响应，同时研究细胞施加在基底上的作用力，该方法即牵引力显微镜技术（Traction Force Microscopy, TFM）。TFM 的原理是通过观测细胞在弹性基底上牵拉所产生的位移场来实现。最初，通过相差显微镜观察弹性体自身产生的皱褶来检测凝胶的形变7，但随后引入荧光微珠作为基准标记物，显著提高了分辨率，并逐渐成为标准方法8。该技术已被用于研究贴壁细胞、组织乃至嵌入凝胶中的类器官所产生的牵引力。目前已发展出多种 TFM 的变体形式9，包括与超分辨率显微镜联用（例如 STED10 或 SRRF11）、调整凝胶的折射率以实现全内反射荧光显微镜（TIRF）观测12、以纳米打印图案替代微珠13，以及使用纳米柱阵列替代平面基底14。有关这些变体技术的全面综述，请参见 Colin-York 等人15。
本文所述方案介绍了一种用于测量B细胞在抗原包被基底上施加力的方法。这些力作用于配体（抗原）以使其发生聚集，并随后从抗原呈递基底中将其提取出来。我们对标准的牵引力显微镜（TFM）方案进行了优化，以模拟生理条件下抗原呈递基底的刚度、尺寸以及适用于B细胞的包被条件。该方案可同时研究多个细胞，并可与荧光显微镜技术及化学处理方法联合使用。然而，本方案并不适用于单分子水平的力测量，后者更适合采用光镊16、分子张力探针17,18、生物膜力探针19和原子力显微镜20等技术。与其他单细胞力测量方法（例如微管吸吮法21或微板法22）相比，TFM能够在约300 nm的空间分辨率下重建免疫突触处所施加力的完整分布图谱。这有助于识别细胞表面力的时间-空间分布模式，并且由于凝胶适用于共聚焦成像，还可将这些力学信息与特定蛋白（例如细胞骨架蛋白和信号转导蛋白）的募集情况进行关联分析。
尽管三维牵引力显微镜（3D TFM）是可行的，但它与我们所使用的基底刚度和实验装置不兼容。三维形变可通过其他更复杂的装置实现，例如突出力显微镜（AFM扫描细胞接种的可变形膜）23,24，以及弹性共振干涉应力显微镜（ERISM，利用凝胶作为光的共振腔，以数纳米精度凸显基底的形变）25。尽管这些技术前景广阔，但目前尚未应用于B细胞。其他类型的TFM，例如基于纳米柱的方法14，可用于获得更可重复的基底。然而，这种几何结构不适用于柔软的细胞，因为细胞会嵌入柱体之间，从而增加分析难度。事实上，该方法已在T细胞中应用，用于观察细胞在柱体周围构建结构的能力26。
尽管该方法较为简单，但使用聚丙烯酰胺凝胶的牵引力显微技术（TFM）能够同时观察大量细胞，并且可在配备实验台和落射荧光显微镜的任何实验室中方便且低成本地实施（尽管我们推荐使用共聚焦/转盘显微镜）。
为了模拟抗原提呈细胞（APC）的生理刚度，我们使用刚度约为500 Pa27的聚丙烯酰胺凝胶，并在凝胶表面功能化激活性抗原。在本方案中，我们在聚丙烯酰胺凝胶表面功能化了鸡卵溶菌酶（HEL）。这使得我们能够通过抗原结合位点的结合来测量B细胞受体（BCR）刺激所产生的力。使用该抗原以及来自MD4小鼠的HEL特异性B细胞，可确保在抗原交联时产生相对均一的力28。然而，也可将其他分子（例如用于B6小鼠的抗IgM抗体）接枝到凝胶上，但在这些情况下产生的力可能更具异质性且强度较低。由于B细胞是体积较小的细胞（直径约6 µm），微珠的数量已被优化至最大但仍可追踪的水平。对于在基底上施加约kPa级别作用力的较大细胞，可使用相对稀疏分布的微珠或采用简单的粒子图像测速法（PIV）来重构形变场，即可获得满意结果。然而，对于像B淋巴细胞这类仅施加约50 Pa微弱应力的小细胞，则必须采用单颗粒追踪技术（粒子追踪测速法，PTV），以便在重构形变场时达到所需精度。为了可靠地对每个微珠进行单独追踪，物镜的放大倍数需至少为60倍，数值孔径约为1.3。因此，凝胶必须相对较薄（&#60;50 µm），否则微珠将超出物镜的工作距离而无法清晰成像。
主要实验方案包括三个部分：凝胶制备、凝胶功能化和成像；另有两个可选部分，分别用于抗原提取定量和荧光细胞成像。

<table><tbody><tr><td>3-氨基丙基三甲氧基硅烷 (APTMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td>分装保存，避免潮湿</td></tr><tr><td>40% 丙烯酰胺溶液</td><td>Biorad</td><td>1610140</td><td></td></tr><tr><td>Alexa555 微量蛋白质标记试剂盒</td><td>Molecular Probes</td><td>A30007</td><td></td></tr><tr><td>过硫酸铵 (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 B 细胞分离试剂盒</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-862</td><td></td></tr><tr><td>β-巯基乙醇</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>2% 双丙烯酰胺溶液</td><td>Biorad</td><td>161-0142</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白 (BSA)</td><td>Euromedex</td><td>04-100-812-C</td><td></td></tr><tr><td>18 mm 盖玻片</td><td>VWR</td><td>631-1580</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td>灭活处理（56&amp;deg;C 下 40 分钟）</td></tr><tr><td>Fluorodishes FD35</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>FD35100</td><td></td></tr><tr><td>Fluosphere：羧基修饰，0.2 μm，深红色</td><td>Molecular Probes</td><td>F8807</td><td></td></tr><tr><td>鸡蛋清溶菌酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>储存为 100 mg/mL 分装液</td></tr><tr><td>MEM 非必需氨基酸溶液 (100X)</td><td>Thermofisher/Gibco</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-四甲基乙二胺 (TEMED)</td><td>Euromedex</td><td>50406-B</td><td></td></tr><tr><td>PBS (磷酸盐缓冲液)</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>青霉素&amp;ndash;链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 &amp;ndash; Glutamax I</td><td>Thermofisher</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>磺基琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮-2'-硝基苯氨基)己酸酯 (Sulfo-SANPAH)</td><td>Thermo Scientific</td><td>22589</td><td></td></tr></tbody></table>

用于研究b淋巴细胞活化的牵引力显微镜技术

Traction Force Microscopy to Study B Lymphocyte Activation

牵引力显微镜（TFM）可用于测量细胞在基底上产生的力。该技术通过实验观测细胞牵拉弹性基底所产生的位移场，进而推断出牵引力的大小。本文中，我们改进了TFM技术，用于研究B细胞在B细胞受体与抗原结合激活时所施加力场的空间和时间分布特征。为了研究相对较小的细胞（约6 µm），并使其特异性地与细胞表面受体的配体相互作用并产生响应，需对凝胶刚度、微球密度以及蛋白质功能化条件进行优化。

由于细胞尺寸较大，通过相关技术（如粒子图像测速法）提取微珠位移图的算法通常精度不高。然而，根据所需的分辨率程度，可使用免费的Fiji/ImageJ插件轻松获得定性结果31,32。尽管该方法足以比较刺激与非刺激条件下的差异，但对于更深入的分析，我们建议使用可从在线资源库下载的软件30，该软件可对每个微珠进行单独追踪，并通过插值个体微珠的位移，生成特定时间点的位移场图33。在此基础上可进行多种定量分析。例如（假设位移仅由垂直于凝胶表面的切向应力引起），该软件还可提供导致该特定位移图的各点应力分布。这属于一种“反演问题”：某一点的位移取决于所有其他点施加力的总和。该“反演算法”会考虑基底的物理参数：其刚度（杨氏模量）和泊松比。直接算法通常非常精确，但计算成本较高。基于傅里叶变换的算法（如我们的算法）本质上是在傅里叶空间中进行解卷积，效率更高，但可能引入一定误差（主要源于插值步骤）。这些算法通常需要调节一个参数，以防止局部微小（可能为假象）的位移在应力场计算中产生过大影响（即Tikhonov正则化参数8,29；在对话框中称为“Regularization”变量；此处通常设为5 × 10-19）。对于更高级的解释与分析，例如时空相关性、局部运动、与荧光通道的相关性分析，我们建议与该领域的专家合作。有关计算方法的综述，请参见Schwarz等人的文献9。
如上所述，正确的微珠图像应呈现“繁星夜空”状，即明亮斑点均匀且随机分布（图2A）。当微珠数量过少（图2B）或图像失焦时（图2C），数据及分析结果均不可靠。一旦B细胞沉降到凝胶表面，细胞对凝胶施加牵引力，导致细胞下方的微珠开始移动。对于微珠无法被追踪的图像帧，应予以剔除。
作为验证，可以通过肉眼观察珠子的运动，将其与“参考帧”进行比较，参考帧通常选择细胞与基底首次接触前的图像。可通过单颗粒追踪方法（例如 Trackmate，Fiji 34）获得近似结果，如图3A所示。该分析在参考图像（“FILENAME.fig”）中对珠子进行分割，作为对照。
利用我们提出的软件，可以获得位移场（图3B）和应力场（通过位移场反演得到的每个像素点在每个时间点的局部应力矢量，图3C）。将位移场与力场进行点乘，并在细胞区域上积分，可得到细胞对基底所做的总功（图4A）。该计算需要本实验方案第6.2步中引入的细胞掩膜。
为了比较两种生物学条件（例如激活HEL与非激活底物BSA，或野生型与基因敲除型），可以计算平均曲线（图4B），或更简洁地，计算能量达到平台期的最后时间点（20分钟）的平均值（图4C）。当力的空间信息具有重要意义时，可比较各条件下单个时间点的数据（图4D）。更深入的分析请参考Kumari等人的研究6。
荧光抗原提取时间延时的一个示例如图5A所示：突触处荧光信号的逐步出现表明抗原从凝胶上脱离。在15个细胞中测得的平均提取曲线及其置信区间（平均值的标准误）如图5B所示。
<img alt="水凝胶涂层方法；凝胶分层和抗原添加示意图；紫外光活化步骤；实验室装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60947/60947fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图1"> 
图1： 水凝胶制备及其功能化的示意图。各步骤在实验方案中有详细描述。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60947/60947fig1v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显微成像中微珠聚焦正确、微珠数量不足及焦平面错误的示例；对比示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60947/60947fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 2"> 
图2： 三种不同质量的微珠图像示例。 （A）信号噪声比和微珠密度均合适的微珠图像示例。 （B）微珠数量过少的图像示例，以及（C）焦平面偏离的图像示例。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60947/60947fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="珠粒追踪方法、位移与应力场示意图、纳米级可视化研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60947/60947fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="图 3"> 
图 3： 图像处理以提取力场。 （A）珠粒图像示例（细胞轮廓以白色标出，源自透射图像），在 t = 5 min 时的珠粒追踪结果（红色叠加）以及相对于 t = 0 min 时的位移（箭头表示，比例尺为 5 µm）。 （B）插值得到位移场（以矢量箭头图和幅值图表示，箭头长度与位移 [nm] 成正比；参见右侧颜色标尺）；下方：幅值的平滑图像（通过双三次函数插值得到）。 （C）由 B 图中的位移场计算得到的应力场（以矢量箭头图和幅值图表示，箭头长度与剪切应力 [Pa] 成正比；参见右侧颜色标尺）；下方：幅值的平滑图像（通过双三次函数插值得到）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60947/60947fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="应变能图，B细胞的应力分析。BSA、HEL包被效应的时间推移图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60947/60947fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 4"> 
图4：从力和位移场中提取信息的示例。（A）单个细胞随时间变化的能量演化示例：约10分钟后出现一个平台期（以灰色突出显示）。（B）在HEL（激活性）包被凝胶上培养的65个细胞与在BSA（非激活性）包被凝胶上培养的35个细胞的平均能量曲线比较，以及（C）其相对平台水平的比较（显示中位数±四分位距范围，统计学显著性采用Mann-Whitney检验）。（D）HEL和对照BSA条件下应力的时间推移彩色图谱；同时显示了应力大小和矢量图。这些图像改编自Kumari等人的研究6。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60947/60947fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="荧光HEL随时间的提取过程；图表显示相对增量；显微镜，延时分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60947/60947fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Figure 5"> 
图5：荧光抗原实验示例。 （A）荧光HEL提取过程的延时图像（下方：最大值的百分比，比例尺 = 3µm）。（B）抗原随时间聚集情况（均值 ± 标准误，n = 15）。这些图像改编自Kumari等人的研究6。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60947/60947fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种用于B细胞牵引力显微镜实验的方案。我们描述了软性聚丙烯酰胺凝胶的制备及其功能化方法，以及显微镜下的数据采集和数据分析的概要。

用于研究B淋巴细胞活化的牵引力显微镜技术

牵引力显微镜（Traction force microscopy, TFM）能够测量细胞在基底上产生的作用力。该技术通过推断细胞施加于基底上的形变来获取牵引力数据……

该方法可实现对B细胞在免疫突触处施加的力的空间-时间分布进行测量，并将其与特定蛋白质的募集相关联。使用聚丙烯酰胺凝胶进行牵引力显微镜检测易于实施。本方案可用于快速建立对大量B细胞机械能力的测量。该方法具有灵活性，可适用于绘制其他配体（如整合素）的图像，或用于研究其他类型的免疫突触，例如T细胞或受阻的吞噬作用。由于本实验所需的凝胶具有特定的物理和化学性质，将经典的牵引力显微镜技术应用于B细胞可能存在一定难度。首先对凝胶载体进行硅烷化处理。使用紫外灯对盖玻片或玻璃底培养皿活化两分钟，然后加入200微升APTMS处理五分钟，以使载体表面硅烷化，为凝胶的共价结合做好准备。随后用超纯水彻底清洗盖玻片或玻璃底培养皿，并通过真空抽吸干燥。为准备用于压平凝胶的盖玻片，将盖玻片放入陶瓷盖玻片架中，将架放入一个小烧杯内，倒入硅化试剂，确保完全覆盖盖玻片。用铝箔覆盖烧杯，在室温下静置三分钟。同时，用超纯水注满一个大烧杯。在硅化试剂中孵育3分钟后，将带有盖玻片的盖玻片架转移至盛有水的烧杯中。用超纯水彻底冲洗盖玻片。充分干燥后，将其放置在擦镜纸上。为获得最佳结果，应立即进行凝胶聚合。根据手稿说明制备500帕斯卡的凝胶预混液，然后将167微升预混液与1.67微升微珠混合。将混合物在水浴超声仪中涡旋并超声处理五分钟。用铝箔遮光以保护混合液。为促进聚合，在凝胶混合液中加入 1.67 µL 的 10% 过硫酸铵，然后加入 0.2 µL TEMED 并用移液器混匀，以启动聚合反应。浇注凝胶时，将 9 µL 凝胶混合液移取到每张硅化盖玻片或玻璃底培养皿上。立即用硅化盖玻片压平凝胶，并用镊子用力按压，确保凝胶铺满盖玻片的整个区域，并有部分溢出。将盖玻片或玻璃底培养皿倒置放入一个大的培养皿中，并轻敲实验台，使微珠向凝胶表面聚集。在培养皿内放置湿润的纸巾，以形成湿润的孵育环境。用铝箔覆盖，孵育一小时。孵育结束后，向样品中加入 PBS 以促进盖玻片脱落。用针小心移除盖玻片，轻微倾斜培养皿，但确保凝胶始终浸没在 PBS 中。硅化试剂、丙烯酰胺、碱性丙烯酰胺和 TEMED 通过吸入可能具有毒性。请佩戴标准个人防护装备，并在通风橱中操作这些试剂。从凝胶中吸除 PBS，然后在室温下加入 150 微升 Sulfo-SANPAH。将凝胶暴露于紫外线下处理两分钟，然后用 PBS 洗涤凝胶三次。重复使用 Sulfo-SANPAH 处理并用 PBS 洗涤三次，随后向凝胶中加入 250 µL 鸡蛋溶菌酶（hen egg lysozyme 或 HEL），在湿度 chamber 中，4 °C 条件下避光（铝箔覆盖）孵育过夜。孵育结束后，移除 HEL 抗原，并用 PBS 洗涤凝胶三次。最后，加入500微升B细胞培养基覆盖凝胶，并在室温下静置。使用带有温度和二氧化碳控制功能的共聚焦显微镜进行成像。吸除凝胶中的培养基，保留约200微升。将凝胶放置在显微镜上。在凝胶的底部和顶部会出现两层主要的微珠。聚焦于凝胶平面，并找到一个均匀的区域进行成像。仔细选择成像区域，并确保始终保持对焦。合适的微球密度和平整的表面是获得稳定且可靠力测量结果的关键。向凝胶中加入 80 微升来自 MD4 小鼠的初始 B 淋巴细胞，注意避免触碰凝胶以维持对焦状态。确保焦点仍然正确，并且可以在该区域观察到细胞下沉。在细胞到达凝胶之前启动采集。在 ImageJ 中将视频作为图像堆栈打开，然后运行宏 cropandsave.ijm。选择输出目录并配置属性通道设置。使用矩形工具选择感兴趣区域，并通过按 T 键将其添加到 ROI 列表中。完成后，单击“确定”。当宏生成细胞的掩膜时，如果结果满意，则单击“确定”。若结果不理想，请点击“不 OK”，然后使用任意选择工具手动选择一个闭合区域，再点击继续。打开 MATLAB 并运行 tfmv1.m，输入所需参数。具体而言，需检查图像属性，例如像素大小和采集时间间隔，以及凝胶属性，例如杨氏模量 E 和泊松比。完成后，在原始文件所在的同一目录中查找软件输出结果。校正后的微珠图像应呈现均匀且随机分布的亮点，类似于繁星密布的夜空。当微珠数量过少或图像失焦时，数据和分析结果不可靠。可通过使用细胞与基底首次接触之前的参考帧，目视观察微珠的运动。单颗粒追踪可获得近似结果。该分析提供了参考图像中微珠的分割结果，作为对照。通过软件，还可以获得位移场和应力场，即每个像素点和每个时间点的局部应力矢量。将位移场与力场进行点积，并在细胞面积上积分，可得到细胞对基底所做的总功。在比较两种生物学条件时，可计算能量达到平台期时最后几个时间点的平均曲线或平均值。当力的空间信息具有重要意义时，也可比较每种条件下的单个时间点。此处展示了一个荧光抗原提取的时间序列示例。突触处荧光信号的逐渐出现表明抗原从凝胶上解离。荧光数据可用于构建平均提取曲线。该实验方案中最关键的步骤是在盖玻片下进行凝胶的聚合。此步骤必须快速且小心地进行，确保凝胶在盖玻片下被均匀挤压。完成该操作后，可利用表达荧光蛋白的B淋巴细胞同时评估细胞内结构的定位和力的分布模式。该技术可与基因或化学干扰方法结合使用，以研究特定蛋白质在细胞收缩性和抗原摄取中的作用。

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