用于活细胞超分辨率显微镜和单分子跟踪的传统 BODIPY 结合物

我们的协议描述了使用传统的BODIPY染料使用其稀疏的红移状态进行超分辨率显微镜。这使我们能够研究活细胞中具有30纳米分辨率的细胞和生物分子。这种方法的优点在于其简单性和不同可用的BODIPY结合的多功能性，提供了单分子信号的持久源。

通过解决脂质液滴和脂肪酸低于衍射极限，我们证明的应用对于在脂肪肝疾病或2型糖尿病等疾病中获得见解变得非常重要。我们在酵母和哺乳动物细胞的脂肪酸和脂滴生物学方面获得了深入的见解。然而，该技术适用于所有其他具有低背景荧光的透明细胞类型。

首次使用技术时，请确保优化二浓度和激光功率，以观察明亮的单分子信号。这种技术的视觉演示对于了解激光功率的二浓度和优化如何产生明亮的单分子信号非常重要。在非荧光DMBM中保持哺乳动物U2OS细胞，用10%的胎儿牛血清4毫摩尔谷氨酰胺、1毫摩尔丙酮钠和1%青霉素链霉素抗生素在T-25烧瓶中。

将细胞在70至80%的汇合下分裂为1至5，并在8个井板的单井中移液器。改变八井板中的细胞12至24小时。成像前十分钟，添加一个BODIPY-C12 Lysotracker绿色或其他BODIPY结合物，添加100纳米摩尔的最终浓度。

根据使用的 BODIPY 的发射颜色在发射路径中安装相应的滤波器集。打开显微镜。显微镜级、488 纳米和 561 纳米激光器以及相机。

在显微镜目标上添加一滴新兴油。打开 HAL4000 软件，该软件可控制 LED 灯，用于用于明亮场成像、激光电源、激光百叶窗和相机设置的成像功能。将 EMCCD 增益设置为 30，将摄像机温度设置为零下 68 摄氏度。

准备相机和相应的软件，以20赫兹录制电影。打开显微镜舞台加热器，将其设置为 37 摄氏度的温度和 5% 的二氧化碳水平。相应地调整目标校正颜色。

将样品安装在显微镜阶段并对焦，直到对焦系统接合。使用舞台控制器移动舞台，直到视图字段中出现健康的单元格。加载激光快门序列，用于激发一元和调光器，其中561纳米激光的激光功率为每平方厘米821千瓦，用于单个分子定位显微镜，因此，在红移发射通道中检测到单分子荧光孔。

调整488纳米激光每平方厘米点035和点07瓦之间的激光功率，使常规荧光出现在绿色发射通道中。选择电影的目标文件夹并录制 5000 到 20000 个采集帧，以收集足够的本地化以重建超分辨率图像。移动到不同的视图区域并重复以收集更多单元格的数据。

将影片加载到单个分子定位显微镜分析软件中。目视电影并调整对比度设置，以便可见单分子荧光闪烁。设置单分子识别参数，用于拟合 2D 高斯、PSF。

目视筛选通过一些示例帧来检查识别参数，并可靠地检测出不同的单分子荧光爆发。按压分析，执行单分子定位显微镜想象分析与优化的识别参数。然后，将每个单个分子渲染为 2D 高斯分子，其宽度由检测到的光子数的反向平方根加权。

评估数据的质量。使用受限帧范围观察单个分子在更具体实例和时间分布。这就占了数据采集过程中细胞器运动的影响。

在这项研究中，我们提出了一个优化的样品制备，数据采集和分析程序与单分子定位显微镜使用BODIPY结合。为了演示获取和分析单分子定位显微镜数据的工作流程示例，利用酵母中的BODIPY来解析低于光学衍射极限的脂质液滴。此处显示了BODIPY与其他探头（如GGFP和mEos2）结合的不同多色成像模式的示例。

BODIPY-C12在细胞外围的移动非脂质液滴群中形成，与在进给条件下将其并入脂液滴形成鲜明对比。为了进一步将BODIPY结合的单分子定位显微镜功能扩展到哺乳动物细胞，对活U2OS细胞中的BODIPY-C12和Lysotracker绿色进行了成像。优化BODIPY浓度以及刺激激光功率是可视化明亮的单分子信号和重建超分辨率图像的关键步骤。

该方法可与任何其他BODIPY结合物一起使用，在活细胞内特定生物分子的特殊时间分布中获得高分辨率洞察力。我们的技术铺平了道路，进一步询问脂质液滴和脂肪酸生物学的纳米透镜规模。然而，由于各种功能BODIPY结合的可用性，此应用程序远远超出了特定的哲学。

请务必遵循处理生物样品和染料的标准操作程序，同时遵守激光安全程序。