Name: 用于活细胞超分辨率显微镜和单分子跟踪的传统 BODIPY 结合物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 了解利用传统BODIPY染料进行活细胞超分辨率显微镜和单分子追踪的方法。该技术可在哺乳动物和酵母细胞中以30纳米分辨率实时追踪脂滴和脂肪酸，为研究代谢疾病提供重要工具。

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本出版物中报告的研究由美国国立卫生研究院下属的国家普通医学科学研究所资助，资助编号为 R21GM127965。

注意：有关酵母克隆和内源性标记，请参见我们最近的出版物10。
1. 成像用酵母细胞样品的制备
<ol>
	<li>准备一管液体培养的w303酵母菌株过夜培养物。使用无菌木棒，从含有酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖的琼脂平板上取少量酵母细胞，接种至含有约2 mL合成完全葡萄糖（SCD）培养基的培养管中。将培养管置于摇床培养箱中，在30 °C、270 rpm条件下孵育过夜。</li>
	<li>将过夜培养的细胞用SCD培养基按1:50比例稀释。继续在30 °C、270 rpm摇床培养箱中培养稀释后的细胞4小时，使其处于对数生长期，并达到约0.6的光密度（OD）。 
	注意：此步骤可根据所研究的代谢状态进行调整。BODIPY偶联物并不要求细胞必须处于对数生长期。然而，需注意静止期死细胞可能产生的自发荧光，因其可能导致背景信号过强，从而无法分析单个BODIPY-DII发射体。</li>
	<li>若需研究饥饿状态的细胞，将酵母培养物在不更换培养基的情况下继续培养2天。</li>
	<li>在铺板前约30分钟，将带腔室的盖玻片与80 µL浓度为0.8 mg/mL的无菌刀豆球蛋白A（ConA）溶于去离子H2O中，在室温下孵育。30分钟后，用去离子H2O清洗盖玻片三次。</li>
	<li>在成像前约30分钟，将细胞悬液转移至带腔室的盖玻片中，并加入适量新鲜SCD培养基，使最终光密度达到约0.12（通常为60 µL光密度约0.6的酵母培养物加入240 µL SCD中）。让细胞沉降并黏附于ConA处理的表面，持续30分钟。</li>
	<li>将所需BODIPY偶联物直接加入带腔室的盖玻片中，终浓度约为100 nM。 
	注意：由于不同细胞区室中BODIPY的局部密度可能存在差异，可能需要进行BODIPY浓度优化实验。</li>
</ol>
2. 用于SMLM成像的哺乳动物细胞制备
<ol>
	<li>在T25培养瓶中，使用含10%胎牛血清、4 mM谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠和1%青霉素-链霉素抗生素的非荧光DMEM培养基培养哺乳动物U2OS细胞。 
	注意：细胞也可在含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素抗生素的DMEM培养基中培养，但在成像前需更换为无自发荧光的溶液。</li>
	<li>将细胞在8孔板的单个孔中以1:5的比例于70-80%汇合度时进行传代。成像前在8孔板中培养细胞12至24小时。</li>
	<li>加入 BODIPY-C12，LysoTracker Green 或任何其他 BODIPY 偶联物，终浓度为 100&#8201;nM（二甲基亚砜 [DMSO] 中的储备液）10&#8201;成像前至少 10 分钟。该时间可根据具体实验需求进行调整。 
	注意：成像可在室温（23 &#176;C）使用活细胞成像溶液。然而，在37 &#176;C 和 5% CO2 使用不含荧光的DMEM培养基，混合10%胎牛血清、4 mM谷氨酰胺、1 mM丙酮酸钠和1%青霉素-链霉素抗生素，更有利于维持细胞接近生理状态，从而得出可靠的生物学结论。</li>
</ol>
3. 仪器准备
<ol>
	<li>根据所用 BODIPY 的发射光颜色，在发射光路中安装相应的滤光片组。 
	注意：四频带二向色镜（zt/405/488/561/640rdc）首先将激发光与发射光分离。绿色发射光（525 nm）和红色发射光（595 nm）随后由长通二向色分光镜（T562lpxr）分束，再分别通过绿色通道的带通滤光片 ET525/50 和红色通道的带通滤光片 ET595/50。两个通道随后投射到同一相机芯片的不同区域。类似地，红色发射光（595 nm）和远红发射光首先由长通二向色分光镜（FF652-Di01）分束，再分别通过红色通道的带通滤光片 ET610/75 和远红通道的带通滤光片 FF731/137。</li>
	<li>开启显微镜、显微镜载物台、激光器（488 nm、561 nm）和相机。此处使用配备完美聚焦系统且 EMCCD 相机冷却至 -68 °C 的倒置显微镜。</li>
	<li>在显微镜物镜上滴加一滴浸油。</li>
	<li>打开控制明场成像 LED 光源、激光功率、激光快门和相机成像设置的 Hal4000 软件（见材料表）。将 EMCCD 增益设为 30，相机温度设为 -68 °C。准备相机及相应软件以 20 Hz 的频率记录视频。 
	注意：该技术适用于任何能够进行光激活定位显微（PALM）和随机光学重建显微（STORM）成像的宽场显微镜。相应的软件可能有所不同。</li>
	<li>开启显微镜载物台加热器，并将其温度设为 37 °C，CO2 浓度设为 5%。相应调整物镜的校正环。</li>
	<li>将样品安装在显微镜载物台上并调焦，直至聚焦系统启动。使用载物台控制器移动载物台，直到视野中出现状态良好的细胞。 
	注意：在室温下对酵母细胞进行成像时，无需开启加热器或&#160;CO2 控制。</li>
	<li>开启用于激发单体和二聚体的相应激光器。对于 BODIPY 绿色染料或 LysoTracker 绿色染料，使用 561 nm 激光激发 SMLM 所需的 DII 态，同时使用 488 nm 激光激发单体以进行常规荧光成像。 
	注意：对于 BODIPY 红色染料，使用 640 nm 激光激发 SMLM 所需的 DII 态，使用 561 nm 激光激发单体以进行常规荧光成像。对于 BODIPY 红色染料，需调节 561 nm 和 640 nm 激光功率，以便在红色通道中观察到整体荧光信号，在远红通道中观察到单分子爆发信号。561 nm 激光的典型功率约为 0.06 W/cm2，640 nm 激光约为 5 kW/cm2。对于 BODIPY 绿色染料，在 561 nm 激发下也可在绿色发射通道中观察到常规荧光信号。对于 BODIPY 红色染料，在 640 nm 激发下可在红色通道中观察到常规荧光信号。该信号来源于反斯托克斯发射，在连续激光激发下可用于单体/二聚体共定位成像。</li>
</ol>
4. 数据采集
<ol>
	<li>加载用于激发单体以及二聚体的激光快门序列。 
	注意：我们通常使用九个在 561 nm&#160;下的单分子激发帧，后接一个在 488 nm 下的常规激发帧。这种方法可提供更亮的常规荧光信号，并避免在多色成像应用中，其他可被 488 nm 激发的荧光染料（如绿色荧光蛋白，GFP）信号泄漏到红色单分子检测通道中。或者，也可持续开启 561 nm 激光，并利用反斯托克斯发射在较短波长通道中获取常规图像。</li>
	<li>调节激光功率，使得在 561 nm 激发下于红移发射通道中检测到单分子荧光爆发信号，而在 488 nm 激发下于绿色发射通道中出现常规荧光信号。进行 SMLM 时，561 nm 激光的典型功率约为 0.8–1 kW/cm2，而在常规荧光成像模式下，488 nm 激光的功率通常为 0.035–0.07 W/cm2。</li>
	<li>选择用于保存视频的目录，并采集 5,000–20,000 帧图像，以获得足够数量的定位点用于重构超分辨率图像。</li>
	<li>切换至不同的视野，重复上述步骤，以从更多细胞中收集数据。</li>
</ol>
5. 数据分析与单分子示踪
<ol>
	<li>将视频载入单分子定位显微镜分析软件。 
	注意：任何软件18 可以使用。我们使用 INSIGHT（参见 材料表）并使用 ThunderSTORM 对结果进行交叉验证19 ImageJ（Fiji）插件</li>
	<li>目视检查影片并调整对比度设置，以使单分子荧光清晰可见&#160;闪烁现象可见。如有需要，当样品部分区域持续荧光时，可限制用于SMLM数据分析的区域或帧范围。</li>
	<li>设置单分子识别参数，使用二维高斯点扩散函数（PSF）进行拟合（感兴趣区域：7 × 7 像素，像素大小 160 nm，宽度 260–650 nm，高度 &#62; 50 个光子）。通过目视检查一些示例帧，以验证识别参数并可靠地检测出明显的单分子荧光信号&#160;闪烁（参见 图1C). 
	注意：可略微调整某些识别参数（如高度和宽度），以优化对视觉可辨的单分子荧光信号的识别。</li>
	<li>使用优化后的识别参数进行SMLM图像分析，然后将每个单分子渲染为二维高斯函数，其宽度由检测到的光子数的平方根的倒数加权。</li>
	<li>评估数据质量。使用限定的帧范围来观察更特定时间点的单分子分布，以校正数据采集过程中细胞器的移动。</li>
	<li>为了进一步分析分子分布的空间分布特征与动态行为，导出包含坐标、出现的帧数、光子数、宽度和高度的分子列表&#160;定位点。将分子列表导入自定义编写的分析程序中。</li>
	<li>为获取单分子分布的空间信息，计算径向分布函数 &#961;(r)，表示为径向距离函数的定位点密度20. 为了获得 &#961;(r)，计算所有定位点之间唯一的成对距离，以 r 为中心构建直方图i 高度为 H(ri）并以宽度 dr 进行划分，再除以 2&#960;ridr；（&#961;(ri) = H(ri)/&#960;(ri+dr2- ri2然后可利用径向分布函数来量化并比较聚类程度以及簇的特征尺寸。</li>
	<li>为获得分子扩散的动态信息，可将例如在3像素（0.48 &#181;m) 在连续的数据采集帧中生成单分子轨迹。 
	注意：连接距离将取决于分子的扩散速度和定位点的密度。最大连接距离可通过分析每帧中定位点的密度来估算。21,22. 平均密度确定为每 &#181;m2；因此为0.48 &#181;m 半径范围内的密度足够低，以确保不同的分子不会相互连接。</li>
	<li>对不同滞后时间的位移取平均值 &#916;来自持续时间至少为三个滞后时间的多条轨迹，以生成均方位移（MSD）与 &#916;t 曲线。拟合 MSD 与 t 的关系 &#916;t 曲线，其方程为 MSD = 4D&#916;t + &#963;2 计算平均扩散系数 D3.</li>
</ol>

<ol><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).</li>
<li>Wu, C. -Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+therapeutic+T+cells+through+a+small+molecule-gated+chimeric+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor.</a> Science. 350 (6258), New York, N.Y. 4077(2015).</li>
<li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angewandte Chemie. 47 (33), International Ed. in English 6172-6176 (2008).</li>
<li>Cordes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+single-molecule+assembled+patterns+with+superresolution+blink-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy.</a> Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).</li>
<li>Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Localization+Microscopy+with+the+Fluorescence-Activating+and+Absorption-Shifting+Tag+%28FAST%29+System%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System.</a> ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).</li>
<li>Yan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+microscopy+using+noncovalent+fluorogen+activation+by+genetically+encoded+fluorogen-activating+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%3A+A%3A+European+Journal+of+Chemical+Physics+and+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins.</a> Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li>
<li>Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+localization+microscopy+and+tracking+with+red-shifted+states+of+conventional+BODIPY+conjugates+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li>
<li>Bergström, F., Mikhalyov, I., Hägglöf, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimers+of+dipyrrometheneboron+difluoride+%28BODIPY%29+with+light+spectroscopic+applications+in+chemistry+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).</li>
<li>Bröring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bis%28BF2%29-2%2C2%27-bidipyrrins+%28BisBODIPYs%29%3A+highly+fluorescent+BODIPY+dimers+with+large+stokes+shifts%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%28Weinheim+an+Der+Bergstrasse%2C+Germany%29%22%5BJournal%5D)">Bis(BF2)-2,2'-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts.</a> Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).</li>
<li>Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergström, F., Johansson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+ground+and+excited+state+properties+of+dipyrrometheneboron+difluoride+%28BODIPY%29%3A+Dimers+with+application+to+biosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Chemistry+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).</li>
<li>Pagano, R. E., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+BODIPY-labeled+sphingolipids+to+study+membrane+traffic+along+the+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).</li>
<li>Bergström, F., Hägglöf, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+site-directed+fluorophore+labeling+and+donor-donor+energy+migration+to+investigate+solution+structure+and+dynamics+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).</li>
<li>Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BODIPY-based+probes+for+the+fluorescence+imaging+of+biomolecules+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells.</a> Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).</li>
<li>Rocha, J. M., Gahlmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Tracking+Microscopy+-+A+Tool+for+Determining+the+Diffusive+States+of+Cytosolic+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).</li>
<li>Sage, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fight+club%3A+assessment+of+2D+and+3D+single-molecule+localization+microscopy+software%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software.</a> Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).</li>
<li>Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ThunderSTORM%3A+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), Oxford, England. 2389-2390 (2014).</li>
<li>Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+molecules+in+single+organelles+with+superresolution+microscopy+allows+tracking+of+the+endosome+maturation+trajectory%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).</li>
<li>Shim, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li>
<li>Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+model-based+analysis+of+single-particle+tracking+experiments+with+Spot-On%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+microscopy+with+novel+BODIPY-based+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores.</a> PLoS ONE. 13 (10), (2018).</li>
<li>Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Photoactivatable+BODIPY+Probe+for+Localization-Based+Super-Resolution+Cellular+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).</li>
<li>Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+phototoxicity+in+live+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 14 (7), (2017).</li>
<li>Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348(2015).</li>
<li>Grimm, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+to+fine-tune+fluorophores+for+live-cell+and+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging.</a> Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).</li>
</ol>

作者声明无竞争利益。

在本实验方案中，我们展示了如何利用传统的BODIPY偶联物获得空间分辨率提高一个数量级的单分子定位显微成像（SMLM）图像。该方法基于利用先前报道的、通过双分子相互作用瞬时形成的传统BODIPY染料的红移DII态。这些状态可通过红移波长进行特异性激发和检测，且其稀疏性和短暂性足以满足SMLM的要求。通过调节BODIPY单体的浓度以及激光参数，可实现最佳的定位密度和信噪比。我们在营养充足和饥饿条件下，以约30 nm的分辨率（基于理论Thompson公式）解析了活酵母细胞内脂肪酸类似物和中性脂质的分布与运动特性。我们还发现，在20 Hz的数据采集条件下，约40%的BODIPY DII态可持续存在两个或更多成像帧，从而实现了单分子追踪，可用于量化不同条件下的分子运动性。我们的结果揭示了饥饿状态下BODIPY-FAs在定位和运动性方面的差异，并提示了一种对抗脂毒性损伤的保护机制。我们能够追踪单个BODIPY分子，并在不同代谢状态下突破光学衍射极限，解析脂滴（LDs）和BODIPY-FA&#160;点状结构的尺寸，这只有通过开发传统BODIPY偶联物的SMLM能力才能实现。脂肪酸分布与摄取过程中涉及的精...

单分子定位显微技术（SMLM），如随机光学重建显微技术（STORM）和光激活定位显微技术（PALM），已成为能够生成超越阿贝光学衍射极限信息的超分辨率图像的方法1,2 以及用于追踪单个生物分子的动力学行为3,4单分子定位显微镜（SMLM）兼容探针的要求之一是能够在任意时刻控制活性荧光分子的数量，以避免其点扩散函数（PSF）在空间上重叠。在数千个数据采集帧中的每一帧中，通过拟合各个荧光分子对应的点扩散函数，可将其位置以约20 nm的精度确定。传统上，荧光分子的开关闪烁行为通过随机光致切换进行控制。1,2,5 或化学诱导的内在闪烁6其他方法包括荧光原在短暂结合荧光原激活蛋白后被诱导激活7,8 以及在全内反射荧光（TIRF）或光片激发下标记DNA寡核苷酸的可编程结合-解离9最近，我们报道了一种用于单分子定位显微镜（SMLM）的新型且通用的标记策略10 其中先前报道的红移二聚体（DII传统硼二吡咯亚甲基（BODIPY）缀合物的激发态与基态11,12,13 短暂形成，并可使用红移波长进行特异性激发和检测。
BODIPY 是一类广泛应用的染料，拥有数百种变体，可特异性地标记亚细胞区室和生物分子14,15,16。由于其使用简便且适用于活细胞，BODIPY 变体已作为商品化试剂用于常规荧光显微镜。本文详细介绍并优化了一种实验方案，用于在活细胞单分子定位显微镜（SMLM）中使用数百种市售的 BODIPY 偶联物。通过调节 BODIPY 单体的浓度，并优化激发激光功率、成像及数据分析参数，可在活细胞中获得高质量的超分辨率图像和单分子追踪数据。在低浓度（25–100 nM）下使用时，BODIPY 偶联物可同时用于红移通道的 SMLM 成像，以及常规发射通道的共定位常规荧光&#160;显微镜成像。所获得的单分子数据可用于量化静态结构的空间分布，并解析活细胞中分子的扩散状态17。BODIPY 探针同时具有绿色和红色形式，当与其他兼容的荧光染料合理组合使用时，可实现多色成像。
本报告中，我们提供了一种优化的多色活细胞单分子定位显微镜（SMLM）数据采集与分析方案，该方案使用 BODIPY-C12、BODIPY (493/503)、BODIPY-C12 red 和 LysoTracker-Green 实现。我们以约 30 nm 的分辨率在活体酵母和哺乳动物细胞中解析了脂肪酸和中性脂质的分布。进一步研究表明，酵母细胞&#160;会根据其代谢状态调控外源添加脂肪酸的空间分布。我们发现，在营养充足条件下，外源添加的 BODIPY 标记脂肪酸（FA）主要定位于内质网（ER）和脂滴（LDs）；而在饥饿条件下，BODIPY-FAs 则在质膜上形成非脂滴簇状结构。我们还将该技术的应用拓展至活体哺乳动物细胞中溶酶体与脂滴的成像。本研究所优化的基于常规 BODIPY 偶联物的 SMLM 实验方案，可为利用大量可用的 BODIPY 偶联物在纳米尺度上研究生物学过程提供有力工具。

<table><tbody><tr><td>BODIPY C12</td><td>ThermoFisher</td><td>D3822</td><td>绿色脂肪酸类似物</td></tr><tr><td>BODIPY C12 Red</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>D3835</td><td>红色脂肪酸类似物</td></tr><tr><td>BODIPY(493/503)</td><td>ThermoFisher</td><td>D3922</td><td>中性脂质标记物</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2010</td><td>细胞在玻璃表面的固定</td></tr><tr><td>无氮碱基完全培养基混合物</td><td>US Biological</td><td>D9515</td><td>用于SCD的氨基酸</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>SCD的碳源</td></tr><tr><td>八孔板</td><td>Cellvis</td><td>C8-1.58-N</td><td>带腔盖玻片</td></tr><tr><td>八孔，Lb-Tek II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>带腔室的盖玻片</td></tr><tr><td>ET525/50</td><td>染色</td><td></td><td>带通滤光片</td></tr><tr><td>ET595/50</td><td>色度</td><td></td><td>带通滤光片</td></tr><tr><td>ET610/75</td><td>色度</td><td></td><td>带通滤光片</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td>血清</td></tr><tr><td>FF652</td><td>Semrock</td><td></td><td>分束器</td></tr><tr><td>FF731/137</td><td>Semrock</td><td></td><td>带通滤光片</td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>A1896701</td><td>细胞培养基</td></tr><tr><td>Hal4000</td><td>庄实验室，哈佛大学</td><td></td><td>数据采集软件</td></tr><tr><td>Ixon89Ultra DU-897U</td><td>Andor</td><td></td><td>用于光子探测的EMCCD相机</td></tr><tr><td>激光 405、488、561、640 nm</td><td>CW-OBIS</td><td></td><td>用于激发的激光器</td></tr><tr><td>Insight3</td><td>庄实验室，哈佛大学</td><td></td><td>单分子定位软件</td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>细胞培养所需氨基酸</td></tr><tr><td>活细胞成像溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A14291DJ</td><td>成像缓冲液</td></tr><tr><td>Lysotracker Green</td><td>ThermoFisher</td><td>L7526</td><td>基于Bodipy的溶酶体标记物</td></tr><tr><td>哺乳动物 ATCC U2OS 细胞（Manassas, VA）</td><td>Dr. Jochen Mueller（明尼苏达大学）</td><td></td><td></td></tr><tr><td>尼康-CFI Apo 100 1.49 数值孔径</td><td>尼康</td><td></td><td>油浸物镜</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>抗生素</td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>细胞培养补充剂</td></tr><tr><td>T562lpxr</td><td>染色</td><td></td><td>分束器</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>贴壁细胞的解离</td></tr><tr><td>W303 MATa 菌株</td><td>Horizon-Dharmacon</td><td>YSC1058</td><td>亲本酵母菌株</td></tr><tr><td>酵母氮源基础培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1250</td><td>不含氨基酸的氮源基础培养基</td></tr><tr><td>zt405/488/561/640rdc</td><td>染色</td><td></td><td>四波段二向色镜</td></tr></tbody></table>

用于活细胞超分辨率显微镜和单分子示踪的传统bodipy缀合物

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

单分子定位显微技术（SMLM）突破了传统荧光显微镜的光学衍射极限，能够以约20 nm的精度解析细胞内结构及生物分子的动力学行为。SMLM的前提是使用能够在暗态与荧光态之间转换的荧光染料，以避免在数千帧数据采集过程中其点扩散函数在时空上的重叠。BODIPY类染料是已被广泛使用的荧光染料，其多种偶联物常用于传统显微成像。BODIPY基态二聚体（DII）的瞬时形成可产生明亮的单分子发射，从而实现单分子定位显微（SMLM）。本文介绍一种简单且通用的实验方案，可在活酵母细胞和哺乳动物细胞中利用常规BODIPY偶联物进行SMLM成像。该方法可用于获取超分辨率图像，并追踪单个BODIPY-DII状态，以提取BODIPY偶联物的时空信息。我们应用此方法在纳米尺度上解析了活体酵母和哺乳动物细胞中的脂滴（LDs）、脂肪酸和溶酶体的结构。此外，我们展示了BODIPY染料与其他荧光&#160;探针联用时的多色成像能力。代表性结果揭示了在喂养与饥饿条件下，酵母细胞中BODIPY标记的脂肪酸与中性脂质在空间分布和运动性上的差异。本优化的SMLM实验方案可兼容数百种市售的BODIPY偶联物，为研究超越本研究应用范围的多种纳米级生物学过程提供了有力工具。&#160;

本文基于上述方案，展示了利用 BODIPY 偶联物进行单分子定位显微镜（SMLM）的优化样品制备、数据采集与分析流程（图 1A）。为演示 SMLM 数据采集与分析的工作流程示例，我们在酵母中使用 BODIPY（493/503）实现对光学衍射极限以下脂滴（LDs）的分辨（图 1B-F）。图 2 展示了 BODIPY 与其他探针（如 GFP、mEos2）联用时不同多色成像模式的示例。我们通过在相同培养基中培养约 48 小时以调控酵母的代谢状态，并显示在饥饿条件下，BODIPY-C12 在细胞周边形成非脂滴来源的不动簇，而在营养充足条件下则被整合进脂滴中（图 3）。为进一步拓展 BODIPY 偶联物在哺乳动物细胞中的 SMLM 应用能力，我们在活的 U2OS 细胞中对 BODIPY-C12 与 LysoTracker-green 进行成像（<strong class="xf...

传统的BODIPY偶联物可通过利用其瞬时形成的、红移的基态二聚体，用于活细胞单分子定位显微镜（SMLM）成像。本文提供了一种优化的SMLM实验方案，可在纳米尺度上对活体哺乳动物细胞和酵母细胞内的亚细胞中性脂质和脂肪酸进行追踪与高分辨率成像。

用于活细胞超分辨率显微镜和单分子示踪的传统BODIPY缀合物

单分子定位显微镜（SMLM）技术突破了传统荧光显微镜的光学衍射极限，能够实现……

本方案描述了利用常规BODIPY染料的稀疏、红移状态进行超分辨率显微成像的方法。该方法使我们能够以30纳米的分辨率研究活细胞中的细胞器和生物分子。此技术的优势在于操作简便，且可利用多种现有的BODIPY偶联物，从而提供持久的单分子信号来源。我们所展示的应用可能有助于深入理解脂肪肝疾病或2型糖尿病等疾病，其通过突破衍射极限来解析脂滴和脂肪酸。我们获得了关于酵母和哺乳动物细胞中脂肪酸及脂滴生物学的深入认识。然而，该技术同样适用于所有其他具有低背景荧光的透明细胞类型。首次使用该技术时，务必优化二价离子浓度和激光功率，以观察到明亮的单分子信号。直观演示该技术对于理解二价离子浓度及激光功率优化如何产生明亮的单分子信号至关重要。将哺乳动物U2OS细胞培养于不含荧光物质的DMBM培养基中，培养基中需添加10%胎牛血清、4毫摩尔谷氨酰胺、1毫摩尔丙酮酸钠以及1%青霉素-链霉素抗生素，使用T-25培养瓶进行培养。当细胞融合度达到70%至80%时，按1:1至1:5的比例进行传代，并接种至8孔板的单个孔中。将8孔板中的细胞培养12至24小时。成像前10分钟，加入100 nmol/L终浓度的BODIPY-C12溶酶体绿色荧光探针或其他BODIPY偶联物。根据所用BODIPY的发射光颜色，在发射光路中安装适当的滤光片组。打开显微镜，开启显微镜载物台、488纳米和561纳米激光器以及相机。在显微镜物镜上滴加一滴浸油。打开用于控制明场成像LED光源、激光功率、激光快门以及成像相机设置的HAL4000软件。将EMCCD增益设为30，相机温度设为-68摄氏度。准备相机及相应软件，以每秒20帧的速率录制视频。打开显微镜载物台加热器，并将其温度设置为37摄氏度，二氧化碳浓度设置为5%。相应调整物镜的色差校正。将样品安装在显微镜载物台上并调焦，直至对焦系统启动。使用载物台控制器移动载物台，直到视野中出现健康的细胞。加载用于激发单体（monumus）以及二聚体（dimers）的激光快门序列，设置561纳米激光器的激光功率为821千瓦每平方厘米，用于单分子定位显微镜成像，从而在红移发射通道中检测单分子荧光信号。将488纳米激光器的激光功率调节至0.35至0.7瓦特每平方厘米之间，使常规荧光出现在绿色发射通道中。为视频选择目标文件夹，并采集5000至20000帧图像，以获得足够的定位点用于重构超分辨率图像。移动至不同的视野并重复该过程，以收集更多细胞的数据。将视频载入单分子定位显微镜分析软件中。通过肉眼观察视频并调整对比度设置，使单分子荧光闪烁信号可见。设置单分子识别参数，用于拟合二维高斯点扩散函数（PSFs）。通过目视检查若干示例帧来评估识别参数，并可靠地检测出明显的单分子荧光爆发信号。按下“分析”按钮，使用优化后的识别参数进行单分子定位显微成像分析。随后，将每个单分子渲染为一个二维高斯函数，其宽度由所检测到的光子数的平方根的倒数加权。评估数据质量。使用限定的帧范围来观察更特定时间点的单分子分布情况，以校正数据采集过程中细胞器的移动。本研究中，我们介绍了一种利用BODIPY偶联物进行单分子定位显微镜成像的优化样品制备、数据采集与分析流程。为展示单分子定位显微镜数据获取与分析的工作流程示例，采用酵母中的BODIPY实现对光学衍射极限以下脂滴的分辨。本文还展示了BODIPY与其他探针（如GFP和mEos2）联用时不同多色成像模式的示例。禁食条件下，BODIPY-C12 在细胞周边形成可移动的非脂滴簇，而在进食条件下则被整合至脂滴中。为了进一步拓展 BODIPY 偶联物在哺乳动物细胞中的单分子定位显微镜成像能力，研究人员对活 U2OS 细胞中的 BODIPY-C12 和 Lysotracker Green 进行了成像。优化 BODIPY 的浓度以及激光激发功率是观察明亮单分子信号并重建超分辨率图像的关键步骤。该方法可与任何其他BODIPY偶联物联用，以高分辨率揭示活细胞内特定生物分子在时空分布上的精细特征。我们的技术为在纳米尺度上进一步探究脂滴和脂肪酸生物学奠定了基础。然而，由于存在多种功能化的BODIPY偶联物，该应用范围远不止于特定的生物学过程。请务必遵守生物样本和染料处理的标准操作规程，同时作为我们的义务对冲者，遵守激光安全操作规程。

conventional-bodipy-conjugates-for-live-cell-super-resolution

Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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细菌分裂机器的超分辨率成像

我们展示了如何利用荧光光激活定位显微技术（FPALM）同时对细胞内多种荧光标记的分子 进行成像。所述技术可在单个细胞内实现数千至数十万个荧光标记蛋白的定位，精密度达到数十纳米 。...

同时多色成像生物结构的荧光光激活定位显微技术

通过将双分子荧光互补（BiFC）与光激活定位显微镜（PALM）相结合，可在细胞中以纳米级空间分辨率可视化蛋白质-蛋白质相互作用。本文描述了在U2OS细胞中利用BiFC-PALM成像Ras-Raf相互作用，以观察单个Ras-Raf复合物的纳米级簇集和扩散行为。...

双分子荧光互补结合光激活定位显微技术（BiFC-PALM）

本文介绍了一种干涉光激活定位显微镜（iPALM）的技术方案，该方法是一种基于单分子定位的三维超分辨率显微成像技术，用于贴壁哺乳动物细胞中肌动蛋白细胞骨架的成像。该技术能够通过光学手段实现纳米尺度结构特征的可视化，而这些结构在传统受衍射极限限制的光学显微镜下无法分辨。...

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近期，我们绘制了活细胞中各种蛋白质在初级纤毛内转运的三维（3D）空间路径。本文详细描述了应用于活体初级纤毛的新型3D超分辨率荧光成像技术的实验装置、生物样本处理过程以及数据分析方法。...

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三维单分子定位显微技术被用于研究活体细菌细胞中荧光标记蛋白的空间位置和运动轨迹。本文所述的实验与数据分析方案基于整合的单分子轨迹，确定胞质蛋白的主要扩散行为。...

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全细胞超分辨率成像 通过 使用光学光子重分配的旋转盘共聚焦显微镜进行DNA-PAINT成像

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