Name: 在小鼠中进行结肠镜引导捏活检并评估后续组织变化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 学习结肠镜引导捏活检技术用于小鼠结肠伤口愈合研究。该方法可精确控制损伤位置和愈合时间，实时追踪伤口闭合过程，为炎症性肠病发病机制研究提供重要实验手段。

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本研究得到了克罗恩病和结肠炎基金会（D.C.M.）以及纽约克罗恩病基金会（D.C.M. 和 A.J.D.）资助。&#160;作者感谢卡门·费拉拉女士（Ms. Carmen Ferrara）协助制作本文的视频配套资料。

本研究所述所有操作程序均经威尔康奈尔医学院机构动物照护与使用委员会批准。” 更新为：“本研究所述所有操作程序均经威尔康奈尔医学院和石溪大学机构动物照护与使用委员会批准。
1. 结肠镜检查与伤口诱导
<ol>
	<li>预先组装内窥镜的各个部件，首先将1.9 mm刚性内窥镜插入鞘管中（图1A-B）。使用提供的管路将气泵（用于提供结肠充气）连接至鞘管左侧工作通道旁的气体阀图1C). 
	注意：尽管此处描述的镜头为0°，但也可使用30°镜头完成此操作。</li>
	<li>确保工作通道处于打开状态，将3 Fr活检钳经工作通道插入，并向前推进至鞘管末端（同时确保其不伸出鞘管外）图1C）。根据制造商的说明，将组装好的内窥镜连接至光源和视频成像设备。</li>
	<li>&#160;在诱导室中使用5%异氟烷与氧气对小鼠进行麻醉。随后将小鼠转移至带有加热系统（防止低体温）的内镜检查平台，仰卧位固定，并通过鼻罩以2%异氟烷与氧气维持麻醉状态。在小鼠眼睛处涂抹兽医用眼膏，防止麻醉期间角膜干燥。通过轻捏后肢足部检测反射，确认小鼠已完全麻醉。 
	注：任何品系或任一性别&#160;小鼠可采用此技术；然而，建议小鼠至少为8周龄，以便体型足够大，适合进行该操作。
	<ol>
		<li>麻醉期间在眼部涂抹眼膏以防止干燥。</li>
		<li>通过轻轻捏压小鼠后肢足部以检测反射，确保小鼠已完全麻醉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用3 mL注射器吸取室温磷酸盐缓冲液（PBS），注射器前端连接大鼠灌胃针。将针头轻轻插入小鼠肛门约1 cm，缓慢注入PBS以清除粪便物质。注入的PBS应带动数粒粪便一同排出小鼠体外。 
	注意：注入过量 PBS 可能导致管腔内形成泡沫，从而影响管腔观察。</li>
	<li>将组装好的内窥镜插入小鼠肛门内0.5 cm处。推进活检钳进入直肠腔，直至钳子的整个“钳口”（包括铰链部位）完全超出鞘管末端（通过视频监视器观察确认）。补充视频 1）。将镊子旋转90°，使镊尖朝向东-西方向打开（补充视频 1).</li>
	<li>进行活检时，打开活检钳并向前推进约1 cm，闭合活检钳，然后在保持闭合状态下，快速平稳地向后回拉活检钳补充视频 1).
	<ol>
		<li>进行活检时应避免过度充气扩张结肠。因此，此步骤中应保持气体阀门右侧开放；但需注意，当钳子打开时，若结肠处于此状态，存在损伤黏膜的风险。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 观察并测量创面床
<ol>
	<li>活检后立即踩下结肠镜记录设备上的脚踏板，开始视频录制。通过用食指用力按压气体阀门右侧，完全覆盖开口，将气体强制送入内窥镜，进而充入结肠，实现结肠充分充气。 
	注意：尽管本方案描述的是使用手动控制气流的气泵，也可使用带有可控气源的蠕动泵。</li>
	<li>在保持活检钳闭合状态下，将其从鞘管中向后退出并进入直肠腔内（补充视频 1）。将活检钳置于伤口正上方的直肠壁处，直至钳头基部与视野顶部边缘对齐（图 2 &amp;#38; 补充视频 1）。持续充分充气，直至能够清晰观察到伤口。 
	注意：为确保每次检查小鼠时内窥镜镜头与病灶之间距离一致，应小心地将活检钳伸出足够长度，仅使钳头部分（至基部）可见&#160;（图 2，白色箭头）。</li>
	<li>若在同一天对多只小鼠进行活检，在对下一只小鼠造伤前，需使用提供的清洁刷将前一只小鼠的活检组织从活检钳上清除，并用70%乙醇擦拭镜头鞘管以清洁。 
	注意：尽管本方案描述的是每只小鼠仅进行一次活检，但只要在每次活检后及时清除活检钳上的组织，即可在同一小鼠上进行多次活检，以确保后续活检取样完整。</li>
	<li>操作完成后，将小鼠放入无其他小鼠的笼子中，并置于毛巾上以保持呼吸道通畅，直至其从麻醉中恢复。需监测小鼠，确保其恢复活动能力，表明已从麻醉中苏醒。 
	注意：在第0天诱导伤口并观察创面时需要两人配合（一人操作内窥镜，另一人操作活检钳）；但在后续各天观察伤口时仅需一人即可（如下所述）。</li>
	<li>在后续时间点进行伤口测量时（通常&#160;为活检后第2、4、6天），按照上述1.1–1.4节所述方法对小鼠和结肠镜检查进行相同准备，但无需再次诱导伤口。</li>
	<li>插入内窥镜后，在视频监视器上定位创面，并将处于闭合状态的活检钳推进至创面正上方，充气扩张结肠并开始视频录制，具体操作如2.1和2.2节所述（图 2）。 
	注意：活检6天后可能较难定位创面。</li>
	<li>在后续各天推进活检钳进入肠腔的距离应与第0天相同，以确保内窥镜镜头与病灶之间的距离在不同时间点保持一致。保持镜头与病灶间距离的一致性将提高随时间变化的测量准确性。 
	注意：在这些时间点的测量可由一人独立完成（右手操作内窥镜，左手推进活检钳）。</li>
	<li>所有测量完成后，在支持从视频生成静态图像的视频编辑软件中打开系列结肠镜视频文件。</li>
	<li>将视频推进至一个可清晰观察创面、闭合的活检钳位于创面上方并与直肠壁接触、且肠壁紧绷的帧画面。截取该帧图像，并对文件名进行编码，以确保后续创面测量在盲法条件下进行。</li>
	<li>使用NIH ImageJ软件打开带有编码文件名的图像，以量化创面大小。在分析选项卡下，选择设置测量值，并勾选面积选项。
	<ol>
		<li>从主菜单栏选择自由选择工具，围绕创面绘制边界（见图 2）。在分析选项卡下选择测量，测量值将自动显示在结果窗口中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>完成所有图像测量后，在结果窗口中点击文件选项卡下的另存为，将文件扩展名更改为电子表格格式，导出结果。</li>
	<li>在电子表格中计算伤口诱导后各时间点（即第2、4、6天）创面大小相对于第0天（造伤后立即测量）的百分比。具体方法为：将每一天的创面大小除以第0天的大小，并将结果转换为百分比。 
	注意：在正常条件下使用该结肠镜观察方法时，创面闭合最显著发生在前2天内（大小减少约75%），第4天和第6天闭合速度逐渐减缓（大小分别减少约80%和约95%）。</li>
</ol>
3. 用于分子分析的伤口床采集
<ol>
	<li>在活检后的选定日期，采用 CO2 窒息法对小鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱位（或等效技术）。</li>
	<li>切开皮肤和腹肌以暴露体腔，取出结肠远端。将闭合的剪刀置于结肠下方，轻轻提起以分离其下方的肠系膜，然后在结肠中点及肛门处剪断，将结肠从鼠体中移除。</li>
	<li>使用连接20 mL注射器的鼠用灌胃针，以预冷的1×PBS冲洗肠腔内容物，随后将结肠平铺于滤纸上。</li>
	<li>在滤纸上沿纵轴剪开结肠，确保肠系膜面朝下紧贴滤纸。当组织仍在滤纸上时，用压滴管将0.2%亚甲蓝溶液滴加至黏膜表面，随后去除多余染液。在解剖显微镜下观察结肠，定位伤口床（图3A）。</li>
	<li>使用4英寸微型虹膜剪，在伤口床边缘周围进行剪切（图3A，虚线圆圈），注意避免切透肌层（除非需要保留肌层），然后用精细镊子将分离的伤口床转移至管中，进行速冻或按所需方式储存。 
	注意：以此方法获取的组织量足以用于提取RNA，进行RNA-seq或等效分析。</li>
</ol>
4. 组织样品的制备以用于组织学分析
<ol>
	<li>处死小鼠，并按照步骤 3.1–3.2 所述方法取材结肠。</li>
	<li>将结肠沿纵轴在滤纸上剪开，确保肠系膜面朝下紧贴滤纸。使用压头滴管轻轻滴加 4% 多聚甲醛（或其他选择的固定剂），并用封口膜覆盖组织。将滤纸平放于密封容器中，固定 4–6 小时。</li>
	<li>将组织转移至 70% 乙醇中保存。当准备处理组织时，移除封口膜，并在滤纸上的组织黏膜面使用压头滴管滴加 0.2% 亚甲蓝溶液，随后吸除多余的亚甲蓝。</li>
	<li>在解剖显微镜下观察结肠，定位伤口床（图 3A）。使用带有 #10 刀片的手术刀，直接穿过伤口床中心进行切割，并沿直线继续切开结肠其余部分，使结肠沿长轴被完全切成两半（图 3A，黑色线条）。</li>
	<li>对结肠组织进行处理后进行石蜡包埋（可选择切割后保留的一侧或两侧组织），确保手术刀切割的一侧（即分割前伤口床的中心侧）朝下置于石蜡中。随后进行切片，并根据需要进行相应的染色。</li>
	<li>若特定染色需要冰冻切片，请按照步骤 3.1 所述方法取材结肠，并在滤纸上沿纵轴剪开，确保肠系膜面朝下紧贴滤纸。</li>
	<li>在新鲜取材的结肠中，按照步骤 4.5 所述方法将伤口床一分为二，并将结肠组织（可选择切割后保留的一侧或两侧）包埋，确保手术刀切割的一侧朝下，置于已半充满组织冷冻介质的底模中。</li>
	<li>用精细镊子固定组织，将底模放置于干冰上的金属板上，使冷冻介质硬化。当介质底部冻结（且组织已固定到位）后，松开镊子，向底模剩余空间加满冷冻介质，再放回干冰上。
	<ol>
		<li>待整个冷冻介质体积完全冻结后，转移至 -80 °C 超低温冰箱中保存，直至切片。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对于石蜡切片或冰冻切片，在进行特异性染色前，应额外切片并进行 H&E 染色，以确认切片中已包含伤口床。图 3B 展示了一个可清晰观察到伤口床的切片示例。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在该模型中，为了有效评估伤口闭合速率，确保活检的一致性和准确性以及伤口尺寸测量的精确性至关重要。因此，应采取多项措施以确保操作正确实施。首先，活检的深度既不能过浅也不能过深。若过浅，则无法提供足够的观察窗口来评估伤口闭合情况。图2展示了第0天理想的活检深度和大小。请注意伤口床周围黏膜与伤口床下方残留组织之间的清晰界限（图2）。若活检过深，则可能发生穿孔，导致小鼠无法用于评估。在第0天活检后进行充气时，若小鼠腹部明显膨胀，则表明已发生穿孔，该小鼠不应继续用于实验，应实施安乐死。为提高一致性，建议由同一操作人员完成同一研究中的所有活检操作。其次，必须确保活检部位位于直肠内，而非更近端的结肠区域。由于直肠壁比结肠近端区域更厚，因此在此处操作可显著降低穿孔风险。应在鞘管外侧距末端0.5 cm处做一标记，并仅将内窥镜插入至该标记处，以确保活检钳不会超出直肠范围。第三，在活检过程中以及观察伤口床时，维持适当的充气量至关重要。活检期间，若结肠过度膨胀，则肠壁会过于紧张，导致可用于取样的黏膜不足。因此，建议操作内窥镜者不要将食指压在气...

胃肠道（GI）是一个复杂的器官系统&#160;，因其具有多种功能、多种宿主细胞类型（例如上皮细胞、免疫细胞、基质细胞等）以及数以万亿计的微生物。鉴于其复杂性，胃肠道疾病通常涉及上述所有因素之间的相互作用。例如，炎症性肠病（IBD）与胃肠道内炎症与缓解周期相关，涉及炎性细胞的活化、菌群失调以及上皮修复1,2,3,4,5,6,7。建立合适的模型系统以研究IBD及其他胃肠道炎症性疾病，对于阐明疾病的发病机制至关重要。目前已有多种模型用于研究IBD的发病机制，包括基因工程小鼠以及在啮齿类动物中使用葡聚糖硫酸钠（DSS）等化学物质8,9,10。这些模型的局限性包括难以精确控制炎症的诱导过程，以及在评估伤口愈合方面存在困难。因此，开发能够模拟IBD发病机制某些方面的替代方法，可能有助于新疗法的研发。
小鼠结肠镜引导下的钳取活检为研究结肠中炎症反应的发病机制、伤口愈合以及宿主与微生物的相互作用提供了一个有用的模型系统。该方法最早于2009年作为实验工具被使用，证明了其在研究肠道急性炎症反应和伤口愈合中的实用性11。随后的研究利用该技术评估了不同信号通路以及肠道微生物群在结肠伤口愈合中的作用11,12,13,14,15,16,17,18。最近，我们课题组利用该模型研究了鞘氨醇-1-磷酸信号通路和细菌在结肠损伤急性反应中的重要性19。尽管该方法具有实用性，但在小鼠中实施结肠镜引导下的钳取活检并评估后续组织变化在技术上仍具挑战性。例如，诱导损伤时可能发生肠穿孔，且通过连续结肠镜检查对创面床进行一致测量较为困难。此外，正确地定向结肠组织以在组织学或免疫组织化学分析中清晰观察创面床也存在挑战。尽管目前已有一些关于这些方法的信息18,20，但提供配有视觉辅助的精确分步操作说明，有望提高该模型的可靠性和广泛应用性。本文中，我们详细介绍了一种在小鼠中实施结肠镜引导下钳取活检的方法，可随时间追踪伤口闭合情况，并制备组织以进行创面床的组织学和分子分析。建立标准化的操作流程，有助于扩展该模型的应用，以研究此前尚未被探索但可能在胃肠道炎症和伤口修复中具有重要作用的介质。

<table><tbody><tr><td>活检钳，3 Fr</td><td>Karl Storz</td><td>61071ZJ</td><td></td></tr><tr><td>Coloview 塔式系统</td><td>Karl Storz</td><td>contact company</td><td></td></tr><tr><td>检查鞘，9 Fr，套件</td><td>Karl Storz</td><td>61029DK</td><td></td></tr><tr><td>Hopkins 望远镜，0'，1.9 mm × 10 cm</td><td>Karl Storz</td><td>64301AA</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Covetrus</td><td>2905</td><td></td></tr><tr><td>亚甲蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>微型虹膜剪刀</td><td>Integra</td><td>18-1619</td><td></td></tr><tr><td>NIH ImageJ</td><td>NIH</td><td>N/A</td><td>可从以下网址免费下载的软件：https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr><tr><td>Pawfly MA-60 水族泵</td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>带 #10 刀片的手术刀</td><td>Hill-Rom</td><td>372610</td><td></td></tr></tbody></table>

在小鼠中进行结肠镜引导下的钳取活检及后续组织变化评估

Performing Colonoscopic-Guided Pinch Biopsies in Mice and Evaluating Subsequent Tissue Changes

研究胃肠道（GI）系统疾病时，了解急性损伤反应以及伤口愈合过程中发生的组织和细胞变化至关重要。小鼠结肠钳夹活检模型是定义这些过程的有效工具，此外还可用于研究肠道腔内容物（如微生物）与结肠之间的相互作用。然而，伤口的诱导以及以可靠方式随时间追踪伤口闭合情况可能具有挑战性。而且，为了充分分析组织学和分子层面的变化，组织制备和定向必须以标准化的方式进行。本文介绍了一种详细的方法，通过重复结肠镜检查来描述活检诱导的损伤及伤口闭合的监测。该方法可确保对伤口大小进行一致且可重复的测量，能够采集伤口床组织用于分子分析，并在组织切片后实现对伤口床的可视化观察。成功实施这些技术，有助于开展针对结肠内急性损伤反应、伤口愈合以及腔内-宿主相互作用的研究。

进行活检所需的微小器械（镜头、套管、活检钳）如图1所示，并附有这些组件正确组装的指示。 图2展示了伤口床可接受视野的代表性图像，用于准确量化伤口床的大小及伤口闭合速率。 图3A显示了伤口床离体观察的示例图像，包括伤口床周界的标记（指示用于分子分析的组织切除区域）以及组织切开位置的指示，以便在切片后能够清晰观察伤口床。 图3B展示了一张典型的苏木精-伊红（H&amp;E）染色切片图像，其中可清晰观察到伤口床。 补充视频1提供了从小鼠结肠内部观察活检过程的视角。
<img alt="腹腔镜器械的设置与组装，显示套管针、套管和光纤电缆的插入。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60949/60949fig01...

本文详细描述了在小鼠中进行结肠镜引导下钳取活检并实时追踪伤口闭合过程的操作步骤。此外，还提供了用于对伤口床进行组织学、免疫组织化学及分子学分析的组织制备方法。

了解急性损伤反应以及伤口愈合过程中发生的组织和细胞变化至关重要……

该方法为研究结肠损伤修复以及损伤后发生的分子和组织学变化提供了理想途径。该方法还可揭示炎症性肠病（IBD）的发病机制。该技术的主要优势在于能够精确定位损伤部位，并准确控制伤口愈合的时间进程。初次操作该方法的研究人员可能在将结肠镜插入小鼠结肠以及制造一致的伤口方面存在困难。通过反复练习这些技术可克服上述问题。由于该操作涉及多个协调步骤且技术细节较多，对该方法进行可视化演示至关重要。开始操作前，将一根1.9毫米刚性内径内窥镜插入内窥镜套管中，并根据制造商的说明将组装好的内窥镜连接至光源和视频成像设备。使用提供的管路将空气泵连接至套管左侧工作通道旁边的气体阀门。确保工作通道处于打开位置，将三法式活检钳经工作通道插入，推进至鞘管末端，但不伸出鞘管外。随后，将麻醉后的小鼠腹侧朝下置于内镜观察平台上，通过脚掌反射无反应确认其镇静程度适当。涂抹眼药膏后，用连接大鼠灌胃针头的3毫升注射器吸取室温PBS，将针头插入小鼠肛门约1厘米深处，轻柔注入PBS，直至清除粪便物质。应有数粒粪便颗粒随注入的 PBS 一同从小鼠体内排出。将组装好的内窥镜插入肛门 0.5 厘米，然后将活检钳推进至直肠已清理的管腔内，直至钳头完全伸出鞘管末端。将活检钳旋转 90 度，使钳口呈东西方向打开，张开钳尖并向前推进约一厘米，然后以平稳、快速的动作闭合并回撤活检钳，以获取活检组织。进行活检时，为避免结肠完全充气，应使气体阀门的右侧保持开放。活检完成后，立即踩下连接至结肠镜记录装置的脚踏板，以启动视频录制。随后，用食指紧压气体阀门右侧，完全覆盖其开口，迫使气体进入内镜并流入结肠。在保持闭合状态下，将镊子从鞘管中向后撤出，回到直肠腔内。将镊子紧贴伤口上方的直肠壁，直至镊子基部与视野顶端边缘对齐。持续充分注气扩张结肠，直至能够清晰观察到伤口。为了获得最佳的创面床测量效果，需耐心操作，将结肠镜置于精确的角度，以获取创面床最清晰的图像。在合适的软件程序中打开视频，并将视频前进至能够清晰观察到创面床的某一帧画面，此时闭合的活检钳应位于创面床上方并与直肠壁接触，且肠壁处于紧绷状态。在每个时间点，获取该帧的快照，并对文件名进行编码，以确保创面床面积的测量以盲法方式进行。为量化创面床的大小，在 ImageJ 中打开图像，使用“自由手选择”工具在创面周围绘制轮廓。在“分析”菜单中，选择“测量”。该测量值将自动填入结果窗口中。当所有测量完成后，在电子表格中计算后续各天伤口大小相对于第0天大小的变化。在适当的实验终点，切开皮肤和腹肌层以暴露实验动物的体腔，并将闭合的镊子置于结肠下方。轻轻提起结肠，使其与下方的肠系膜分离，然后在结肠中点及肛门处剪断组织，以从小鼠体内取出结肠。使用装有冰冻 PBS 的 20 毫升注射器（配备大鼠灌胃针）冲洗出粪便内容物。将清洗后的结肠置于一片滤纸上。纵向切开结肠，注意将肠系膜侧朝下紧贴滤纸。使用巴斯德移液管将0.2%亚甲蓝覆盖于黏膜表面。数秒后，吸去多余的染色液，在解剖显微镜下观察结肠，以确定创面区域。使用四英寸微型虹膜剪在床缘周围进行剪切，注意不要剪入肌肉层。用尖头镊子将解剖得到的组织转移至离心管中，用于速冻和/或储存。在适当的实验终点，将获取的结肠沿滤纸纵向剖开，系膜面朝下。用您选择的固定剂轻轻覆盖组织。将组织用封口膜覆盖后置于密封容器中，在70%乙醇中保存前固定4至6小时。在处理当天，移除封口膜，并向组织中加入0.2%亚甲蓝，操作如图所示。吸去多余的染液后，将组织置于解剖显微镜下以定位伤口床。使用带有10号刀片的手术刀，直接从伤口床中心切开，并沿直线继续切开结肠其余部分，使结肠沿长轴被纵向剖成两半。进行冷冻切片时，将结肠组织块包埋，使手术刀切割的一面朝下，置于已盛有半满组织冷冻介质的底模中。用精细镊子将组织固定到位，并将底模置于干冰上的金属板或厚铝箔上，以使包埋介质冻结硬化。待介质底部冻结后，用室温的包埋介质填充底模剩余空间，并将模具重新放回干冰中，直至整个组织块完全冻结。然后，将模具转移至80摄氏度的冷冻机中，直至进行切片。此处展示了可用于准确量化创面床大小及创面闭合率的可接受视野的代表性图像。在此创面床的离体观中，可观察到创面床边缘的指示标记以及为便于切片后观察创面床而进行组织切割的位置。在此代表性图像中，可清晰观察到伤口床的苏木精和伊红（H&E）染色切片。在所有时间点实时获取伤口床图像至关重要，以确保对伤口愈合速率进行准确评估。在进行钳取活检后，可将不同感兴趣的试剂注射到伤口床中，以检测其对伤口愈合速率的影响。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

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