在小鼠中进行结肠镜引导下的钳取活检及后续组织变化评估

该方法为研究结肠损伤修复以及损伤后发生的分子和组织学变化提供了理想途径。该方法还可揭示炎症性肠病（IBD）的发病机制。该技术的主要优势在于能够精确定位损伤部位，并准确控制伤口愈合的时间进程。

初次操作该方法的研究人员可能在将结肠镜插入小鼠结肠以及制造一致的伤口方面存在困难。通过反复练习这些技术可克服上述问题。由于该操作涉及多个协调步骤且技术细节较多，对该方法进行可视化演示至关重要。

开始操作前，将一根1.9毫米刚性内径内窥镜插入内窥镜套管中，并根据制造商的说明将组装好的内窥镜连接至光源和视频成像设备。使用提供的管路将空气泵连接至套管左侧工作通道旁边的气体阀门。

确保工作通道处于打开位置，将三法式活检钳经工作通道插入，推进至鞘管末端，但不伸出鞘管外。随后，将麻醉后的小鼠腹侧朝下置于内镜观察平台上，通过脚掌反射无反应确认其镇静程度适当。

涂抹眼药膏后，用连接大鼠灌胃针头的3毫升注射器吸取室温PBS，将针头插入小鼠肛门约1厘米深处，轻柔注入PBS，直至清除粪便物质。

应有数粒粪便颗粒随注入的 PBS 一同从小鼠体内排出。将组装好的内窥镜插入肛门 0.5 厘米，然后将活检钳推进至直肠已清理的管腔内，直至钳头完全伸出鞘管末端。将活检钳旋转 90 度，使钳口呈东西方向打开，张开钳尖并向前推进约一厘米，然后以平稳、快速的动作闭合并回撤活检钳，以获取活检组织。

进行活检时，为避免结肠完全充气，应使气体阀门的右侧保持开放。活检完成后，立即踩下连接至结肠镜记录装置的脚踏板，以启动视频录制。随后，用食指紧压气体阀门右侧，完全覆盖其开口，迫使气体进入内镜并流入结肠。

在保持闭合状态下，将镊子从鞘管中向后撤出，回到直肠腔内。将镊子紧贴伤口上方的直肠壁，直至镊子基部与视野顶端边缘对齐。持续充分注气扩张结肠，直至能够清晰观察到伤口。

为了获得最佳的创面床测量效果，需耐心操作，将结肠镜置于精确的角度，以获取创面床最清晰的图像。在合适的软件程序中打开视频，并将视频前进至能够清晰观察到创面床的某一帧画面，此时闭合的活检钳应位于创面床上方并与直肠壁接触，且肠壁处于紧绷状态。

在每个时间点，获取该帧的快照，并对文件名进行编码，以确保创面床面积的测量以盲法方式进行。为量化创面床的大小，在 ImageJ 中打开图像，使用“自由手选择”工具在创面周围绘制轮廓。在“分析”菜单中，选择“测量”。

该测量值将自动填入结果窗口中。当所有测量完成后，在电子表格中计算后续各天伤口大小相对于第0天大小的变化。在适当的实验终点，切开皮肤和腹肌层以暴露实验动物的体腔，并将闭合的镊子置于结肠下方。

轻轻提起结肠，使其与下方的肠系膜分离，然后在结肠中点及肛门处剪断组织，以从小鼠体内取出结肠。使用装有冰冻 PBS 的 20 毫升注射器（配备大鼠灌胃针）冲洗出粪便内容物。将清洗后的结肠置于一片滤纸上。

纵向切开结肠，注意将肠系膜侧朝下紧贴滤纸。使用巴斯德移液管将0.2%亚甲蓝覆盖于黏膜表面。数秒后，吸去多余的染色液，在解剖显微镜下观察结肠，以确定创面区域。

使用四英寸微型虹膜剪在床缘周围进行剪切，注意不要剪入肌肉层。用尖头镊子将解剖得到的组织转移至离心管中，用于速冻和/或储存。在适当的实验终点，将获取的结肠沿滤纸纵向剖开，系膜面朝下。

用您选择的固定剂轻轻覆盖组织。将组织用封口膜覆盖后置于密封容器中，在70%乙醇中保存前固定4至6小时。在处理当天，移除封口膜，并向组织中加入0.2%亚甲蓝，操作如图所示。

吸去多余的染液后，将组织置于解剖显微镜下以定位伤口床。使用带有10号刀片的手术刀，直接从伤口床中心切开，并沿直线继续切开结肠其余部分，使结肠沿长轴被纵向剖成两半。进行冷冻切片时，将结肠组织块包埋，使手术刀切割的一面朝下，置于已盛有半满组织冷冻介质的底模中。

用精细镊子将组织固定到位，并将底模置于干冰上的金属板或厚铝箔上，以使包埋介质冻结硬化。待介质底部冻结后，用室温的包埋介质填充底模剩余空间，并将模具重新放回干冰中，直至整个组织块完全冻结。

然后，将模具转移至80摄氏度的冷冻机中，直至进行切片。此处展示了可用于准确量化创面床大小及创面闭合率的可接受视野的代表性图像。在此创面床的离体观中，可观察到创面床边缘的指示标记以及为便于切片后观察创面床而进行组织切割的位置。

在此代表性图像中，可清晰观察到伤口床的苏木精和伊红（H&E）染色切片。在所有时间点实时获取伤口床图像至关重要，以确保对伤口愈合速率进行准确评估。在进行钳取活检后，可将不同感兴趣的试剂注射到伤口床中，以检测其对伤口愈合速率的影响。